一种半月板组织来源的间充质干细胞及其制备方法和鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种半月板组织来源的间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)取半月板组织，剪成组织碎块，用包含I型胶原酶和II型胶原酶的混合胶原酶溶液消化4～6h；(2)终止消化，用100～400目筛网过滤，1000～2000rpm离心4～10min，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37℃、5％CO2条件下培养，2～3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3天换液一次，在细胞融合度为80％～90％时收获细胞，即可。本发明分离得到的间充质干细胞，综合半月板细胞的稳定表型和间充质干细胞“干性”特征两者的优点，其分化确切，生物活性优良，是未来半月板再生及其转化医学研究中较为理想的一种种子细胞来源，临床应用前景良好。
【专利说明】一种半月板组织来源的间充质干细胞及其制备方法和鉴定
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种半月板组织来源的间充质干细胞及其制备方法和鉴定。
【背景技术】
[0002]半月板在维持膝关节稳态方面发挥非常重要的生物力学和生物化学功能，包括吸收震荡、传递载荷、稳定关节、分散应力及发挥膝关节的本体感觉等。半月板损伤是临床上非常常见的与运动和年龄相关的病变。解剖结构的损伤将导致关节退变和骨关节炎的发生，并伴有不同程度的关节功能障碍。半月板损伤后的治疗一直是骨科及运动医学基础研究和临床实践面临的难题。目前临床针对半月板损伤的处理手段大体包括半月板切除、缝合修复、重建三个方面。半月板部分或全部切除都将导致膝关节不稳，继而出现逐渐进展的关节退变。临床上采用缝合修复的指征也相当有限，仅适用于一些单一纵裂的新鲜损伤类型。尽管同种异体半月板移植被认为是半月板缺损或切除后治疗的金标准，但长期的随访及组织学结果显示仅有表浅部位少量的宿主细胞长入，再者供体来源不足、组织处理及保存技术、半月板大小的匹配、手术固定技术以及半月板组织存活的细胞分子研究极大地限制其进一步的临床应用。
[0003]种子细胞为基础的组织工程及再生医学策略为半月板的生物学再生带来新的希望。目前用于半月板再生的种子细胞主要分为分化成熟的半月板细胞和间充质干细胞。
[0004]终末分化成熟的自体半月板细胞来源于损伤的半月板组织，其来源于自体及确切的半月板细胞表型特征，一直被认为是半月板再生最理想的种子细胞；但是其作为种子细胞也存在一些问题:需要两次手术、病变组织来源的半月板细胞数量非常有限、且缺乏增殖能力和正常半月板细胞的生物活性等。
[0005]中胚层来源的成体间充质干细胞因其来源广泛、优良的自我更新、多向分化潜能、免疫调节、定向归巢以及无伦理道德方面争议等优点被广泛用于半月板再生医学领域。在体内外适当的条件下，间充质干细胞能分化为中胚层、甚至内外胚层的组织细胞。但是，另一方面，间充质干细胞在体外培养扩增过程中可能出现转化、衰老或凋亡现象，常伴随细胞增殖能力和分化潜能的下降，逐渐失去其“干性”特点。再者，间充质干细胞最传统经典的来源是骨髓，但其含量非常低(仅占有核细胞的0.01%?0.001% )，且存在供区并发症等缺点。因此开发其他来源的间充质干细胞用于半月板的修复重建非常有意义。尽管目前有很多其他组织，如脂肪或滑膜组织等来源间充质干细胞用于半月板再生的种子细胞的报道，但是这些组织来源间充质干细胞最大的缺点是其分化为半月板细胞的不确切性，导致修复效果不佳。
[0006]综上，目前用于半月板组织修复的种子细胞要么“干性”不足，要么难以有效分化为半月板细胞，导致修复效果不佳。
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明提供了一种半月板组织来源的间充质干细胞及其制备方法和鉴定。
[0008]本发明半月板组织来源的间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤:
[0009](I)取半月板组织，剪成组织碎块，用包含I型胶原酶和II型胶原酶的混合胶原酶溶液消化4?6h，其中，混合胶原酶溶液中，I型胶原酶和II型胶原酶的浓度均为0.1%?0.5% (w/v)；
[0010](2)终止消化，用100?400目筛网过滤，1000?2000rpm离心4?lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37°C、5% CO2、条件下培养，2?3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3天换液一次,在细胞融合度为80%?90%时收获细胞，即可。
[0011]步骤(I)中，所述组织碎块的体积为I?5mm3。
[0012]步骤(I)中，所述消化是在37°C、30?300转/分条件下振荡消化。
[0013]步骤(I)中，所述混合胶原酶溶液中，I型胶原酶和II型胶原酶的浓度均为0.2%(w/v);所述I型胶原酶溶液是包含胶原酶的低糖DMEM培养基。
[0014]步骤⑵中，所述终止消化的方法是:加入细胞悬液1/2?3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM培养基。
[0015]步骤(2)中，所述筛网为200目筛。
[0016]步骤(2)中，所述离心的转速为1200rpm,离心时间为5min。
[0017]步骤⑵中，细胞培养时，环境的相对湿度为95%。
