利用囊胚腔液游离dna检测胚胎染色体异常的方法

利用囊胚腔液游离dna检测胚胎染色体异常的方法
【专利摘要】本发明涉及利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步骤：囊胚腔液游离DNA的获取、囊胚腔液DNA的检测、游离DNA全基因组扩增、全基因组扩增产物分析、基因组DNA进行片段化处理、片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析、文库构建、上机测序、生物信息分析。本发明采用的高通量测序法避免了传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，能完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；同时，使用囊胚腔液游离DNA作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常的概率小，能保证胚胎在后续发育中不会受到影响。
【专利说明】利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及分子细胞生物学领域，具体地说，是利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎 染色体异常的方法。 【【背景技术】】
[0002] 生物体内产生的某些特定生物标志物，诸如蛋白质、肽、脂质、RNA、DNA和他们的变 体与修饰，可应用于疾病的诊断、预后和治疗。这些生物标志物可存在于多种体液中，包括 血液、血浆、血清、母乳、腹水和尿液等，已被应用于癌症（前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、 卵巢癌、食道癌、结肠癌等）、类似癌症、B细胞淋巴瘤、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、性朊 病毒疾病等相关疾病和遗传病检测。目前已经发现在孕妇外周血含有胎儿的循环游离DNA， 并通过胎儿游离DNA来检测胎儿的染色体是否存在异常，此项技术已被广泛应用于临床。 而在肿瘤患者的血液中发现的肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)目前也正在进行深入研究，有望 被应用于肿瘤的临床检测和预后治疗。
[0003] 基于以往的研究，用囊胚腔液游离DNA代替胚胎单个细胞进行胚胎植入前的检测 成为可能，胚胎植入前遗传学检测是指胚胎植入着床之前，对体外受精的胚胎进行染色体 数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎染色体的结构和数目，分析胚胎是否有遗传 物质异常的一种早期产前筛查方法。传统的胚胎植入前遗传学筛查主要采用的样本是卵裂 期单卵裂球1-2个或囊胚期滋养外胚层细胞5-10个。这种通过取卵裂期或囊胚期单细胞 进行胚胎植入前染色体筛查在临床应用较多，但是没有大量的临床数据证明，卵裂期或者 囊胚期的单细胞取材对胚胎后期发育是否存在影响，因此在临床上寻找一种更安全的、对 胚胎没有任何影响的检测标志物非常有必要。
[0004] 目前，相对于Array-CGH，高通量测序技术在胚胎植入前检测上的应用已被证实更 加准确、高效，因此利用囊胚腔游离DNA结合高通量测序技术进行胚胎植入前检测在取材 和检测方式上更具优势。而这首先需要建立通过囊胚腔液游离DNA高通量测序进行染色体 异常检测的流程。本发明通过对小鼠囊胚腔液的检测，发现在小鼠囊胚腔液中也存在游离 的DNA，并对DNA进行基因组扩增，利用高通量测序技术，对扩增产物基因组DNA进行测序并 进行生物信息学分析，与单细胞测序结果进行比较分析，结果无明显差异。这使得应用二代 测序技术对人的囊胚腔液DNA进行胚胎植入前染色体检测迈出了一大步。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供基于非治疗目的的利用胚囊腔液游 离DNA检测胚胎染色体异常的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007] 基于非治疗目的利用胚囊腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步 骤：
[0008] (1)囊胚腔液游离DNA的获取：使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸取，得到囊胚 腔液游离DNA。
[0009] ⑵囊胚腔液DNA的检测：使用实时荧光定量PCR的方法，检测囊胚腔液微量DNA 的存在。
