一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法，属于应用微生物学领域。本发明方法包括培养基的配制、捕食线虫真菌的培养、分生孢子的收集和计数。本发明利用在玉米粉琼脂CMA培养基中添加浓度为0.2％的NaNO3来促进捕食线虫真菌产生分生孢子。本发明方法与现有的方法相比，本发明的优点在于：利用本发明方法获得的分生孢子数量显著增加，最多达到4倍以上；本发明操作简单易行，重复性好，能够获得大量分生孢子，为进一步研究和利用捕食线虫真菌作为病原线虫的生防菌奠定了良好的基础。
【专利说明】一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法，属于应用微生物学领域。
【背景技术】
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[0002]植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生线虫所引起的农作物经济损失高达1570亿美元(Abad et al.，2008)。在我国，线虫危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麦、水稻、林木、中药材等几乎所有的经济作物，成为农业生产中重要的限制因子之一。目前对线虫病害的防治仍然以化学防治为主，但由于化学农药对生态环境的影响以及病原线虫抗药性的增加，使其应用逐步受到限制，因此采用线虫天敌进行生物防治日益受到研究人员的关注(刘杏忠等，2004 ;杨晓野等,2004 ；Moosavi and Zare, 2012)。
[0003]捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)是线虫的重要天敌之一，它们对于自然界中线虫种群的动态平衡具有重要的调节作用。捕食线虫真菌根据形态学特征分为节丛抱属(Arthrobotrys spp.)、单顶抱属(Monacrosporium spp.)和隔指抱属(Dactylellaspp.)(张克勤等，2006)。捕食线虫真菌的营养菌丝能够特化形成粘性菌网、粘球和收缩环等捕食器官捕捉和侵染线虫(张克勤等，2006 ；Yang et al., 2011) ?捕食线虫真菌在土壤中通常以腐生生活模式生长，当接触到线虫后会产生捕食器官捕捉线虫，同时生活模式也转化为寄生生活模式。因此，捕食器官的形成是捕食线虫真菌从腐生向寄生生活方式转变的重要标志(Yang et al.，2011)。此外，部分捕食线虫真菌的分生孢子能够萌发直接形成捕食器官，而不经过中间的菌丝阶段。这种结构被称为分生孢子捕食器官，常见于自然环境(例如牛粪和根际土壤)，它们与菌丝分化形成的捕食器官一样具有捕获线虫的能力(Dackman and Nordbring-Hertz, 1992 ；Persmark and Nordbring-Hertz, 1997)。总之，捕食线虫真菌是一类非常重要的线虫病害的生防资源。
[0004]目前，已经有多种捕食线虫真菌被开发成商品用于植物线虫病害的生物防治，包括Arthrobotrys irregularis 和 Arthrobotrys robusta(Dong and Zhang, 2006)。与化学农药相比，利用捕食线虫真菌开发的生防制剂是一种活菌剂，因此生防制剂的保存期和货架期较短。而分生孢子和菌丝相比，它的抗逆性更强，在常温或低温条件下的存活期更长。因此提高捕食线虫真菌产生分生孢子的能力，开发以分生孢子为主的线虫生防制剂，不仅能够延长捕食线虫真菌开发的生防制剂的保质期和货架期，同时也为研究捕食线虫真菌形成分生孢子的分子机制奠定了良好的基础。
[0005]分生孢子的形成是真菌抵御外界不良环境的一种生存方式。一般来讲，在营养条件丰富时，捕食线虫真菌生长旺盛而产孢很少，相反在营养条件贫瘠的培养基上容易产孢而菌丝生长较差。在实验室，人们通常采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养捕食线虫真菌的分生孢子。本发明在CMA培养基中添加0.2%硝酸钠(NaNO3)能够有效促进捕食线虫真菌形成分生孢子，分生孢子的数量最多增加4倍以上。
[0006]经文献检索，未发现与本
【发明内容】
相同文献的公开报道。
【发明内容】
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[0007]本发明的目的在于克服现有的技术不足，提供一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法，为进一步研究捕食线虫真菌产生分生孢子的分子机制、以及延长捕食线虫真菌生防制剂的保质期和货架期奠定基础。
[0008]本发明涉及的硝酸钠(NaNO3)为实验室常规实验用品，能从国内外市场购买得到。本发明涉及的捕食线虫真菌，如寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)、坚粘孢单顶孢(Monacrosporium haptotylum)和环捕节丛抱(Arthrobotrys brochopaga)为常规实验真菌，对人体和动物没有致病性，能够从国内外的微生物保藏机构购买获得。
[0009]本发明实现的步骤如下:
[0010]1.培养基
[0011]培养基的组成和配制方法如下:
[0012]I)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):用于捕食线虫真菌菌种的活化。去皮马铃薯200g，切块、煮沸30分钟，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20g，加水补充体积到100mL，121°C 灭菌 20 分钟。
[0013]2)玉米粉琼脂培养基(CMA):用于捕食线虫真菌分生孢子的培养。称取20g玉米粉，加入100mL去离子水，煮沸20分钟，用6层纱布过滤收集液体，加入20g琼脂，121 °C灭菌20分钟。
[0014]3) CMA+NaN03培养基:用于捕食线虫真菌分生孢子的培养。CMA培养基的配制方法同上，分别加入浓度为0.1-0.8%的NaNO3,121°C灭菌20分钟。
[0015]2.捕食线虫真菌的培养(以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A.0ligospora为例)
[0016]I)寡孢节丛孢的活化:接种寡孢节丛孢菌种在PDA, 28°C培养6_7天。
[0017]2)寡孢节丛孢分生孢子的培养:按上述方法配制CMA和CMA+NaN03培养基，分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布和牛皮纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于CMA和CMA+NaN03培养基上，28°C培养14天，培养分生孢子。