[0018]步骤⑵中，所述间充质干细胞培养基是添加有10% FBS, 3.7g/LNaHC03,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。
[0019]本发明还提供了前述方法分离得到的间充质干细胞。
[0020]FBS:胎牛血清。
[0021]目前，通常认为间充质干细胞存在于骨髓、外周血、脐血、松质骨、脂肪组织、滑膜和脐带中，但是用这些来源的间充质干细胞用于半月板修复均存在缺陷，如，骨髓间充质干细胞含量非常低(仅占有核细胞的0.01%?0.001% )，且存在供区并发症等缺点，而其他组织来源的干细胞又不能确切分化为半月板细胞，导致修复效果不好。
[0022]然而，发明人却从半月板组织分离得到了间充质干细胞，综合半月板细胞的稳定表型和间充质干细胞“干性”特征两者的优点，可以克服前述其他来源间充质干细胞用于修复半月板存在的问题。
[0023]本发明半月板组织来源的间充质干细胞，综合半月板细胞的稳定表型和间充质干细胞“干性”特征两者的优点，可以制备成为半月板组织修复用种子细胞，用于修复半月板组织，临床应用前景良好。
[0024]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1半月板损伤的MR1、关节镜下发现、大体观察；
[0026]图2半月板碎片来源的间充质干细胞显微镜下的形态；
[0027]图3半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的表面标记；
[0028]图4半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的成骨分化；
[0029]图5半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的成脂分化；
[0030]图6半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的成软骨分化。
【具体实施方式】
[0031]实验材料和试剂:
[0032]磷酸缓冲盐溶液(PBS)，I型胶原酶，II型胶原酶，低糖DMEM(含lg/L葡萄糖，购自Gibco)，高糖DMEM (含4.5g/L葡萄糖)，胰酶消化液(0.25%胰酶/0.1 % EDTA)，CD44抗体，CD90抗体，CD105抗体，CD34抗体，CD45抗体，II型胶原抗体，成骨诱导液，成脂诱导液，成脂诱导维持液，成软骨诱导液，茜素红染液，油红O染液，甲苯胺蓝染液，阿尔新蓝染液。
[0033]实施例1本发明半月板组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0034]一、分离及检测方法
[0035]1、半月板碎片的取材
[0036]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为半月板损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出半月板碎片(详见图1)。在显微镜下切除带血管的组织、周围附着的滑膜和韧带，置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0037]2、半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的分离培养
[0038]用眼科剪将取材的半月板碎片剪成约I?5mm3大小的组织碎块，然后在0.2% I型、0.2% II型混合胶原酶(I型、II型胶原酶的浓度均为0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(150转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液等体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用200目筛网过滤消化后的细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3天换液一次。培养大约10?14天，细胞达到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。收集第3代细胞用于后面的实验。
[0039]实施例2本发明半月板组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0040]一、分离及检测方法
[0041]1、半月板碎片的取材
[0042]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为半月板损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出半月板碎片(详见图1)。在显微镜下切除带血管的组织、周围附着的滑膜和韧带，置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0043]2、半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的分离培养
