表皮毛和棉花纤维特异启动子pltp及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】，涉及表皮毛和棉花纤维特异启动子PLTP及其应用。本发明要解决的技术问题是为棉花品种的改良提供一种新选择。本发明的技术方案是表皮毛和棉花纤维特异启动子PLTP，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了含有所述启动子PLTP的表达载体。本发明还提供了含有所述载体的宿主。本发明还提供了所述的启动子PLTP在获得转基因植物中的应用。本发明的启动子可用于烟草和棉花品质的改良以及棉花纤维品质的改善。
【专利说明】表皮毛和棉花纤维特异启动子PLTP及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程【技术领域】，涉及表皮毛和棉花纤维特异启动子及其应 用。
【背景技术】
[0002] 表皮毛由植物表皮细胞发育而来，广泛分布于陆生植物，是生长在植物表皮组织 的一种特化结构。其形态多种多样，由一个细胞或多个细胞构成；有产生分支的，也有不分 支的；有的有腺体，可分泌生物碱（如尼古丁、类萜等），有的则无腺体（高英等，植物学报 2011，46(1) : 119 - 127)。表皮毛除具有增加表皮层厚度，减少热量和水分散失的功能外，还 能够保护植物免受昆虫和病原体的侵害以及降低机械损伤和紫外光伤害等（Szymanskiet al.，2000)。此外，中国蕨类植物蜈蚁草（Pterisvittata)的表皮毛还具有高度吸收重金属 化学元素的能力，这无疑对提高土壤重金属污染的主动防御以及新防御措施的开发利用有 重要的启示作用（Lietal.，2005)。
[0003] 从植物学的角度，棉花纤维也是生长在种皮上的一种表皮毛。棉花纤维是重要的 纺织工业原料，我国是棉纺织品消费和出口大国，因此，棉花生产在我国国民经济中占有重 要的地位，同时也是农民重要的经济来源。能否迅速提高我国棉花品种的纤维品质，直接关 系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工、纺织设备制造、外贸出口等行业的生存与发 展。虽然利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了很大的成功，但近20年来，世界 棉花品种在产量上已经达到一个平台期，利用现有的遗传资源和育种手段难以再大幅度提 高棉花产量（MeredithW.R.BetterCrops200084(4) :6?9)。单纯依靠常规育种改良棉 花纤维品质相当困难。这是因为：1)棉花纤维强力、细度等品质性状基因与皮棉产量存在 负连锁，常规育种方法很难打破这种遗传上的负相关；2)我国的棉花栽培品种主要是陆地 棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉（纤维强度）、异常棉（纤维强度与细 度）以及四倍体的海岛棉（纤维强度与细度）等，这些优良性状基因的利用在常规育种中 受到诸多限制。瑟伯氏棉与异常棉为二倍体野生种，与四倍体陆地棉杂交后，存在远缘杂交 带来的农艺性状差、后代难于稳定、周期太长等问题；即便是同为四倍体的海X陆杂交，同 样存在后代分离强烈，产量-品质负连锁关系仍难打破等问题（潘家驹1998棉花育种学 99?104北京：中国农业出版社）。JeffreyChen甚至认为：一在不影响产量的前提下要 改进棉花纤维品质几乎是不可能的II(NatureBiotechnology，2011, 29(5) :407-409)。
[0004] 利用基因工程的方法可以打破物种间的遗传障碍，实现目的基因的定向转移，同 时具有后代易于稳定，育种周期短等优点。因此，在明确棉花纤维发育分子机理的基础上， 分离促进棉花纤维发育相关的基因，进而利用基因工程的手段对棉花纤维产量和品质实行 定向改良，近年来一直是国内外研究中的热点。