[0010] (3)游离DNA全基因组扩增：对分离得到的囊胚腔液游离DNA，使用D0P-PCR法，利 用3'端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来 决定特异的扩增起始位点，进行全基因组DNA扩增，以达到二代测序技术所要求的DNA起始 量。
[0011] (4)全基因组扩增产物分析：对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显 示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验； 所述定量分析方法为琼脂糖凝胶电泳、Agilent2100Bioanalyzer检测或QubitdsDNAHS AssayKit。
[0012] (5)基因组DNA进行片段化处理：使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合 Ion Proton测序系统上机需要的片段大小，所述基因组DNA为囊胚腔液游离DNA使用Sigma 基因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物。
[0013] (6)片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析：对于片段化后的DNA，使用 Qubit dsDNA HS Assay Kit 进行定量分析，使用 Agilent 2100Bioanalyzer 检测进行片段 大小分析。
[0014] (7)文库构建：采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建 处理；具体文库构建流程参考Life Tech的Ion Proton Library Protocol进行文库构建。
[0015] (8)上机测序：文库质检合格后，采用二代测序技术进行DNA测序，所述测序技 术为 Illumina Hiseq 2000 测序系统、AB Solid 4.0 测序系统、Roche GSFLX Titanium System 系统或 Life Technologies Ion Proton。
[0016] (9)生物信息分析：对测序结果进行生物信息分析，通过对囊胚腔液游离DNA和正 常胚胎的测序数据进行分析、研究和比较来检测胚胎染色体是否异常。
[0017] 注：本发明的方法为应用于实验室科研及筛选，为非诊断或治疗目的发明。
[0018] 本发明的目的是利用囊胚腔液游离DNA建立囊胚腔液高通量测序流程，以取代胚 胎单细胞测序，作为胚胎植入前检测的新方法。
[0019] 本发明提取了小鼠囊胚腔液体，用荧光定量PCR进行目的片段的检测，证实了小 鼠囊胚腔液中存在游离的基因组DNA。
[0020] 本发明进一步将囊胚腔液游离DNA测序与囊胚腔细胞测序结果进行比较分析，证 实了囊胚腔液DNA测序结果与单细胞测序结果无明显差异，操作流程如下：
[0021] a、分离小鼠囊胚单细胞并进行裂解，得到完整的细胞基因组DNA;在显微操作条 件下进行小鼠囊胚腔液游离DNA的抽取，获得微量基因组DNA。
[0022] b、进行单细胞和囊胚腔液DNA进行全基因组扩增
[0023] 高通量测序技术要求起始DNA量为微克级别水平，需要经过全基因组扩增技术 (WGA)，使DNA量达到能够进行上机测序的要求。已知的全基因组扩增技术包括两大类：基 于PCR基础的WGA技术和基于等温反应基础的WGA技术，基于PCR基础的WGA技术包括： PEP、D0P-PCR、LM-PCR和MALBAC，基于等温反应基础的WGA技术如：PWGA、多重链置换扩增 (MDA，MultipleDisplancementAmplification)，本发明使用的D0P-PCR扩增技术，在全基 因组扩增后进行质检和筛选，保证扩增后的产物可以进行基因组测序。
[0024] c、对扩增产物进行定量检测及定性检测
[0025] 扩增产物定量检测和定性分析的方法主要有琼脂糖凝胶电泳法，Agilent2100生 物分析法，荧光定量PCR等等。
[0026] d、检测合格的样品进行片段化处理
[0027] 全基因组DNA进行片段化处理的方法有雾化、超声片段化法以及酶切处理法等， 这些方法可以将基因组DNA处理成175bp左右的片段。
[0028] e、片段化DNA文库构建并测序
[0029] 片段化的DNA经过末端修饰，使用末端修复酶进行修复处理，以产生平端化的 DNA，然后使用该试剂盒的连接酶，在DNA两端加上接头，以此为模板进行PCR扩增。将扩增 产物进行高通量测序，通过数据分析比较囊胚腔液DNA测序与囊胚细胞测序的区别。
[0030] 在此基础上，本发明还公布了一种利用小鼠囊胚腔液进行测序分析从而检测小鼠 胚胎染色体异常的方法。