[0044]用眼科剪将取材的半月板碎片剪成约I?5mm3大小的组织碎块，然后在0.1 % I型、0.1% II型混合胶原酶(I型、II型胶原酶的浓度均为0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(30转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液等1/2体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用100目筛网过滤消化后的细胞悬液，100rpm离心lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111链霉素，25叩/1111两性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3天换液一次。培养大约10?14天，细胞达到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。
[0045]实施例3本发明半月板组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0046]一、分离及检测方法
[0047]1、半月板碎片的取材
[0048]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为半月板损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出半月板碎片(详见图1)。在显微镜下切除带血管的组织、周围附着的滑膜和韧带，置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0049]2、半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的分离培养
[0050]用眼科剪将取材的半月板碎片剪成约I?5mm3大小的组织碎块，然后在0.5% I型、0.5% II型混合胶原酶(I型、II型胶原酶的浓度均为0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(300转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用400目筛网过滤消化后的细胞悬液，2000rpm离心4min，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖DMEM，10%FBS，
3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111链霉素，25叩/1111两性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3天换液一次。培养大约10?14天，细胞达到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。
[0051]以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
[0052]实验例I半月板组织来源的间充质干细胞的特性检测
[0053]一、检测方法
[0054]取实施例1制备的半月板组织来源的间充质干细胞，按照如下方法检测各特性:
[0055]1、半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的表面标记
[0056]通过FCM分析第3代半月板碎片来源的间充质干细胞的免疫表型。选择⑶44、⑶90和⑶105作为阳性标记，⑶34和⑶45作为阴性标记。收集生长良好的第3代细胞，以I X 16细胞/ml的细胞密度重悬于PBS中，于FITC标记的⑶44或纯化⑶90、⑶105、⑶34、⑶45抗体溶液中孵育lh，加入一定体积FITC标记的二抗孵育30min。每管检测都设计同型抗体IgG对照以消除非特异染色。经洗涤后于流式固定液中固定30min。至少10000个细胞通过流式细胞仪进行分析，上机检测。
[0057]2、半月板碎片来源的组织特异间充质干细胞的多向分化潜能
[0058]通过成骨、成脂和成软骨三系分化来评价间充质干细胞的多向分化潜能
[0059]成骨分化:取生长良好的第3代半月板碎片来源的间充质干细胞，以3X103/cm2的密度接种于6孔板中，24小时后弃去培养基，加入2ml成骨诱导液(高糖DMEM，10% FBS,0.1 μ M地塞米松，1mM β-甘油磷酸钠，50 μ M抗坏血酸，2mM L-谷氨酰胺，I %双抗)。每3天换液一次，诱导2周。采用茜素红染色和ALP染色评估成骨矿化和早期特异成骨基质的分泌情况。并通过Real-tine PCR检测成骨特异基因的表达。
[0060]成脂分化:取生长良好的第3代半月板碎片来源的间充质干细胞，以3X103/cm2的密度接种于6孔板中，24小时后弃去培养基，加入2ml成脂诱导液(高糖DMEM，10% FBS,I μ M地塞米松，0.5mMIBMX, 10g/ml胰岛素，10mM吲哚美辛，2mM L-谷氨酰胺，I %双抗)，3天后换成成脂维持液(高糖DMEM，10% FBS, 10g/ml胰岛素，2mM L-谷氨酰胺，I %双抗)，24h后再换成成脂诱导液，如此循环，至到2周。采用油红O染色评估细胞质内脂滴形成情况。并通过Real-tine PCR检测成脂特异基因的表达。
[0061]成软骨分化:采用三维细胞微团和无血清培养体系评价半月板碎片来源的间充质干细胞的成软骨能力。收集IX 16生长良好的第3代半月板碎片来源的间充质干细胞，在15毫升的聚丙烯锥形离心管中悬于Iml成软骨诱导液[100X ITS(6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，5.35 μ g/ml亚麻酸，6.25ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μ g/ml亚硒酸),lmmol/L丙酮酸钠,0.17mmol/L抗坏血酸,0.1 μ M地塞米松,0.35mmol/L脯氨酸，10ng/mlTGFβ 3]中，1500rpm/min离心10分钟，置于37°C含5% CO2的培养箱中培养，每3天换液一次，至到3周。行HE、甲苯胺蓝、阿尔新蓝、II型胶原免疫组化染色评估微球大体及软骨特异细胞外基质的分泌情况。并通过Real-tine PCR检测成软骨特异基因的表达。
