一种具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物的制备方法与流程

本发明涉及鲍鱼食品加工技术领域，尤其涉及一种具有溶栓降压功能鲍鱼发酵产物的制作方法。

背景技术：

纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，简称纳豆菌，1905年由日本学者从日本传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的，属细菌科、芽孢杆菌属，被鉴定为枯草芽孢杆菌的一个亚种。它是对人体无病原性的安全菌株，许多研究表明，纳豆菌在发酵过程中，可以产生以纳豆激酶为典型代表的活性酶，发酵产物具有纤溶、降胆固醇、降血脂、降血压、抗菌和抗氧化等多种营养保健功能。

2014年，我国鲍鱼年产量达11.5万吨，鲍鱼因其高蛋白低脂肪，自古以来就被视为珍品，鲍鱼养殖业迅速发展，但是与之配套的加工技术一直没有跟上，这就导致了鲍鱼加工产品的单一化，因此开展鲍鱼深加工势在必行。

心脑血管疾病主要包括高脂血症、动脉粥样硬化和高血压等。据世界卫生组织统计，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，严重威胁全人类健康。临床降压药都具有较强副作用，且药效不稳定。开发具有降压功能的食品，辅助或替代药物治疗是今后健康领域重要研究趋势。

技术实现要素：

本发明的目的在于拓宽鲍鱼原料的应用，开发一种营养丰富、易于制作的功能性鲍鱼产品，从而提高鲍鱼产品的附加值，同时兼具溶栓和降压功能的复合产品。

为了达到上述目的，本发明提供了一种具有溶栓降压功能鲍鱼发酵产物的制作方法，包括如下步骤：

S1、原料预处理：取鲍鱼组织、洗净、沥干，在-30℃预冻至所述鲍鱼组织中心温度达到-30℃，冻干、粉碎，得到鲍鱼冻干粉；

S2、制作培养基：将碳源、步骤S1制得的鲍鱼冻干粉与水混合，加入NaOH调节pH至6.2～9.2，配制培养基；

所述碳源为葡萄糖、蔗糖或淀粉中的一种；制得的培养基中，所述碳源的浓度为2～5g/100mL；所述鲍鱼冻干粉的浓度为6～10g/100mL；

S3、灭菌：将步骤S2制得的培养基置于121℃环境下，灭菌15min，得到灭菌培养基；

S4、接种及发酵：待步骤S3制得的灭菌培养基冷却到30～40℃后，加入所述灭菌培养基体积2～5％的纳豆枯草芽孢杆菌菌悬液，所得灭菌培养基中纳豆枯草芽孢杆菌的终浓度为10⁶～10⁸CFU/mL；在35～44℃、通风条件下，在转速为180r/min的摇床中培养45～60h，获得鲍鱼发酵液；

S5、将步骤S4制得的鲍鱼发酵液在7000r/min下离心20min，收集上清液；将所述上清液，经浓缩、冻干，得到具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物。

优选方式下，步骤S1所述鲍鱼组织为鲍鱼腹足、鲍鱼生殖腺或鲍鱼裙边。

优选方式下，步骤S1在-30℃预冻时间为2～4h。

优选方式下，步骤S2所述碳源的浓度为3g/100mL；

优选方式下，步骤S2中，加入NaOH调节pH至7。

优选方式下，步骤S4为：待步骤S3制得的灭菌发酵混合物冷却到30～40℃后，加入所述灭菌培养基体积5％的纳豆枯草芽孢杆菌菌悬液，所得灭菌培养基中纳豆枯草芽孢杆菌的终浓度为10⁷CFU/mL；在37℃、通风条件下，在转速为180r/min的摇床中培养45～60h，获得鲍鱼发酵液。

优选方式下，步骤S5浓缩处理具体为：将所述上清液浓缩至原体积的1/5。浓缩处理可以有效缩短冻干时间。

本发明的优点在于：

1、本发明先将含有鲍鱼原料的培养基经过高压(121℃，15min)处理，提高鲍鱼原料对纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中所分泌蛋白酶的敏感度。在液态发酵体系中纳豆枯草芽孢杆菌发酵产生的多种酶系有效分解鲍鱼原料，制得的鲍鱼发酵产物中TCA可溶性寡肽可达到50％以上，更适合人体吸收。

