一种等渗透压平衡培养液的制作方法
【专利摘要】本发明属于有关水产生物的染色体工程领域。本发明是一种用于低倍鲫鱼染色体诱导加倍成高倍鲫鱼品种过程中的等渗透压平衡培养液，由以下组分构成：硝酸钙90-100mg/L，无水硫酸镁50-60mg/L，无水磷酸二氢钠650-700mg/L，氯化钾400-450mg/L，氯化钠8000-8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L，余量为水。将本发明用于低倍鲫鱼染色体加倍的诱导过程中，可成功诱导出高倍体鲫鱼，并可有效地减少由于受精卵内外渗透压差而损失的高倍体细胞数量，继而使得诱导后受精卵成活率大幅提升。
【专利说明】一种等渗透压平衡培养液
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学领域中有关水产生物的染色体工程领域，具体涉及一种用于鲫鱼染色体加倍的等渗透压平衡培养液。
【背景技术】
[0002]在动物育种中，特别是鱼类的育种中，通常采用种类不同遗传背景种群杂交、染色体加倍、系统选育这几种途径来提高其生长优势、抗病性等生产性状。其中，创造高倍体是这些途径中最为有效的一种改善其生长优势的途径。比如在自然界中，如鲫鱼这样的鱼类通常存在有二倍体、三倍体以及少量的四倍体这三种倍性类型，已有研宄表明鲫鱼倍性越高，生长优势则越为明显。
[0003]创造高倍体个体的方法通常采用压力变化、温度变化、激素变化等。其中诱导染色体加倍的方法是最普遍和最成熟的创造高倍体的主要方法。这种方法通常在动物发育过程中，当受精卵发育到单细胞期后，要进行第一次卵裂，形成两个细胞，此时组织细胞分裂，则细胞内通过有丝分裂形成的加倍染色体。在此时单细胞分裂受到短暂抑制，形成的双倍倍数的染色体不能分离到两个细胞内，则强行融合，形成具有加倍染色体的单细胞。经过抑制分裂的单细胞再次进行卵裂，每个细胞内的染色体数目均为加倍的倍数。因此，从原理上来说，二倍体动物形成四倍体动物、三倍体形成六倍体、或者四倍体形成八倍体是可行的。
[0004]而在现阶段的动物育种研宄中，二倍体到四倍体的动物染色体已经可以实现，但从四倍体加倍到八倍体，这种可以创造更具有生长优势生物品种的诱导方式，至今还没有出现行之有效的解决方法。导致这个问题主要有两方面的原因，其一是染色体数量越多，在染色体加倍的过程中，染色体越容易错配、丢失，造成后代的染色体紊乱，从而导致多数染色体加倍后胚胎不能发育；其二是经过热处理后的卵，细胞膜组织软化，造成细胞内营养物质因为细胞内外渗透压的不一致而外渗，胚胎发育所需营养缺失，导致加倍后的胚胎无充足营养而死亡。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于鲫鱼染色体加倍的等渗透压平衡培养液，这种等渗透压平衡培养液可调节受精卵内外的渗透压，有效地提高了高倍体受精卵的成活率以及染色体加倍的成功率。
[0006]本发明为实现上述目的，采用如下技术方案:
[0007]一种等渗透压平衡培养液，特征在于该培养液用于鲫鱼染色体加倍的诱导过程中，培养液由以下组分构成:硝酸I? 90-100mg/L，无水硫酸镁50-60mg/L，无水磷酸二氢钠650-700mg/L,氯化钾 400_450mg/L，氯化钠 8000_8500mg/L，葡萄糖 6000_6500mg/L，余量为水。使用这种等渗透压平衡培养液来诱导鲫鱼染色体的加倍，能够有效地降低在胚胎培养过程中由于细胞内外渗透压差而损失的高倍体细胞数量，继而使得诱导加倍后受精卵的成活率得到提升，染色体加倍的成功率也得到了大幅提升。
