团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用，本发明采用分群分离法，实现分子标记与性状的关联分析，最终筛选出两个与生长性状显著相关的分子标记，Mam116的引物为F:5’-CTATTTACAGTTTCATGCTTTCCTC-3’，R:5’-ATCCCGTCCGCCGCTTACT-3’；Mam166的引物为F:5’-GGTACTGTTTGTGCTGGGC-3’，R:5’-CTGCTCACTCAACTTATTGTAGGTC-3’。本发明对这两个标记进行不同基因型性状的多重比较，以确定劣势和优势等位基因，在团头鲂性状相关育种中选择含有正效基因型的个体作为选育亲本，避开含有负效基因型的个体，可减小实验工作量，加快育种效率。
【专利说明】团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类分子标记辅助选育技术，具体涉及与团头鲂生长性状相关的微卫 星分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 团头妨（MegalobramaamblycephalaYih, 1955)，又名武昌鱼，隶属于硬骨鱼纲， 鲤形目，鲤科，鲂属，其自然分布仅局限于长江中下游少数几个湖泊中。因其味道鲜美、食性 广、生长快、易捕捞而广受消费者与养殖者喜爱。由于团头鲂鱼种生产中普遍存在近亲繁殖 的现象导致种质退化加剧常规苗种的生长速较慢。虽然我国已经选育出了生长过那速度较 快的团头鲂浦江1号，但苗种仍不能满足市场需求。还有待进一步加强团头鲂种质资源监 测、评估与保护，选育出生长快、抗逆性好的团头鲂优良品种（王卫民，2009)。
[0003] 鱼类的生长性状为数量性状，为多个基因控制，这些基因在染色体上占据一定的 区域，称为数量性状位点（QuantitativeTraitLocus)。一个数量性状的QTL并不是很多， 存在着主效基因（李宁，1997)。这些QTL的一个或两个主效基因就能反映一个数量性状表 型变异的10% -50%以上。因此我们可以通过找到控制这些性状的基因或者标记，对鱼类 的经济性状进行遗传改良。微卫星DNA，又称简单串联重复序列（simplesequencerepeat, SSR)，是由2?6个碱基为基本单元多次串联重复的核苷酸序列，广泛分布于真核生物的基 因组中（Hamadaetal.，1982)，由于其具有共显性遗传、检测方便、多态信息含量高等优 点，被广泛应用于水产动物群体遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建、QTL定位和标记辅助 选择育种等方面（孙效文，2004;Liaoetal.，2009)。张义凤等（2008)利用来自遗传连锁 图谱和已发表的的47对微卫星引物对柏氏鲤和荷包红鲤抗寒品系自F2代进行体重、体长 和体高进行了相关性分析，结果找到7个与生长性状相关的位点，并找到3种性状相关的基 因型。刘贤德等（2013)筛选到2个与大黄鱼生长性状紧密相关的微卫星标记及其相应的 优势基因型。
[0004] 常规的选育是根据性状的表型而不是基因型进行选择，对目标性状缺乏预选手 段，育种周期长、效率低。现代分子生物学技术的发展使根据与性状相关的基因或分子标记 进行选择成为可能。目前尚未见团头鲂生长性状相关分子标记的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记Mamll6和 Maml66，Mamll6 的引物为F:CTATTTACAGTTTCATGCTTTCCTC，R:ATCCCGTCCGCCGCTTACT; Maml66 的引物为F:GGTACTGITTGTGCTGGGC，R:CTGCTCACTCAACTTAITGTAGGTC;该分子标记为 团头鲂生长性状的QTL定位和分子标记辅助育种工作奠定基础。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记在团 头鲂分子辅助育种中的应用，即基于分子标记的优势等位基因筛选生长性状优良的个体。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记，通过以下步骤筛选得到：
[0009] (1)2009年6月，对来自梁子湖、淤泥湖、鄱阳湖的42尾母本，50尾父本进行人工 繁殖，繁殖子代在同一池塘中进行养殖。2011年3月随机打捞池塘中的团头鲂F1代进行编 号，测量体长、体高和体重。按照体重数据，选择体重大于〇. 4kg的个体记为大个体组（Top) 与体重小于〇. 28kg的个体记为小个体组（Below)，各96尾；
[0010] (2)剪取步骤（1)的团头鲂F1代实验个体的鳍条组织，采用醋酸铵法提取鳍条组 织的基因组DNA做为模板，选用17对微卫星引物对微卫星位点进行PCR扩增；