2、本发明以鲍鱼组织为原料，采用纳豆枯草芽孢杆菌发酵，在发酵终点时发酵产物的溶栓活性高于同时间下豆粉的发酵产物，本发明方法制得的鲍鱼发酵产物具有更好的溶栓、降压、抗氧化等效果；本发明方法制得的鲍鱼发酵产物作为一种新型发酵食品，可在一定程度上替代具有较强副作用、药效不稳定的临床降压药。

3、本发明方法制得的鲍鱼发酵产物可以应用于饮品、食品和保健功能产品、医药加工等方面，拓展了鲍鱼精深加工和综合利用的途径。

4、本发明方法丰富了鲍鱼产品的加工工艺，且产物利于人体消化吸收，加工过程中，耗能低，成分少，工艺简单，适合工业化生产。

综上，与直接食用鲍鱼相比，本发明将鲍鱼组织经纳豆枯草芽孢杆菌发酵，不但可产生具有溶解血栓作用的纳豆激酶，鲍鱼蛋白还被降解成分子量更小的蛋白和多肽，利于消化吸收，同时，进一步丰富了发酵产物的功能性，使发酵产物具有溶栓降压抗氧化等多种复合功能。本发明进一步丰富了鲍鱼加工产品形式，提高了鲍鱼产品的附加值，具有一定的现实意义和深远的经济价值。

附图说明

图1是鲍鱼发酵过程中上清液中可溶性寡肽的变化；

图2是鲍鱼发酵过程中纳豆激酶活性的变化。

具体实施方式

本发明提供了一种制备具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物的方法。以鲍鱼为原料，通过纳豆枯草芽孢杆菌发酵，根据产物纳豆激酶活性和血管紧张素转换酶抑制活性控制发酵时间，对发酵产物进行离心、过滤、浓缩、冻干，制备溶栓降压鲍鱼发酵产物。将鲍鱼肉洗净处理后，冻干成粉，制得鲍鱼冻干粉；将碳源、鲍鱼冻干粉与蒸馏水混合，加入NaOH调节pH至6.2～9.2，配制培养基；所述碳源为蔗糖、葡萄糖或淀粉中的一种；制得的培养基中所述碳源的浓度为2～5g/100mL；所述鲍鱼冻干粉的浓度为6～10g/100mL。将所得的培养基在121℃条件下，灭菌15min，得到灭菌培养基。待灭菌培养基冷却后，加入2～5％的纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL。在35～44℃，震荡培养45～60h，获得鲍鱼发酵液。将上述发酵液经过7000r/min条件下，离心20min、蒸发浓缩、冻干粉碎，得到一种具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物。

实施例1

取冻干后的鲍鱼腹足，打粉，取8g，加水120mL，加入蔗糖2.4g，调整pH为7.2，在121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后，接入6mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养72h。发酵液经过7000r/min离心20min，取上清液经过浓缩、冻干、粉碎，得到具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物4.1g。

发酵过程中，每隔12h按照测试1中描述的方法检测发酵产物中TCA可溶性寡肽含量的变化，检测结果见图1。每隔12h按照测试2中的方法检测发酵产物的溶栓活性，检测结果见图2。对48h发酵产物，按照测试3中的方法检测其ACE抑制活性。

本实施例采用Folin-酚测得48h发酵产物中总蛋白含量为30mg/mL，采用测试1方法测得TCA可溶性寡肽含量20mg/mL，其中TCA可溶性寡肽占总蛋白的67％。

按照测试2及3中的方法检测48h发酵产物中纳豆激酶的溶栓活性及发酵产物的ACE抑制活性，检测结果见表1。

实施例2

取冻干后的鲍鱼组织，打粉，取8g，加水至120mL，加入葡萄糖2.5g，调整pH为8.2，在121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后，接入6mL纳豆菌菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养48h。发酵液经过7000r/min离心20min，取上清液经过浓缩、冻干、粉碎，得到具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物5.9g。

本实施例采用Folin-酚测得所得的鲍鱼发酵产物中总蛋白含量为25mg/mL，采用测试1方法测得TCA可溶性寡肽含量14mg/mL，其中TCA可溶性寡肽占56％。

按照测试2及3中的方法检测发酵产物中纳豆激酶的溶栓活性及发酵产物的ACE抑制活性，检测结果见表1。

实施例3

取冻干后的鲍鱼裙边，打粉，取8g，加水120mL，加入淀粉3g，调整pH为6.2，在121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后，接入6mL纳豆菌的菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养48h。发酵液经过7000r/min离心20min，取上清液经过浓缩、冻干、粉碎，得到具有溶栓降压功能的鲍鱼发酵产物6.1g。

