一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法，包括以下步骤：a)初筛待检测染色体的特异位点；b)选取健康人群的单细胞样本；c)利用全基因组随机引物对单细胞样本进行等温置换扩增；d)将单细胞扩增后的样本进行文库构建并进行高通量测序；e)对测序结果进行比对分析，统计不同人同一特异位点上获得的数据量，筛选数据量比较均一的特异位点；f)利用筛选出的特异位点对待测样本进行染色体非整倍体检测。本发明克服了现有检测技术针对整个基因组的所有染色体进行高通量测序需要测量大量无关数据的缺陷，可显著的提高检测的通量，从而降低检测成本，快速简便，有助于染色体非整倍体检测的大规模推广。
【专利说明】一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体 非整倍体检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种利用染色体特异位点在单细胞扩 增基础上进行染色体非整倍体检测的方法。
【背景技术】
[0002] 不孕不育是遍及全球的生殖健康问题，近年来不孕症患者呈逐年增长趋势。1995 年世界卫生组织人类生殖特别规划署的统计显示，全球不孕夫妇已达6000-8000万对，中 国不孕夫妇约1200-1500万对，占育龄人群中的15-20%。辅助生殖技术已成为目前治疗不 孕不育的主要手段。
[0003] 然而，根据国际权威统计，试管婴儿手术的平均成功率只有30%左右，如何提高试 管婴儿的成功率是当前急需解决的难题。而通过研究发现，试管婴儿失败绝大部分归因于 植入胚胎本身的问题。现代社会，随着工作压力的不断增加，越来越多的女性推迟生育年 龄，在不孕症夫妇中，高龄妇女占20% -30%，经辅助生殖治疗后成功率只有20 %左右，而 年轻的妇女成功率可达40% -50%。主要原因在于随着年龄的增加卵母细胞的质量明显下 降，卵母细胞非整倍体率明显增加。由于植入的成功率低，很多妇女要承受反复着床失败的 痛苦。
[0004] 为了提高试管婴儿的成功率，临床上针对一些高龄、反复种植失败、习惯性流产的 人群进行胚胎植入前的检测，在胚胎植入母体之前，对其遗传物质进行分析，选择遗传背景 正常的胚胎植入，提高妊娠成功率，避免缺陷患儿的出生，减轻家庭和社会的经济负担。
[0005] 目前临床上常用的胚胎植入前检测技术是荧光原位杂交（FISH)、比较基因组杂交 (CGH)。然而这两种技术都存在一定的局限，FISH技术目前存在的问题在于无法一次性检测 所有染色体，操作繁琐，分辨率低；CGH的缺点在于只能检测已知的染色体异常，并且费用 昂贵。近年来，随着二代测序技术的发展，很多研究机构开始将二代测序技术应用于胚胎植 入前的检测，经验证，其准确度和检测通量方面均优于传统技术。目前通过二代测序进行胚 胎植入前检测的常规操作，首先是要分离胚胎的少量细胞，对这些细胞进行全基因组扩增， 构建测序文库进行测序。操作步骤较多，耗时较长，易出现操作错误，而且要经过多次扩增， 其引入的一些扩增偏好性和扩增错误也可能导致检测结果不准确。因此临床上需要开发一 种更简单快速且成本低廉的检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种非治疗目的的利用染色体特异 位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] -种非治疗目的的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍 体检测的方法，包括以下步骤：
[0009] a)根据已经公布的人类基因组序列，从待检测的染色体上筛选得到初筛特异位 占.