[0018]3.捕食线虫真菌分生孢子的收集(以寡孢节丛孢A.0ligospora为例)
[0019]I)实验用品:灭菌去离子水、灭菌玻璃珠、灭菌漏斗(4层擦镜纸)等。
[0020]2)操作步骤:
[0021]①往培养寡孢节丛孢的三角瓶中加入灭菌去离子水(8mL/瓶)，然后加入适量灭菌玻璃珠，振荡2-3min ；
[0022]②用移液器将三角瓶中的孢子溶液转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤；
[0023]③向上述三角瓶中再次加入8ml灭菌去离子水，用相同方法重洗一次孢子，液体转移至同一漏斗内过滤；
[0024]④将滤液转移至另一装有无菌擦镜纸的漏斗内再次过滤；
[0025]⑤将第④步获得的滤液用移液器转移到Eppendorf管中，12000rpm/min,离心2min ；
[0026]⑥孢子悬液的浓缩:得到的孢子悬液浓缩至一定体积，然后用血球计数板进行计数，计算孢子的浓度。
[0027]与现有技术相比，本发明有以下优点:
[0028]1、硝酸钠能够有效促进捕食线虫真菌产生分生孢子，最多达到4倍以上；
[0029]2、本发明具有简单易行、重复性好和可控性强的特点；
[0030]3、捕食线虫真菌的分生孢子较营养菌丝的抗逆性强，在常温或低温条件下的存活时间更长，能够有效延长生防制剂的有效期和货架期。同时，本发明为进一步研究捕食线虫真菌产生分生孢子的分子机制奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
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[0031]图1为不同浓度的NaNO3对寡孢节丛孢产生分生孢子的促进作用。
[0032]图2为0.2% NaNO3对捕食线虫真菌寡孢节丛孢、坚粘孢单顶孢和环捕节丛孢产生分生孢子的促进作用。图中:a为CMA培养基；b为CMA+0.2% NaNO3培养基。
【具体实施方式】
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[0033]以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
[0034]实施例一:利用CMA+NaN03培养基培养寡孢节丛孢产生分生孢子
[0035]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA，分别添加不同浓度的NaNO3, NaNO3的浓度分别为0.1%或0.2%或0.4%或0.6%或0.8%，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布和牛皮纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于上述CMA和CMA+NaN03培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，培养分生孢子。
[0036]按照
【发明内容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分别收集CMA和CMA+NaN03培养基上寡孢节丛孢的孢子，得到的孢子悬液浓缩至等体积，然后用血球计数板观察计数，计算孢子的浓度。结果发现，在CMA培养基中添加0.1 %或0.2%的NaNO3能够有效促进寡孢节丛孢产生分生孢子，0.2%的NaNO3的促进作用最好，而NaNO3的浓度高于0.2%将会明显抑制分生孢子的形成(附图1)。同时，与不添加NaNO3的CMA培养基中寡孢节丛孢的产孢量相比，寡孢节丛孢在CMA+0.2% NaNO3培养基上的产孢量增加了 4.2倍(附图2)。
[0037]实施例二:利用CMA+NaN03培养基培养环捕节丛孢产生分生孢子
[0038]按照
【发明内容】
部分所描述的方法分别配制CMA，添加0.2% NaNO3,然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布和牛皮纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的环捕节丛孢菌块接种于上述CMA和CMA+0.2% NaNO3培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，培养分生孢子。
[0039]按照
【发明内容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分别收集CMA和CMA+0.2% NaNO3培养基上环捕节丛孢的孢子，得到的孢子悬液浓缩至等体积，然后用血球计数板观察计数，计算孢子的浓度。与CMA培养基上收集得到的孢子数目相比，CMA+0.2% NaNO3培养基上收集得到的环捕节丛孢的分生孢子数量增加了 2.36倍(附图2)。
[0040]实施例三:利用CMA+NaN03培养基培养坚粘孢单顶孢产生分生孢子
[0041]按照
【发明内容】
部分所描述的方法分别配制CMA，添加0.2% NaNO3，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布和牛皮纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的坚粘孢单顶孢菌块接种于上述CMA和CMA+0.2% NaNO3培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，培养分生孢子。
[0042]按照
【发明内容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分别收集CMA和CMA+0.2% NaNO3培养基上环捕节丛孢的孢子，得到的孢子悬液浓缩至等体积，然后用血球计数板观察计数，计算孢子的浓度。与CMA培养基上收集得到的孢子数目相比，CMA+0.2% NaNO3培养基上收集得到的坚粘孢单顶孢的分生孢子数量增加了 3.21倍(附图2)。
【权利要求】
1.一种利用硝酸钠促进捕食线虫真菌产生分生孢子的方法，包括培养基配制、捕食线虫真菌培养、分生孢子收集和计数等步骤；其特征在于:在玉米粉琼脂0嫩培养基中添加浓度为0.2%的似勵3。
【文档编号】C12N3/00GK104357373SQ201410663299
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】杨金奎, 苏浩, 朱威, 周静, 冯会华, 张克勤 申请人:云南大学