[0008]这种等渗透压平衡培养液，可以用于鱼类染色体从四倍体加倍到八倍体的诱导过程中，可以通过平衡细胞内外的渗透压，避免造成八倍体细胞不必要的损失，提高染色体加倍的成功率，继而创造出至今还尚未被报道的八倍体鲫鱼。同时，这种等渗透压平衡培养液也可能可用于其他鱼类染色体加倍的诱导操作中，来实现平衡受精卵内外细胞的渗透压的功能，继而达到提高受精卵成活率和诱导成功率的效果。
[0009]本发明还可提供了一种使用等渗透压平衡培养液的诱导鲫鱼染色体加倍的方法，特征在于包括以下步骤:Sll催产获得成熟卵，S12授精获得受精卵，S13第一次卵裂出现前放入等渗透压平衡培养液中进行热处理，S14胚胎发育，S15在所述等渗透压平衡培养液中进行培养直至出现鱼苗；S16取样检测鱼苗染色体倍数。这种诱导方法中S13步骤中热处理操作可以有效地阻止低倍染色体的鲫鱼受精卵在有丝分裂期间的卵裂，有利于将鲫鱼染色体进行加倍；同时通过等渗透压培养液的使用，有效地减少由于细胞内外渗透压差而损失的高倍体细胞数量，继而使得诱导加倍后受精卵的成活率得到提升。
[0010]进一步特征在于该诱导方法用于诱导四倍体鲫鱼的染色体加倍操作，能够创造出至今尚未被报道的八倍体鲫鱼。
[0011]优选地，每尾鲫鱼怀卵量为3-5万卵。通过添加渗透压平衡营养液进行处理，诱导加倍后受精卵成活率可以达到0.01%。考虑到鲫鱼的怀卵量为3-5万卵/尾，受精卵加倍后成活率将处于较高水平。通过该诱导方法处理后鲫鱼受精卵的成活率最高可以达到0.02%,染色体加倍率也可以达到60%。
[0012]进一步特征还在于S14步骤中的等渗透压平衡培养液中热处理温度为41.5-42.5°C，培养时间为80-105秒，该热处理条件可使受精卵此次有丝分裂中的卵裂过程更有效地终止，得到八倍体的受精卵细胞，同时这些受精卵细胞也并未失活。
[0013]Sll步骤中采用注射用复方绒促性素B型，按药品规定剂量进行注射催产，获取成熟卵。
[0014]S13步骤中所述授精过程完成后等待lmin，再进行步骤S14放入所述等渗透压平衡培养液中，对其进行所述热处理。
[0015]热处理后向等渗透压平衡培养液中添加鲫鱼成熟卵提取促使胚胎发育，每升热处理液添加鲫鱼成熟卵提取液lmL，用来补充受精卵发育所需的营养，这也可以进一步提高受精卵的成活率。
[0016]S15步骤中在等渗透压平衡培养液中培养温度为18-25°C，培养时间为50_65分钟，使八倍体的受精卵细胞分裂并生长。
[0017]S16步骤中通过镜检的方法来判断有丝分裂的时期。镜检时胚胎染色体制片步骤为S21清洗预处理；S22细胞培养；S23低渗处理；S24细胞固定；S25制片；S26染色；S27镜检、拍照及计数染色体数目。
[0018]本发明具有以下积极的效果:本发明属于水产生物的染色体工程领域。本发明的等渗透压平衡培养液可以有效地调节细胞微环境内外的渗透压。将本发明的用于鲫鱼染色体加倍的诱导过程中，可以有效地减少由于细胞内外渗透压差而损失的高倍体细胞数量，继而使得诱导加倍后受精卵高倍体的成活率大幅提升。更甚者，可以诱导四倍体鱼类创造出八倍体的鱼类，解决了本【技术领域】的一种技术难题，诱导加倍后的八倍体成活率最高可达到0.02%，染色体加倍成功率可达到60%。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为二倍体染色体鲫鱼的镜检图像；
[0020]图2为四倍体染色体鲫鱼的镜检图像；
[0021]图3为八倍体染色体鲫鱼的镜检图像。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图对本发明进行进一步说明，所举实例只用于解释本发明，但不应理解为对本发明的限制，对本发明所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023]本实施例提供了一种使用了等渗透压平衡培养液的将鲫鱼从四倍体加倍到八倍体的诱导方法。