[0005]启动子是RNA聚合酶能够特异识别的一段DNA分子，也就是使转录开始的部位。 在基因表达的调控中，转录是基因表达的第一步，也是表达调控的关键一步（Lewi，2005基 因VIII669?705,北京：科学出版社）。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水 平表达异源蛋白质的表达载体，启动子对外源基因在生物中的表达部位与表达水平影响很 大，是基因工程表达载体的重要元件。在棉花纤维品质的基因工程改良中，往往需要外源基 因特异地在纤维细胞中表达，从而降低外源基因对棉花正常生长的影响。在有关棉花纤维 发育的基因调控机理研究中，通常采用转基因的手段，将目的基因超量表达或表达沉默，从 而推测其功能。因此，在通过转基因手段验证其功能时，会干扰转基因棉的正常生长，产生 无法预料的结果，影响实验结果的准确性和实验进度。如果采用棉花纤维特异启动子，则可 以使目的基因的表达控制在纤维发育过程中。因此，棉花纤维或种皮特异启动子的克隆及 其表达分析，对棉花纤维发育的基因功能研究和纤维品质的基因工程改良，都具有十分重 要的价值。
[0006] 前人通过利用纤维特异启动子，尝试通过生物工程技术改良棉花纤维的品质，如 将聚羟基丁酸合成酶系在棉花纤维中特异表达改善了棉花纤维的保暖性能。1996年美国 Agracetus公司首次报道基因工程改良棉纤维的探索性试验。经遗传转化的棉纤维中含有 一种天然的脂肪族聚酯化合物--多聚一D-(-)_3羟基丁酸（PHB)。PHB聚酯是一种天然的 可降解的热性塑料（thermoplastic)，其理化性质与聚丙烯相似。PHB常以包涵体的形式存 在于某些细菌的体内作为碳源。PHB的生物合成涉及3种酶d-酮硫解酶、乙酰CoA还原 酶和PHB合成酶。John等（JohnME,KellerG.MetabolicProcNatlAcadSci,USA1996， 93 :12768-12773)将乙酰CoA还原酶基因（phaB)和PHB合成酶基因（phaC)分别与纤维特 异性启动子E6和FbL2A连接，构建植物表达载体，运用基因枪技术，将phaB和phaC基因共 转化到陆地棉栽培种DP50中，成功获得同时表达phaB和phaC基因的转基因棉花。⑶S基 因表达、Northern杂交等分子检测结果均证明：phaB和phaC□在转基因棉株纤维中表达。 荧光显微镜和透射电子显微镜观察一致显示：转基因棉纤维细胞中含有PHB颗粒。对转基 因棉纤维提取物的GC-MC分析表明，纤维中有与细菌PHB质谱相同的物质，证明转基因棉 纤维中合成了PHB大分子物质。HPLC分析结果表明：每克纤维干重含约30-3440iig的PHB， PHB的合成始于开花后10d，纤维成熟后PHB含量没有降低。利用植物体内自身的乙酰CoA 合成大分子PHB，并没有对棉花纤维品质如长度、强度和马克隆值带来任何影响，然而PHB 的存在的确提高了纤维的热绝缘性能。但是因纤维中PHB含量仍较低，绝缘性提高的幅度 尚有限。
[0007] 在基因工程改良棉纤维方面颇为人们关注的另一个焦点是美国Auburn大学 Daniell的研究工作。Daniell(HenryDaniell，BeltwideCottonConferences，1998， 595?598)试图将编码含Val-Pro-Gly-Val-Gly重复单兀的蛋白聚体（protein-based polymers，PBPs)基因遗传转化棉花，使棉花细胞能特异表达出PBPs蛋白。PBPs蛋白广泛存 在于自然界中，如哺乳动物结缔组织中的弹性蛋白，分子内含有由多个氨基酸组成的重复 顺序，PBPs分子常表现出较强的弹性（弹性系数10. 6?10. 9Pa)oDaniell(HenryDaniell， BeltwideCottonConferences，1998, 595 ?598)认为将PHBs引进棉纤维，一方面有望提 高纤维的弹性和强度，另一方面纤维中蛋白质含量的提高，纤维吸水能力增强，与染料的亲 和力亦相应增强，这是目前常规育种方法所做不到的。
[0008] 上述案例说明利用基因工程技术，在纤维特异启动子控制下，特异表达目的基因 可以改良棉花纤维品质。特异启动子在棉花基因工程育种中的重要性，在Zhang等人的工 作中表现的更为突出（Zhang,etalNatureBiotechnology，2011，29:453-458)。前人通过 外源施用，发现生长素对纤维发育具有促进作用，于是John(1999)将生长素IAA生物合成 酶基因置于纤维专一性启动子E6控制下，以期通过增加纤维细胞中的生长素来改进棉花 产量或品质。结果发现，虽然IAA含量在转基因棉花纤维细胞中显著增加，但是转基因纤维 细胞并未发生明显的改进。John由此得出结论：超量表达生长素对棉花纤维的长度、强度 和马克隆值没有影响（John，M.E. 1999)。