[0062]二、检测结果
[0063]1、形态特征
[0064]如图2所示，原代接种4?6天后分离获得的细胞呈典型的长梭形的成纤维细胞样形态㈧；10?14天后培养的细胞达到80%?90%融合，呈旋涡状生长⑶；传代至第3代后细胞较均一(C)。
[0065]结果证明，本发明分离获得的细胞呈间充质干细胞形态。
[0066]2、分离细胞的表面标记
[0067]如图3所示，本发明分离获得的细胞，表达典型的间充质细胞标记⑶44、⑶90和⑶105 (95 %以上)，而不表达造血系细胞标记⑶34和⑶45 (5 %以下)。
[0068]结果证明，本发明分离获得的细胞表达间充质干细胞标记。
[0069]3、细胞分化
[0070]如图4所示，本发明分离获得的细胞经成骨诱导14天后茜素红和ALP染色阳性，Real-tine PCR检测显示表达成骨特异基因Runx2，OCN, ALP和I型胶原。
[0071]如图5所示，本发明分离获得的细胞经成脂诱导14天后光镜下可见透亮的脂滴形成，油红O染色阳性，Real-tine PCR检测显示表达成脂特异基因PPAR- y , Adiponect1n,LPL，PAS 和 aP2。
[0072]如图6所示，本发明分离获得的细胞经在三维细胞微团和无血清条件下成软骨诱导21天后，HE染色显示细胞圆形位于微团里面，甲苯胺蓝、阿尔新蓝和免疫组化染色阳性显示软骨特异细胞外基质GAG和II型胶原表达，Real-tine PCR检测显示表达成软骨特异基因S0X-9，II型胶原和GAG。
[0073]结果证明，本发明分离获得的细胞具有分化成骨、成脂、成软骨的能力。
[0074]实验结果说明，本发明分离获得的细胞贴壁生长，呈典型的长梭形的成纤维细胞样形态，表达典型的间充质细胞标记⑶44、⑶90和⑶105，而不表达造血系细胞标记⑶34和CD45，在适当的条件下具有分化成骨、成脂、成软骨的能力，经鉴定为间充质干细胞。
[0075]本发明半月板碎片来源的间充质干细胞综合半月板细胞的稳定表型和MSC“干性”特征两者的优点，其分化确切，生物活性优良，是未来半月板再生及其转化医学研究中较为理想的一种种子细胞来源，临床应用前景良好。
【权利要求】
1.一种半月板组织来源的间充质干细胞的分离方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)取半月板组织，剪成组织碎块，用包含I型胶原酶和II型胶原酶的混合胶原酶溶液消化4?6h，其中，混合胶原酶溶液中，I型胶原酶和11型胶原酶的浓度均为0.1 %?0.5 %(w/v)； (2)终止消化，用100?400目筛网过滤，1000?2000rpm离心4?lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37°C、5% CO2条件下培养，2?3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3天换液一次，在细胞融合度为80%?90%时收获细胞，即可。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述组织碎块的体积为I ?5mm3。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述消化是在37°C、30?300转/分条件下振荡消化。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述混合胶原酶溶液中，I型胶原酶和II型胶原酶的浓度均为0.2% (w/v);所述I型胶原酶溶液是包含胶原酶的低糖DMEM培养基。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述终止消化的方法是:加入细胞悬液1/2?3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM培养基。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述筛网为200目筛。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述离心的转速为1200rpm,离心时间为5min。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞培养时，环境的相对湿度为95%。
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述间充质干细胞培养基是添加有 10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，25ng/ml 两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。
10.权利要求1?9任意一项方法分离得到的间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/0775GK104357385SQ201410654276
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】付维力 申请人:四川大学华西医院