[0024]等渗透压平衡培养液的配方为:等渗透压平衡培养液，特征在于由以下组分构成:硝酸钙90-100mg/L，无水硫酸镁50-60mg/L，无水磷酸二氢钠650_700mg/L，氯化钾400-450mg/L,氯化钠 8000_8500mg/L，葡萄糖 6000_6500mg/L，余量为去离子水。
[0025]本实施例中所用动物品种为四倍体的鲫鱼，所属长丰鲫，为本单位培育；所采用的用来受精卵子的精子取自雄性兴国红鲤(养殖于中国水产科学研宄院长江水产研宄所)。注射用复方绒促性素B型购自宁波三生药业有限公司。本实施例所述的技术方案，如未特别说明，均为常规技术手段；所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
[0026]本实施例的八倍体鲫鱼的诱导方法，步骤如下:
[0027]S31催产获得成熟卵
[0028]将四倍体鲫鱼在春季时置于16°C以上水温可使其生长达到性成熟状态；使用注射用复方绒促性素B型，按药品规定计量进行注射催产，获取成熟卵。
[0029]鲫鱼成熟卵提取过程如下:(1)杀掉性成熟鲫鱼，取出成熟卵；(2)将成熟卵置于研钵中研磨；(3)将研磨后的卵浆置入50mL离心管中，4000-5000g离心1min后，取上清液；(4)-20 °C储存备用。
[0030]另取少量四倍体鲫鱼成熟卵进行染色体制片拍照，作为对照组，结果如图1所示。
[0031]S32授精获得受精卵
[0032]挤取雄性兴国红鲤精液lmL，对I尾鲫鱼的成熟卵进行授精，采用常规授精方式，获取已授精的受精卵。
[0033]S33胚胎发育
[0034]授精完成Imin后，将受精卵均匀散布在网片上，置于18_23°C温水中进行胚胎发育。
[0035]S34选取卵裂期的受精卵
[0036]对受精卵进行镜检，当胚盘高度隆起时，受精卵出现稍显凹陷的卵裂沟，说明此时该受精卵已接近第一次有丝分裂中后期，第一次卵裂即将发生。在受精卵在18-23?温水中发育50-65min后，可以观测到受精卵形成的单细胞球出现凹陷的卵裂沟。
[0037]S35放入等渗透压平衡培养液(等渗营养液)中进行热处理
[0038]将出现凹陷卵裂沟的受精卵放入等渗营养液中进行热处理，温度保持在40.5-41.5°C，处理时间为80-105秒。每增加一升热处理液则相应添加S32步骤中基于成熟卵的提取液体lmL，添加鲫鱼成熟卵提取液的目的在于补充卵发育所需营养。
[0039]等渗透压平衡培养液配方如下:硝酸钙90-100mg/L，无水硫酸镁50_60mg/L，无水磷酸二氢钠650_700mg/L，氯化钾400_450mg/L，氯化钠8000_8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L,体积余量用去尚子水补足。
[0040]S36在等渗透压平衡培养液(等渗营养液)中继续培养
[0041]将热处理过的受精卵在18_23°C的等渗营养液中继续培养，直至孵化出鱼苗。
[0042]S37制片观察
[0043]将鱼苗取样，进行染色体制片、染色以及观察、拍照，确定其倍性，结果如图2显不O
[0044]具体染色体制片过程如下:
[0045](I)预处理
[0046]取50-100粒发育至原肠期晚期的鱼卵，置于1mL的小烧杯中，用8%的生理盐水清洗两遍，清洗时用大口吸管吸打鱼卵，除去鱼卵表面污物。
[0047](2)细胞收集和培养
[0048]清洗清洗完毕后，将生理盐水弃去。用宽头镊快速将鱼卵夹破，致使细胞游离出。加入5mL含1640培养基的细胞培养液，每晕升细胞培养液含1g秋水仙素和100U的氨节青霉素。用巴斯德吸管反复吹吸形成细胞悬液。用100目的正方形筛絹网过滤，收集筛絹网上细胞悬液，转移至5mL离心管中。常温下处理45秒后，4000g离心5min。操作过程中隔时吹吸，使细胞保持悬浮状态。
