一株产果胶酶的海洋细菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一株产果胶酶的海洋细菌及其应用，涉及果胶酶。产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.1.12375。产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011可在制备果胶酶中应用。果胶酶的制备方法如下：1)将菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后，接入种子培养基RO中，摇床培养至对数生长期，得种子液；2)将种子液转接发酵培养基，再摇床培养，得发酵液；3)将发酵液离心得上清液，即为果胶酶液。经试验，在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到130～154U/ml，具有良好的应用前景。CGMCC No 11237520141029
【专利说明】一株产果胶酶的海洋细菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及果胶酶，具体是涉及一株产果胶酶的海洋细菌及其应用。
【背景技术】
[0002]果胶主要是直链α -1, 4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，一般带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起，含有20种不同的糖苷键，是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分。果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布在高等植物和微生物中。提供一株能产生果胶酶的细菌对研究开发海洋生物资源具有很大的意义。
[0003]中国专利CN103468582A公开一株利用桔皮粉发酵产果胶酶制剂的菌株及利用表面活性剂提高其酶活的方法。以日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl生产果胶酶制剂，制备所得果胶酶制剂活力以果胶酶活力、纤维素酶活力和半纤维素酶活力表征，果胶酶制剂的生产以粉碎的桔皮粉为唯一碳源，加入查氏培养基中的无机营养盐，然后在液态发酵黑曲霉的培养基中添加0.1 %?0.5% (wt)的PEG4000，经过3?5天摇床培养，外切果胶酶活力(Exo-Pectinase)，纤维素酶活力(以CMCase酶计)和半纤维素酶活力(以木聚糖酶Xylanase计)较对照有明显提高。
[0004]中国专利CN101386825 —种产果胶酶的工程菌株,提供了一种用于微生物发酵的产果胶酶的工程菌株。产果胶酶的工程菌株大肠埃希氏菌HDDMG05属于埃希氏菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:Μ 208082 ;大肠埃希氏菌HDDMG05为革兰氏阴性菌，无芽孢，菌株个体呈短杆状，长为0.2?0.7 μπι,宽为0.2?0.5 μ m ;大肠埃希氏菌HDDMG05菌落呈圆形，白色，隆起，边缘呈波浪状，表面光滑有光泽，透明，菌落挑起软。可采用LB液体培养基发酵本发明大肠埃希氏菌HDDMG05，其发酵条件与LB液体培养基培养大肠杆菌的相同；发酵液中大肠埃希氏菌HDDMG05菌数浓度为IX 107?IX 108cfu/mL时发酵液中果胶酶的酶活力达8200U/mL以上。
[0005]中国专利CN101665769公开一株高产原果胶酶的黑曲霉菌株及采用该菌株发酵提取果胶的方法。所述黑曲霉Aspergillus niger⑶_01从湖南常德一倾倒腐烂柑桔的土壤中筛选，保藏编号为CCTCC NO:M 209036。发酵提取果胶的方法包括斜面培养、发酵、果胶提取等步骤。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一株产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011。
[0007]本发明的目的之二是提供一株产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011的应用。
[0008]所述产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011,已于2014年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏中心登记入册编号为:CGMCCN0.1.12375。(Gramella flavus) JLT2011为黄色革兰氏阴性菌，好氧，无芽孢，具有运动性的杆状海洋细菌；长为0.6?0.8 μ m，宽为3.0?6.0 μ m，菌落为黄色，圆形，凸起，表面光滑。
[0009]所述一株产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011可在制备果胶酶中应用。
[0010]所述果胶酶的制备方法如下:
[0011]I)将菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后，接入种子培养基RO中，摇床培养至对数生长期，得种子液；
[0012]2)将种子液转接发酵培养基，再摇床培养，得发酵液；
[0013]3)将发酵液离心得上清液，即为果胶酶液。
[0014]在步骤I)中，所述2216E培养基的配方可为(MB，W/V):蛋白胨5.0g，酵母膏
1.0g,柠檬酸铁0.1g,氯化钠19.45g，无水氯化镁5.90g,硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g,碳酸钠0.16g,溴化钾0.08g,氯化银34.0mg,硼酸22.0mg,娃酸钠4.0mg,氟化钠
2.40mg,硝酸铵1.60mg,磷酸氢二钠8.0mg,蒸懼水100g, ρΗ7.6 ;所述纯化可米用2?3次纯化；所述种子培养基RO的配方可为(W/V):蛋白胨l.0g，酵母膏l.0g，氯化钠20.0g，乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g,蒸馏水1000g，pH8.0 ;所述摇床培养的条件可在28°C，180rpm摇床培养24h至对数生长期。
[0015]在步骤2)中，所述种子液的接种量按质量百分比可为发酵培养基的0.2% ;所述发酵培养基的配方可为:果胶2g，酵母膏1.0g,氯化铵0.5g，氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g,蒸馏水lOOOg，pH 7.6 (Tris-HCl);所述摇床培养的条件可在28°C，180rpm摇床培养48h。
[0016]在步骤3)中，所述离心的条件可为12000gX10min。
[0017]经试验，本发明筛选的具有果胶酶生产能力的细菌，其在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到130?154U/ml，具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011在透射电子显微镜形态图；
[0019]图2为产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011为基于16s序列，利用MEGA 5.01 中的neighbour-joining, maximum-parsimony,把Gramella flavus和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图；
[0020]图3为产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011在钌红平板产生的降解圈。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0022]1、目标菌的筛选:
[0023]对来源于中国大洋22航次的东南太平洋区域站位采集的深层海水样品微生物富集，初筛，复筛，筛选产果胶酶菌。
[0024]具体技术方案如下:
[0025]初筛:将东南太平洋区域站位采集的深层海水水样涂布于用R0(蛋白胨1.0g,酵母膏1.0g,氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g，蒸馏水lOOOg，pH 8.0)。在30°C下培养14d，得到形态各异的单菌落，并纯化，用30%(v/v)甘油(1:1 ;甘油:菌液)保存在_80°C。
[0026]复筛:将上述保种的细菌纯化接入30ml果胶液体培养基(果胶2g，酵母膏1.0g,氯化铵0.5g，氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g，蒸馏水lOOOg，pH 7.6)中，在28°C，180rpm摇床培养。分离能降解果胶的海洋细菌。Gramella flavus的筛选方法:从苹果果胶(Sigma)平板透明圈筛选,具体为配置0.2%的果胶固体培养基(果胶2g，酵母膏1.0g,氯化铵0.5g，氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g,琼脂15g，蒸馏水lOOOg，pH 7.6);添加
10μ I菌液，培养18?24h，得到菌落直径，再将I %的钌红原平板单菌落上，有透明光圈，比较透明光圈和原始菌落直径对比，确定有果胶降解酶活性的，最终确定菌株。
[0027]2、形态特征，生长条件，生理生化指标以及系统发育树分析研究表明，菌株JLT2011具有以下特点:
[0028]菌株形态特征:革兰氏阴性菌，在2216E平板上培养3d后形成黄色、凸起、表面光滑、直径约为I?1.5_的圆形菌落。在透射电子显微镜下观察，菌体呈杆状的，无鞭毛，单细胞为0.6?0.8μηι长,3?6μηι宽。生长条件:严格好氧,最适生长温度为30°C,最适生长pH5?8，最适生长盐度20Z0?8%。
[0029]生理生化特征:氧化酶，过氧化氢酶，酯酶，果胶酶(图)阳性，无法利用明胶、尿素、几丁质、酪蛋白等。
[0030]产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011在透射电子显微镜形态图参见图1 ;
[0031]系统发育树分析:菌株JLT2011的G+C为:42.1mol %。GenBank收录号是JX397931，全基因组登录号为:PRJNA175612。根据16s的系统发育树分析JLT2011与Gramella gaetbulicola的相似性最高为:96.2%,认为是Gramella的新种，最终将其命名为 Gramella flavus。
[0032]产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus) JLT2011为基于16s序列，利用MEGA5.01 中的 neighbour-joining, maximum-parsimony,把 Gramella flavus 和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图参见图2.
[0033]3、产果胶酶细菌菌液的制备:
[0034]将保藏号为=CGMCC N0.1.12375的细菌接种液体培养基(0.2% pectin ；0.1%yeast ；0.05% NH4C1 ；pH 7.6)中，在28°C，180rpm摇床培养24h,获得种子培养液，将种子培养液按2%接种量接种于新鲜的液体培养基，于在28°C，180rpm摇床培养48h，即可制得产果胶酶的细菌菌液。
[0035]4、果胶酶的制备:
[0036]将上述的发酵菌液经高速离心获取上清液，此即为果胶酶酶液。
[0037]5、果胶酶活性的测定:
[0038]果胶酶活单位:Ig或Iml酶液在50°C、pH5.0的条件下，Ih分解果胶产生的Img半乳糖醛酸为一个酶活单位。
[0039]酶活测定采用3，5- 二硝基水杨酸(DNS)比色法。酶反应体系为:1ml果胶酶液+Iml果胶底物(磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0)。酶活测定过程:将反应体系混合均匀立即在50°C水浴中准确反应30min ;加入2mlDNS试剂混匀后立即放入沸水水浴5min，取出，立即用流动冷水冷却；以半乳糖醛酸的标准曲线为对照，于540nm处测定吸光值。经沸水浴预处理1min的失活酶液作为酶活测定的阴性对照。
[0040]结果表明，48h测得的酶活力为130?154U/ml。
[0041]Gramella flavus在钌红平板产生的降解圈参见图3。
【权利要求】
1.产果胶酶的海洋细菌(Gramellaflavus) JLT2011，已于2014年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为=CGMCCN0.1.12375。
2.如权利要求1所述产果胶酶的海洋细菌(Gramellaflavus) JLT2011在制备果胶酶中的应用。
3.如权利要求2所述果胶酶的制备方法，其特征在于其步骤如下: 1)将菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后，接入种子培养基RO中，摇床培养至对数生长期，得种子液； 2)将种子液转接发酵培养基，再摇床培养，得发酵液； 3)将发酵液离心得上清液，即为果胶酶液。
4.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述2216E培养基的配方为:蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.lg，氯化钠19.45g，无水氯化镁5.90g，硫酸钠3.24g,氯化?丐1.8g,氯化钾0.55g,碳酸钠0.16g,溴化钾0.08g,氯化银34.0mg,硼酸22.0mg,娃酸钠4.0mg,氟化钠2.40mg,硝酸铵1.60mg,磷酸氢二钠8.0mg,蒸懼水100g,ρΗ7.6。
5.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述纯化采用2?3次纯化。
6.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述种子培养基RO的配方为:蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g,蒸馏水100g, ρΗ8.0。
7.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述摇床培养的条件是在28°C，180rpm摇床培养24h至对数生长期。
8.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子液的接种量按质量百分比为发酵培养基的0.2%。
9.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵培养基的配方为:果胶2g，酵母膏1.0g,氯化铵0.5g，氯化钠20.0g,乙酸钠1.0g,氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，七水合氯化钙0.05g,蒸馏水lOOOg，pH 7.6 ;所述摇床培养的条件可在28 0C，180rpm 摇床培养 48h。
10.如权利要求3所述果胶酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述离心的条件为12000gX 1min0
【文档编号】C12N9/26GK104388361SQ201410723569
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】汤凯, 林颖芳, 焦念志, 刘克韶, 李书慧, 王璐琰 申请人:厦门大学