Zhang等利用单克隆抗体原位杂交技术对IAA进 行细胞定位，发现IAA在开花当天的棉花纤维起始细胞中高浓度积累；而无纤维突变体则 没有明显的IAA信号，表明IAA对棉花纤维细胞的起始具有十分重要的作用。棉花纤维细 胞是由胚珠外珠被表层细胞经分化突起、伸长而形成的。研究表明，只有开花后5天之内突 起的表皮细胞（约占10%左右）可以发育成为具有纺纱价值的长纤维。他们根据一生长 素在棉花纤维突起细胞中极性分布II这一发现，分析了前人利用生长素改良棉花纤维失 败的原因。认为必须把生长素的极性分布与棉花纤维细胞发育的特点结合起来，利用特异 启动子对生长素合成酶基因进行特定部位、时间和强度上的精确调控，方能达到改良纤维 产量和品质的目的。于是他们将来自矮牵牛而且表达活性区在胚珠外表皮，控制基因表达 的时间在开花前2天到开花后8天的FBP7启动子，与生长素生物合成基因iaaM融合并导 入棉花中。转基因棉花表型分析结果表明，不仅胚珠表面纤维数目增加、衣分得到提高，而 且纤维细度也得到改良，即转基因棉花纤维的产量和品质得到同步改良。与John所用的启 动子E6主要在开花后5-24天的纤维细胞中表达相比，该实验选用了另外一个具有如下特 点的启动子：①表达的时间是在开花前2天至开花后5天之间；②表达的部位不是在已经 分化形成的纤维细胞，而是胚珠外表皮细胞，促进了更多的胚珠外表皮细胞分化发育为纤 维细胞，进而提高棉花的产量和品质；③表达的强度不同，特别对激素水平的调控应始终， 否则植物生长发育不正常，还会导致减产或品质下降。因此，先锋公司部门副总裁Michael Lassner认为，该研究一清楚地证明了启动子的选择在性状改良上的重要性||(《Faculty of1000》，2011年9月14日）。该研究一展现了新一代转基因作物的光明前景||(Jeffrey Chen,NatureBiotechnology,2011，29(5):407-409)。
[0009] 棉花胚珠表皮或纤维特异启动子在棉花基因工程改良中的巨大潜在价值，使一些 棉花这类特异启动子得到克隆，然而目前能用于棉花基因改良的启动子仍然非常有限，因 此，获得更多棉花纤维特异启动子，对今后棉花纤维的基因工程改良和纤维发育基因功能 研究均具有重要的利用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是为棉花品种的改良提供一种新选择。
[0011] 本发明的技术方案是表皮毛和棉花纤维特异启动子PLTP，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
[0012] 本发明还提供了含有所述启动子PLTP的表达载体。
[0013] 具体的，所述的表达载体为植物表达载体。
[0014] 本发明还提供了含有所述载体的宿主。
[0015] 具体的，所述的宿主为根癌农杆菌。
[0016] 本发明还提供了所述的启动子PLTP在获得转基因植物中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述的启动子PLTP在获得转基因棉花或者转基因烟草中的应 用。
[0018] 本发明还提供了所述的表达载体在获得转基因植物中的应用。
[0019] 本发明还提供了所述的表达载体在获得转基因棉花或者转基因烟草中的应用。
[0020] 本发明还提供了所述启动子PLTP在改善棉花纤维品质中的应用。
[0021] 本发明还提供了含有所述启动子的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：
[0022] (1)将表皮毛和棉花纤维特异的启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达 载体；
[0023] (2)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；
[0024] (3)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。