[0049](3)低渗细胞破裂
[0050]离心后弃去上清液，留0.5mL细胞沉淀。虽然用手轻敲管底部，使细胞重悬。随后加入4ml0.0375mol氯化钾溶液，低渗处理25min。
[0051](4)固定
[0052]加入0.5-lmL卡诺式固定液(甲醇:冰乙醇体积比为3:1)，习惯吹吸混匀，4000g离心5min，弃去上清液，留0.5mL细胞液，加入4-5mL新鲜固定液，重悬。静置20min，4000g离心5min。重复固定两次。
[0053](5)滴片
[0054]弃去上清液，留0.5mL细胞液，加入l_3mL新鲜固定液，重悬。取冷冻玻片，吸取细胞悬液滴2-3滴至玻片上，轻轻吹动使细胞铺散开。倾斜放置，待其自然干燥。
[0055](6)染色
[0056]吉姆萨(Giemsa)染液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)染色lOmin，纯净水洗，自然晾干。
[0057](7)镜检与拍照
[0058]利用奥林巴斯CX31显微镜进行镜检，计数染色体数目。得到结果受精卵成活率为
0.02%,染色体加倍率为60%。
[0059]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种等渗透压平衡培养液，其特征在于:所述培养液用于诱导鲫鱼染色体的加倍；所述等渗透压平衡培养液由以下组分构成:硝酸钙90-100mg/L，无水硫酸镁50-60mg/L，无水磷酸二氢钠650_700mg/L，氯化钾400_450mg/L，氯化钠8000_8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L,余量为水。
2.如权利要求1所述的一种等渗透压平衡培养液，其特征在于，所述鲫鱼为四倍体鲫鱼。
3.一种诱导鱼类染色体加倍的方法，其特征在于:所述鱼类为鲫鱼；所述诱导方法包括以下步骤: Sll催产获得成熟卵，S12授精获得受精卵，S13第一次卵裂出现前放入如权利要求1所述的等渗透压平衡培养液中进行热处理，S14胚胎发育，S15在所述等渗透压平衡培养液中进行培养直至出现鱼苗；S16取样检测鱼苗染色体倍数。
4.如权利要求3所述的一种诱导鱼类染色体加倍的方法，其特征在于:所述鲫鱼为四倍体鲫鱼。
5.如权利要求4所述的一种诱导鱼类染色体加倍的方法，其特征在于:每尾鲫鱼怀卵量为3-5万卵。
6.如权利要求4所述的一种诱导鱼类染色体加倍的方法，其特征在于:所述S13步骤中的所述等渗透压平衡培养液中热处理温度为41.5-42.5°C，培养时间为80-105秒。
7.如权利要求4所述的一种诱导鱼类染色体加倍的方法，其特征在于: 所述Sll步骤中采用注射用复方绒促性素B型，按药品规定剂量进行注射催产，获取成熟卵； 所述S13步骤中所述授精过程完成后等待lmin，再进行步骤S14放入所述等渗透压平衡培养液中，对其进行所述热处理； 所述步骤S14中所述热处理后向所述等渗透压平衡培养液中添加鲫鱼成熟卵提取促使胚胎发育，每升热处理液添加鲫鱼成熟卵提取液ImL ; 所述S15步骤中所述培养的温度为18-25°C，时间为50-65分钟。
【文档编号】C12N5/073GK104498429SQ201410770998
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】李忠, 梁宏伟, 邹桂伟, 罗相忠 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所