[0031] 本发明优点在于：利用本发明能高效地利用小鼠囊胚腔液DNA基因组进行分析和 研究。一方面，采用的高通量测序法避免了传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部 分区域进行研究的不足，完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；另一 方面，使用囊胚腔液游离DNA作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常 的概率小，能够保证胚胎在后续发育过程中不会受到影响。 【【专利附图】

【附图说明】】
[0032] 附图1是本发明的小鼠囊胚腔液DNA取样过程。
[0033] 附图2是本发明实施例2中的小鼠胚胎单细胞基因组测序数据在每条染色体的覆 盖率情况。（15x)
[0034] 附图3是本发明实施例2中的小鼠胚囊腔液DNA基因组测序数据在每条常染色体 的覆盖率情况。（15x)
[0035] 附图4是本发明实施例2中的小鼠胚胎单细胞基因组测序数据在每条染色体的平 均测序深度情况。
[0036] 附图5是本发明实施例2中小鼠胚囊腔液DNA基因组测序数据在每条常染色体的 平均测序深度情况。
[0037] 附图6是小鼠胚胎单细胞测序和小鼠囊胚腔液DNA测序进行9号染色体缺失分 析。
[0038] 附图7是小鼠胚胎单细胞测序和小鼠囊胚腔液DNA测序进行5号染色体重复分 析。 【【具体实施方式】】
[0039] 本发明公开了一种能够利用囊胚腔液游离DNA进行全基因组DNA扩增并进行高通 量测序的方法，本发明的方法如下：
[0040] 1.小鼠囊胚腔液游离DNA的获取
[0041] 囊胚腔液游离DNA的获取：在显微操作仪下，使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸 取，得到囊胚腔液游离DNA。
[0042] 2.小鼠囊胚腔液DNA的检测
[0043] 小鼠囊胚腔液DNA的检测方法，采用实时荧光定量PCR的方法，荧光定量PCR可以 用来检测微量DNA的存在，检测方法灵敏、准确。
[0044] 3.游离DNA全基因组扩增
[0045] 对分离得到的胚胎单细胞和囊胚腔液游离DNA，进行全基因组DNA扩增，以达到二 代测序技术所要求的DNA起始量。本发明主要使用D0P-PCR法，此方法对主要是利用3'端 ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来决定特异 的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。
[0046] 4?全基因组扩增产物分析
[0047] 可以采用琼脂糖凝胶电泳、Agilent2100Bioanalyzer检测、QubitdsDNAHS AssayKit等方法对扩增的基因组DNA进行定量分析，检测结果显示无降解、无污染、符合 二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验。
[0048] 5.基因组DNA进行片段化处理
[0049] 本发明主要使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合IonProton测序系统上 机需要的片段大小，基因组DNA主要为小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液游离DNA使用Sigma 基因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物。
[0050] 6.片段化目的DNA进行分析和定量
[0051] 对于片段化后的DNA，主要采用琼脂糖凝胶电泳、Agilent2100Bioanalyzer检 测、QubitdsDNAHSAssayKit等方法进行片段大小分析和定量分析。本发明使用Qubit dsDNAHSAssayKit进行定量分析、Agilent2100Bioanalyzer检测进行片段大小分析。
[0052] 7?文库构建
[0053] 采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建处理，具体文库 构建流程参考LifeTech的IonProtonLibraryProtocol进行文库构建。
[0054] 8?上机测序
[0055] 文库质检合格后，采用二代测序技术进行基因组DNA测序，如IlluminaHiseq 2000 测序系统、ABSolid4.0 测序系统化、RocheGSFLXTitaniumSystem系统和Life TechnologiesIonProton等测序仪，本发明使用IonProton测序系统。
[0056] 9.生物信息分析
[0057] 对测序结果进行生物信息分析，通过对小鼠囊胚腔液游离DNA和小鼠单细胞基因 组的测序数据进行分析、研究和比较。