[0011] (3)团头鲂F1代个体在17个微卫星位点的PCR产物经过8 % (W/V)非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色方法检测位点的多态性，利用P〇pGene(Version3.2)软 件统计各微卫星位点的等位基因数（numberofalleles，Na)和观测杂合度（Observed heterozygosity,Ho)。利用SAS软件中的GLM-般线性模型对团头鲂生长性状与微卫星位 点的关联性进行最小二乘分析，对同一标记基因型之间生产性状指标差异显著性进行检验 并进行多重比较；
[0012] (4)通过一般线性模型对团头鲂的生长性状与17对微卫星标记进行相关性分析， 结果发现17个微卫星位点中，位点Mamll6、Maml66均与体长、体重、体高均表现出显著相关 (P<0. 05)；
[0013] (5)对2个位点的基因型进行多重比较分析，确定优势和劣势等位基因，最终确定 Mamll6的优势基因型为172/176、154/176、176/176和176/182 ;Maml66的优势基因型为 129/129、123/123、123/129 和 123/135。
[0014] 团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记在团头鲂分子辅助育种中的应用，应用过 程为：分析个体的基因型，通过是否含有Mamll6位点和Maml66位点的优势基因型来判断个 体是否为生长性状优良的个体，从而选择来做亲本。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0016] (1)本发明采用分群分离法，从同批繁殖，同塘饲养的团头鲂中以体重为标准，选 择了体重大于0. 4kg的个体与体重小于0. 28kg的个体各96尾进行分析，从而实现分子标 记与性状的关联分析。
[0017] (2)本发明加大了大个体组和小个体组的样本容量，以期能够更加快速精确地获 得与性状相关的标记。
[0018] (3)本发明对2个与体长、体重、体高存在极显著差异的标记进行不同基因型性状 的多重比较，在一定程度上减小了实验工作量，同时节省了一定的人力、物力、财力。
[0019] (4)本发明对2个标记进行不同基因型性状的多重比较，以确定劣势和优势等位 基因，最终运用标记辅助选择，在实践过程中可尽量选择含有正效基因型的个体作为选育 亲本，避开含有负效基因型的个体。
【具体实施方式】
[0020] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
[0021] 实施例1 :
[0022] 与团头鲂生长性状相关微卫星标记的筛选：
[0023](1)材料来源
[0024] 2009年6月，对来自梁子湖、淤泥湖、鄱阳湖的42尾母本，50尾父本进行人工繁 殖，繁殖子代在同一池塘中进行养殖。2011年3月随机打捞池塘中的团头鲂F1代，编号， 测量体长、体高和体重数据，剪取鳍条保存于100%酒精中备用。按照体重数据，选择体重 大于0. 4kg的个体，记为大个体组（Top)，体重小于0. 28kg的个体各96尾，记为小个体组 (Below)，作为实验对象进行微卫星基因型分析；同时将每个组的60尾个体作为与团头鲂 生长性状相关微卫星位点初步筛选的大小群体，将每个组另外36个个体作为与团头鲂生 长性状相关联微卫星位点验证的大小群体。
[0025] (2)微卫星引物
[0026] 本发明中17对微卫星引物为表1所示，引物均由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。
[0027] 表1本发明中17对微卫星引物信息
[0028]
【权利要求】
1. 团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记的引物，Mamll6 : F: 5' - CTATTTACAGTTTCATGCTTTCCTC -3' R: 5' - ATCCCGTCCGCCGCTTACT -3'。
2. 团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记的引物，Maml66 : F: 5' - GGTACTGTTTGTGCTGGGC -3' R: 5' - CTGCTCACTCAACTTATTGTAGGTC -3'。
3. 权利要求1或2所述的分子标记的引物在团头鲂生长性状相关育种方面的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，所述的生长性状为体长性状。
5. 根据权利要求3所述的应用，所述的生长性状为体重性状。
6. 根据权利要求3所述的应用，所述的生长性状为体高性状。
【文档编号】C12Q1/68GK104328119SQ201410654344
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】高泽霞, 王卫民, 陈柏湘, 刘肖莲, 赵鸿昊, 万世明, 罗伟 申请人:华中农业大学, 湖北百容水产良种有限公司