[0025] 本发明的烟草表皮毛和棉花纤维特异启动子序列，其至少含有SEQIDNO. 1所示 的核苷酸序列，该序列为根据棉花GhLTP基因序列设计引物，采用PCR方法，得到的长度为 2467bp的PLTP启动子序列。该序列中包含多个种子胚乳有关的SKn-1，与MYB转录因子结 合位点有关的MRE和MBS，与ABA、SA等激素相应有关的ABRE和TCA，与逆境、厌氧等诱导相 关的TC富集区和ARE、细胞周期和昼夜节律相关的MSA-like和cricadian，多个CAAT-box、 八-13(?、6-13(?、44644-111〇丨1￡等大量顺式调控元件及与了?11结合的核心序列了4了44。通过在 转基因烟草和转基因棉花中GUS组织化学染色检测，证实该启动子驱动GUS基因在转基因 烟草表皮毛中以及陆地棉纤维细胞中特异地表达。
[0026] 本发明中，采用基因工程方法，将PLTP启动子插入到适宜的表达载体中即可获得 本发明的含有该启动子PLTP的植物表达载体。
[0027] 本发明将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。具体的， 采用电击法将含有PLTP启动子的植物表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中获得转化体。
[0028] 将本发明的PLTP启动子与报告基因构建植物表达载体，将所述植物表达载体转 化宿主获得含PLTP启动子的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。所述转 基因植物优选为烟草或陆地棉。
[0029] 本发明的有益效果：本发明获得了棉花纤维特异基因的启动子PLTP，该启动子在 烟草中具有表皮毛特异表达活性，在陆地棉中具有纤维优势表达特异性，为基因工程改良 烟草、棉花品种提供了新选择和有效的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图lGhLTP基因在陆地棉不同组织中的表达量（RelativeExpression)
[0031]以陆地棉根（root)、莖（stem)、叶（leaves)、花冠（petal)、下胚轴（hypocotyl)、 子叶（cotyledon)、开花当天胚珠（0-0&F)、开花后lid的纤维（11-F)和开花后lid的胚 珠（11-0)中的cDNA为模板，经实时定量PCR扩增的结果；该基因在根中几乎不表达，开花 当天的胚珠中表达量也很低；在下胚轴、子叶、叶片、茎、花瓣及开花后lid胚珠中表达量较 低，而在开花后lid纤维中高表达。
[0032] 图2GhLTP基因在陆地棉纤维不同发育时期的表达量（RelativeExpression)
[0033]开花当天胚珠（0-0&F)、开花后3天的胚珠（3-0&F)、开花后7天的胚珠（7-0)、开 花后9天的胚珠（9-0)、开花后11天的胚珠（11-0)、开花后13天的胚珠（13-0)、开花后19 天的胚珠（19-0)、开花后26天的胚珠（26-0)、开花后7d的纤维（7-F)、开花后9d的纤维 (9-F)、开花后lid的纤维（11-F)和开花后13d的纤维（13-F)。
[0034]图3表示PLTP启动子的核苷酸序列图，图上标记的是一些顺式作用元件的位置， 分别与多个种子胚乳有关的SKn-1 (GTCAT)，与MYB转录因子结合位点有关的MRE(AACCTAA) 和MBS(CGGTCA)，与ABA、SA等激素相应有关的ABRE(GACACGTGGC)和TCA(CCATCTTTTT)，与 逆境、厌氧等诱导相关的TC富集区（GTTTTCTTAC)和ARE(TGGTTT)、细胞周期和昼夜节律相 关的MSA-like(TCAAACGGT)和cricadian(CAANNNNATC)。
[0035] 图4表示PLTP启动子克隆到pEASY-Blunt载体上的质粒图谱。
[0036] 其中载体主要元件标示，pUCorigin质粒复制起点；Ampicillinresistance 〇RF:氨节青霉素抗性基因；KanamycinresistanceORF:卡那霉素抗性基因；其余为限制 性内切酶位点。
[0037] 图5陆地棉PLTP启动子表达载体的构建流程图；
[0038] 图6PLTP启动子表达载体pBI101-PLTP的结构图。
[0039] 图5和图6中载体主要元件标示，reporigin质粒复制起点；NPTII:新霉素磷酸 转移酶基因；GUS: 0 -葡萄糖酸昔酶基因；NOSterminato和N0S:终止子；N0SPromoter: N0S组成性启动子；LB、RB:T-DNA插入左、右边界。