[0058] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0059] 实施例1小鼠囊胚腔液游离DNA检测
[0060] (1)囊胚腔液收集
[0061] 小鼠囊胚腔液的获得及处理：小鼠囊胚腔液DNA的获取和小鼠单细胞的获得是同 一个小鼠胚胎，以便于进行试验结果比较。在显微操作实验室内，室温条件下，采用微穿刺 技术取样。在吸取囊胚腔液DNA过程中，避免细胞质污染和滋养层细胞受损。小鼠囊胚腔 液DNA取样过程如图1所示。
[0062] (2)目标基因和引物设计
[0063] 使用GAPH和TBCD两个基因作为检测基因，设计引物进行定量分析检测。GAPDH和 TBCD两个基因的扩增片段大小为100bp和120bp。
[0064] 扩增引物序列如下。
[0065] GAPDH：
[0066] PITGTCTCACCTTATTAGCC
[0067] P2 CCGCAAAGATTTTCAGAG
[0068] TBCD:
[0069] P3 CTGCGAGCGCCGCCGAGG
[0070] P4 TGTGCACCGCCGGCAAGC
[0071] (3)Real-timePCR检测
[0072] 荧光定量PCR的反应体系：
[0073] 含有 PBS 的囊胚腔液（?)，PI、P2、P3、P4 各 0? l(10iimol)，SYBRGreen 10iil，PCR TagMIX 15iU，总的体系为30iU。轻弹管底将溶液混匀，短暂离心。反应体系 配置操作时不要碰到PCR管，整个反应体系配置在冰上进行。荧光定量PCR的反应条件： 94°C lmin，{94°C 30s，50°C 30s，72°C 30s(40cycles)}。
[0074] (4) PCR产物检测分析
[0075] 溶解曲线显示结果均有单峰存在，配置2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以电 压100V电泳30min，检测结果显示在100bp和120bp处有目的条带出现，说明囊胚液存在游 离 DNA。
[0076] 实施例2
[0077] 小鼠基因组测序覆盖度比较（小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液DNA)
[0078] (1)单细胞分离和囊胚腔液DNA获得及处理：
[0079] 挑取10个小鼠胚胎单细胞样本和10个小鼠囊胚腔液样本，每个小鼠胚胎单细胞 样本和小鼠囊胚腔液样本分别 对应，来自同一个小鼠胚胎。
[0080] a.小鼠胚胎单细胞分离及处理：在显微镜下，通过激光打孔技术分离出单个细 胞，分离的单个细胞放入含有不到2 yl PBS的200 yl PCR管中，加水至终体积为9 yl。 向PCR管中加入lyl新鲜配置好的细胞裂解缓冲液，混匀。将得到的混合液进行孵育： 50°C lh，99°C 4min，15°C hold，置于冰上冷却，离心。
[0081] b.小鼠囊胚腔液的获得及处理：小鼠囊胚腔液DNA的获取和小鼠单细胞的获得是 同一个胚胎，以便进行试验结果比较，在显微操作实验室内，室温条件下，采用微穿刺技术 进行取样。在吸取囊胚腔液DNA的过程中，避免细胞质污染和滋养层细胞受损。
[0082] (2)D0P-PCR全基因扩增
[0083] a :使用 Sigma公司的GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒。在含有单细胞DNA的PCR管中（步骤1的产物）加入2 ill lx Single Cell Library Preparation Buffer,再力口入 1 y 1 Library Stabilization Solution,混勻，95°C2min，15°C hold。置冰上冷却，离心，再置冰上。加入1 ul Library Preparation Enzyme，混勻并短暂离心。加热样品：16°C 20min，24°C 20min，37°C 20min， 75〇C 5min, 15°C hold〇
[0084] b :向产物加入 7. 5 u 1 lOx Amplification Master Mix、48. 5 u 1 水、5 u 1 的 DNA Polymerase,混合均勻，离心，进行扩增，条件如下：
[0085] 95°C 3min，{94°C 30s，65°C 5min (25cycle) }，15°C hold。
[0086] c :扩增产物进行纯化，去掉离子和杂质等。
[0087] (3)扩增产物质检：
[0088] 使用QubitdsDNA HS AssayKit检测扩增产物浓度，按照试剂盒说明书进行操 作。检测合格的产物，即总量超过1 U 1的产物，进行DNA文库构建及上机测序。经检测，本 发明中单细胞样本扩增产物均大于1U 1，囊胚腔液样本有9个扩增成功，其中1个样本浓度 低于500ng，该样本我们也进行了后续的建库和测序。