[0010] b)选取健康人群的单细胞样本；
[0011] C)利用全基因组随机引物对所述的单细胞样本进行等温置换扩增；
[0012] d)根据初筛特异位点设计引物，将单细胞扩增后的样本利用所述的引物进行文库 构建并进行高通量测序；
[0013] e)对测序结果进行比对分析，统计不同人同一特异位点上获得的数据量，选择出 数据量比较均一的特异位点，得到复筛特异位点；
[0014] f)对待测样本进行染色体非整倍体检测：对待测样本的单细胞进行等温置换扩 增；将单细胞扩增后的样本利用复筛特异位点的引物进行文库构建并进行高通量测序；根 据不同染色体上各位点的reads数差异判断待测样本的染色体非整倍性。
[0015] 步骤a)中，所述的初筛特异位点符合以下标准：
[0016] a)序列长度的范围为150-200bp ;
[0017] b) GC含量在45 %?55 %之间；
[0018] c)序列中不包含字符"N"；
[0019] d)与单核苷酸多态性位点库进行比较，序列中不存在任何单核苷酸多态性位点；
[0020] e)与基因组变异数据库中拷贝数变异信息进行比较，所述的初筛特异位点不能包 含在任何已知的拷贝数变异中；
[0021] f)两初筛特异位点片段间不能有超过l〇bp的同源序列，且Tm值相差在4度以内。
[0022] 步骤b)中，所述的单细胞样本是口腔上皮细胞的单细胞样本。
[0023] 步骤b)中，所述的单细胞样本的数目大于或等于100个。
[0024] 所述的复筛特异位点在所有单细胞样本中的标准方差< 20。
[0025] 步骤f)中，统计不同染色体上各复筛特异位点的reads数时，通过值平滑算法对 每个复筛特异位点的片段数量进行标准化，最后根据如下公式计算待测样本的其中一条待 测染色体值：
【权利要求】
1. 一种非治疗目的的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体 检测的方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 根据已经公布的人类基因组序列，从待检测的染色体上筛选得到初筛特异位点； b) 选取健康人群的单细胞样本； c) 利用全基因组随机引物对所述的单细胞样本进行等温置换扩增； d) 根据初筛特异位点设计引物，将单细胞扩增后的样本利用所述的引物进行文库构建 并进行高通量测序； e) 对测序结果进行比对分析，统计不同人同一特异位点上获得的数据量，选择出数据 量比较均一的特异位点，得到复筛特异位点； f) 对待测样本进行染色体非整倍体检测：对待测样本的单细胞进行等温置换扩增；将 单细胞扩增后的样本利用复筛特异位点的引物进行文库构建并进行高通量测序；根据不同 染色体上各位点的reads数差异判断待测样本的染色体非整倍性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的初筛特异位点符合以下 标准： a) 序列长度的范围为150-200bp; b) GC含量在45%?55%之间； c) 序列中不包含字符"N"； d) 与单核苷酸多态性位点库进行比较，序列中不存在任何单核苷酸多态性位点； e) 与基因组变异数据库中拷贝数变异信息进行比较，所述的初筛特异位点不能包含在 任何已知的拷贝数变异中； f) 两初筛特异位点片段间不能有超过IObp的同源序列，且Tm值相差在4度以内。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的单细胞样本是口腔上皮 细胞的单细胞样本。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的单细胞样本的数目大于 或等于100个。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复筛特异位点在所有单细胞样本 中的标准方差< 20。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)中，统计不同染色体上各复筛特异 位点的reads数时，通过值平滑算法对每个复筛特异位点的片段数量进行标准化，最后根 据如下公式计算待测样本的其中一条待测染色体值：
其中，Py其中一条待测染色体上复筛特异位点的标准化后的平均片段数量除以所有 待测染色体上复筛特异位点总和的标准化后的平均片段数量； Po:-个测序泳道中所有样本h的中值； Iij :各条待测染色体上复筛特异位点平均片段数量的总和； Zj:样本j的其中一条待测染色体值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的平均片段数量是按照20%切尾均 值方法计算，即去除掉10%的最低值以及10%的最高值。
【文档编号】C12Q1/68GK104450922SQ201410770910
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】梁波, 孔令印, 冒艳, 宣黎明, 申静静, 祝轶君 申请人:赛业健康研究中心（太仓）有限公司