[0040] 图7表示转PLTP::⑶S融合基因烟草的PCR验证结果。18、19、38为标准分子量 DNA(Mark2000)，1-17、20 ?37 为不同的转基因株系。结果表明 1、2、6、8、12-17、20、23、24、 31?36为转基因阴性株系，其余株系为转基因阳性株系。
[0041] 图8表示转PLTP::⑶S融合基因烟草中的⑶S染色结果，⑶S在转基因烟草叶片、 茎、果柄和花的表皮毛上优势表达。其中，A:萌发后5天的幼苗；B:真叶；C:幼茎横切；D:叶 柄横切；E:C中幼茎的放大；F:D中叶柄的放大；G:开花当天的子房；H:开花当天的花冠。
[0042] 图9表示转PLTP::⑶S融合基因棉花的PCR验证结果。1、18、19、36为标准分子 量DNA，2-17、20-35为不同的转基因株系，结果表明转基因株系均为阳性株系。
[0043] 图10表示转PLTP::⑶S融合基因陆地棉的⑶S染色结果；其中A:根；B:莖；C: 叶；D:P十柄；E:花；F:花诞；G:开花当天的胚珠；H:开花后3天的胚珠；I:开花后7天的胚 珠J:开花后12天的胚珠；K:开花后15天的胚珠；L:开花后18天的胚珠。
【具体实施方式】
[0044] 以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限 定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要 求所定义的范围。
[0045] 本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明 的均参考《分子克隆实验指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0046] 实施例1陆地棉各个组织RNA的提取及定量PCR分析
[0047] 利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab)提取棉花各个组织的RNA。参 照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(MBI)说明书进行cDNA-链的逆转录， 用作定量RT-PCR分析模板。采用iQSYBRGreenSupermix(BIO-RAD)试剂分析目的基因的 相对表达量。内标基因选择陆地棉的Ghhis3基因（AF024716)，引物为Ghhisl(5'-GAAGCC TCATCGATACCGTC-3'）和Ghhis2(5'-CTACCACTACCATCATGGC-3'），分别如SEQID NO. 8 和SEQIDNO. 9 所示；GhLTP基因定量PCR引物为，Ltp-1 (5'CGCCCAAACAACACCAGAC3，） 和1^?-2(5'(：1'1'11^04611^6了6〇^66 3'），分别如5￡0 10勵.2和5￡0 10勵.3所示。扩增 条件为：951：预变性3111111;951：变性2〇8,561：退火2〇8,721：延伸3〇8,40个循环。
[0048]计算各材料中目的基因和内标的比值，可得目的基因在不同器官组织中的相对表 达量。如图1所示，该基因在根中几乎不表达，开花当天的胚珠中表达量也很低；在下胚轴、 子叶、叶片、茎、花瓣及开花后lid胚珠中表达量较低，而在开花后lid纤维中高表达。进一 步对不同发育阶段的棉纤维和棉花胚珠进行检测，结果如图2所示，该基因在7天至11天 的纤维中表达较高，相应的在胚珠中的表达量较低。
[0049] 实施例2陆地棉PLTP启动子的克隆
[0050] 采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提 取陆地棉冀棉14的基因组DNA，用设计合成的该启动子的特异引物PLTP-up和PLTP-dn(SEQ IDNO. 4和5)，以上述的DNA为模板，扩增该启动子序列。扩增体系如下：10XPCRbuffer forKODPlus5uL，25mmolMgS045uL，2mmol/LdNTPs2uL,弓 | 物PLTP-up(5umol/ L) 2iiL，引物PLTP-dn(5iimol/L) 2iiL，K0DPlus聚合酶 1U/iiL，陆地棉DNA约 60ng，双蒸 水补足至 50iiL。扩增程序为：94°C，2min;94°C，15sec，53°C，30sec，68°C，2min，35 个循环。 扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，按照说明书的方法克隆至pEASY_Blunt平端 载体上，阳性克隆寄至上海英俊公司测序验证，得到PEASY-PLTP1131载体（见图4)。结果 显示获得的PLTP启动子序列如SEQIDNO. 1所示。利用分析软件（PlantCARE，http:// intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/)，从植物启动子数据库中对该序列进行启动子调 控元件分析，从中发现大量的顺式调控元件（见图3)，这些顺式调控元件包括多个种子胚 乳有关的SKn-1 (GTCAT)，与MYB转录因子结合位点有关的MRE(AACCTAA)和MBS(CGGTCA)， 与脱落酸ABA、水杨酸SA等激素相应有关的ABRE(GACACGTGGC)和TCA(CCATCTTTTT)，与逆 境、厌氧等诱导相关的TC富集区（GTTTTCTTAC)和ARE(TGGTTT)、细胞周期和昼夜节律相关 的MSA-like(TCAAACGGT)和cricadian(CAANNNNATC)。
[0051] 实施例3DNA片段回收、表达载体构建并大肠杆菌转化
[0052] 紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒（Roche公 司）的方法回收相应的DNA片段，构建到。载体构建的具体流程见图5,首先从该启动子的 克隆载体PEASY-PLTP1131中利用限制性内切酶SalI和SmaI将启动子片段切出，然后 克隆到表达载体PBI101 (购自CL0NTECH公司）的SalI和SmaI位点中并置于⑶S报告 基因上游，从而构建pPLTP-GUS的正向表达载体（图6)。所有限制性内切酶均购自Roche 公司，按照使用说明书操作。
[0053] 回收的片段与载体片段的连接体系为：10XT4DNA连接缓冲液liiL，载体DNA片 段1UL，外源连接产物DNA片段1yL，T4DNA连接酶1yL，用双蒸水补足体积至10yL。其 中，载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1 : 3，16°C连接12h。之后将连接产 物转化至大肠杆菌DH5a中。
[0054] 实施例4农杆菌及烟草和棉花的遗传转化
[0055] 用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。
[0056] 按照OMEGA公司质粒提取试剂盒（D6943-01)说明书的步骤，提取PLTP::⑶S植 物表达载体质粒，参考Bio-RADMicroPulser用户说明书，通过电激转化法将该质粒转入农 杆菌LBA4404中。
[0057]烟草的遗传转化：利用农杆菌介导的叶盘转化法（Horsch,etal.，1985)，对烟草 进行遗传转化，将获得的转基因烟草植株通过PCR扩增的方法进行筛选，采用艾德莱生物 公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因烟草的DNA，然后 将PCR呈阳性的植株种植于温室中，常规管理。
[0058]陆地棉的遗传转化：采用农杆菌介导的方法对棉花进行遗传转化（Luoetal.， 2007)，将获得的转基因棉花植株通过PCR扩增的方法进行筛选，采用艾德莱生物公司新型 植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因棉花的DNA，然后进行PCR 扩增鉴定，将阳性的幼苗置于清水中，22°C培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。
[0059] 实施例5转基因植株的PCR验证
[0060] 采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书 的方法提取转基因烟草和棉花的DNA。根据GUS报告基因的序列设计特异引物 N0. 7)用于特异PCR扩增。转基因植株DNA进行PCR体外扩增验证的条件：反应总体积为 25iiL，包括 10XLATaqbuffer2.5iiL、每种dNTP100iimol/L、1.5mmol/LMgC12、模板 DNA10ng、上下游引物各400nmol/L、l单位LATaqDNA聚合酶（TaKaRa公司）。