[0089] (4)片段化处理：
[0090] 按照NEB Next dsDNA Fragmentase试剂盒说明书进行试验操作，片段化处理结 束，使用 Qubit dsDNA HS Assay Kit 和 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行结构分析。
[0091] (5)文库构建及上机测序
[0092] 处理好的DNA样品，采用IonProtonLibraryProtocol文库构建方法进行上机 测序前文库构建处理，文库构建流程包括末端补平、连接反应和PCR扩增反应，文库构建产 物进行质检，质检合格后，采用IonProton测序系统进行小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液 DNA测序分析。
[0093] (6)生物信息分析
[0094] 用15x的测序数据量进行统计分析，将测序所得序列与小鼠基因组进行比对分 析，统计各样本的覆盖率以及测序深度。图2为小鼠胚胎单细胞基因组测序覆盖率；图3为 小鼠囊胚腔液游离DNA基因组测序覆盖率；图4为小鼠胚胎单细胞基因组测序平均深度； 图5为小鼠囊胚腔液游离DNA基因组测序平均深度。结果显示1个囊胚腔液样本的覆盖率 明显偏低，可能是由于单细胞扩增失败导致，其余囊胚腔液样本与单细胞样本分析结果无 明显区别，说明囊胚腔液样本可取代单细胞样本进行染色体分析。10例小鼠囊胚单细胞及 小鼠囊胚腔液DNA测序覆盖率和平均深度见表1。
[0095] 表1 10例小鼠囊胚单细胞及小鼠囊胚腔液DNA测序覆盖率和平均深度统计表
[0096]
【权利要求】
1.基于非治疗目的利用胚囊腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 囊胚腔液游离DNA的获取：使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸取，得到囊胚腔液 游离DNA ; (2) 囊胚腔液DNA的检测：使用实时荧光定量PCR的方法，检测囊胚腔液微量DNA的存 在； (3) 游离DNA全基因组扩增：对分离得到的囊胚腔液游离DNA，使用DOP-PCR法，利用3' 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来决定特 异的扩增起始位点，进行全基因组DNA扩增，以达到二代测序技术所要求的DNA起始量； (4) 全基因组扩增产物分析：对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示 无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验；所 述定量分析方法为琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100Bioanalyzer检测或Qubit dsDNA HS Assay Kit ； (5) 基因组DNA进行片段化处理：使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合Ion Proton测序系统上机需要的片段大小，所述基因组DNA为囊胚腔液游离DNA使用Sigma基 因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物； (6) 片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析：对于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量分析，使用Agilent 2100Bioanalyzer检测进行片段大小分 析； (7) 文库构建：采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建处 理； (8) 上机测序：文库质检合格后，采用二代测序技术进行DNA测序，所述测序技术为 Illumina Hiseq 2000 测序系统、AB Solid 4. 0 测序系统、RocheGSFLX Titanium System 系统或 Life Technologies Ion Proton ； (9) 生物信息分析：对测序结果进行生物信息分析，通过对囊胚腔液游离DNA和正常胚 胎的测序数据进行分析、研究和比较来检测胚胎染色体是否异常。
【文档编号】C12Q1/68GK104450923SQ201410771006
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】梁波, 孔令印, 冒艳, 杨晴, 吴小娟 申请人:赛业健康研究中心（太仓）有限公司