[0061] 扩增条件：94°C变性4min，继以94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，共35 个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0062] 扩增产物在含溴乙锭的1%琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳后，紫外灯下观察 照像。
[0063] 转基因烟草的PCR验证结果见图7,结果表明1、2、6、8、12-17、20、23、24、31-36为 转基因阴性株系，其余株系为转基因阳性株系。
[0064] 转基因棉花的PCR验证结果见图9,结果表明转基因株系均为阳性株系。
[0065] 实施例6⑶S的组织化学染色及观察
[0066] 取新鲜的转基因烟草、陆地棉材料，切成小块后置1.5mL离心管中，加入⑶S染 色液（lOmmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液pH7. 0,0?lmol/LK3[Fe(CN)6]，0?lmol/ LK4[Fe(CN)6]，0.1% (V/V)TritonX-100,5mg/mlX-Glue)。将含有植物材料和GUS染液的 离心管，放入37. 0°C恒温温箱中，染色3h。最后倾去染色液，通过70%乙醇脱色后，观察照 相。
[0067] 转PLTP::⑶S基因烟草中的⑶S染色结果见图8,结果显示⑶S在转基因烟草叶 片、茎、果柄和花的表皮毛上优势表达，而在非表皮毛组织中不表达，即该启动子具有烟草 表皮毛表达特异性。
[0068] 转PLTP::⑶S基因陆地棉的⑶S染色结果见图10,结果发现在根、叶片、幼茎中 均未观察到GUS的蓝色信号；在花、花冠的表皮毛以及雄蕊、花药中有GUS阳性信号存在； 而从开花当天开始的棉花胚珠表面开始出现GUS的蓝色信号，特别在纤维发育的快速伸长 期，纤维特异细胞中有强烈的GUS阳性信号存在，表明该启动子在陆地棉中具有花器官表 皮毛特异性以及纤维细胞特异性，在纤维细胞的基因工程改良中，可以用于驱动目的基因 在纤维细胞中特异表达，具有重要的应用价值。
[0069] 上述实施例表明，本发明克隆的PLTP启动子核苷酸长度为2467bp，当该启动子与 报告基因融合后，在烟早中能指导报告基因在表皮毛中表达；在陆地棉中能指导报告基因 在纤维细胞中表达。
[0070] 以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明 做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的 范围。
【权利要求】
1. 表皮毛和棉花纤维特异启动子PLTP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 /_J、i 〇
2. 含有权利要求1所述启动子PLTP的表达载体。
3. 如权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为植物表达载体。
4. 含有权利要求2或3所述载体的宿主。
5. 如权利要求4所述的宿主，其特征在于：所述的宿主为根癌农杆菌。
6. 权利要求1所述的启动子PLTP在获得转基因植物中的应用。
7. 权利要求1所述的启动子PLTP在获得转基因棉花或者转基因烟草中的应用。
8. 权利要求2或3所述的表达载体在获得转基因棉花或者转基因烟草中的应用。
9. 权利要求1所述启动子PLTP在改善棉花纤维品质中的应用。
10. 含有权利要求1所述启动子PLTP的转基因植物的制备方法，包括下述步骤： (1) 将表皮毛和棉花纤维特异的启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达载 体； (2) 用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体； (3) 将所述转化体转化植物，获得转基因植物。
【文档编号】C12N15/113GK104328125SQ201410682167
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】侯磊, 郭永艳, 刘弼, 余艳, 裴炎, 李先碧, 梁爱敏, 宋水清, 肖月华, 罗明, 阎星颖 申请人:西南大学