本实施例采用Folin-酚测得所得鲍鱼发酵产物中总蛋白含量为29mg/mL，采用测试1方法测得TCA可溶性寡肽含量18mg/mL，其中，TCA可溶性寡肽占61％。

按照测试2及3中的方法检测发酵产物中纳豆激酶的溶栓活性及发酵产物的ACE抑制活性，检测结果见表1。

对比例

取豆粉8g，加水120mL，加入淀粉3g，调整pH为6.2，在121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后，接入6mL纳豆菌的菌悬液，终浓度为10⁷CFU/mL，在37℃，180rpm条件下，通风培养48h。发酵液经过7000r/min离心20min，取上清液经过浓缩、冻干、粉碎，得到豆粉发酵产物5.8g。

本实施例所得的豆粉发酵产物中TCA可溶性寡肽占65％以上。

按照测试2及3中的方法检测发酵产物中纳豆激酶的溶栓活性及发酵产物的ACE抑制活性，检测结果见表1。

测试1：TCA可溶性寡肽含量的测定方法如下：

通过TCA结合Folin-酚的方法测定可溶性寡肽含量，并在OD500nm下测定可溶性寡肽含量。取发酵液7000rpm离心20min，取发酵上清液1mL，加上20％TCA 1mL，室温静置20min，16500g离心15min，取上清液，进行适当稀释，取稀释后的100μL样品，加入Folin-酚甲液500μL，室温反应10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反应30min，500nm测吸光度，根据标准曲线确定可溶性寡肽含量。标准曲线绘制如下：用结晶牛血清蛋白，根据其纯度配制成0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL，依次加入500μL Folin-酚甲液，混匀。室温下放置10min，再加入50μL Folin-酚乙液，立即振荡均匀，室温下放置30min。然后，在500nm波长下，用酶标仪测定吸光度。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光值(500nm)为纵坐标，绘制标准曲线。

Folin-酚甲液的配制：(a)20g的无水Na₂CO₃，4.0g的NaOH溶于1L水中。(b)0.2g的CuSO₄·5H₂O溶于20mL水中。(c)0.4g的酒石酸钾钠溶于20mL水中。用前将三种溶液按100:1:1混合，配成Folin-酚甲液，一天内有效。

Folin-酚乙液的配制：称取钼酸钠25g，钨酸钠100g放置于2L磨口回流装置内。加入纯净水700mL，85％的磷酸50mL，浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h后再加入硫酸锂(Li₂SO₄)150g，纯净水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1L，过滤即成Folin-酚乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几min，恢复原色后仍可继续使用。乙液的贮存液在使用前应确定其酸度。用其滴定标准氢氧化钠溶液(1mol/L)，以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

测试2：纳豆激酶溶栓活性的测定

取0.7mL硼酸缓冲液(0.05M)置于样品管中，再加入0.2mL纤维蛋白原(0.72％)，于37℃水浴预5min，加入0.05mL凝血酶(1BP/mL)，37℃水浴使纤维蛋白凝固，准确计时10min，加入待测样品0.05mL，震荡5s，充分混匀后，于37℃水浴反应，分别于20min和40min时，震荡5s，充分混匀后，60min后，加入0.2M TCA溶液1mL，充分混匀，在37℃水浴保温20min后，3000r/min，离心10min，取上清，12000r/min再次离心10min。取上清于275nm测定吸光度。空白管中先加TCA震荡混匀5s以灭酶，然后加待测样品。其它操作相同。标准曲线绘制，将蚓激酶配制成0、1、2、4、6、8FU/μL的酶液，分别按照上述方法测定纳豆激酶溶栓活性，绘制标准曲线。酶活力计算，样品吸光度减空白组吸光度，代入标准曲线，计算纳豆激酶溶栓的酶活力。

测试3：ACE抑制活性的测定方法

首先，配制ACE溶液，将1U的ACE溶于冷的1M pH 8.3的硼酸盐缓冲液(含0.3M NaCl)10mL配制成0.1U/mL ACE溶液，分装，储存于-20℃，备用。配制HHL(马尿酰组氨酰亮氨酸)溶液：取HHL适量，溶于0.1M pH 8.3的硼酸盐缓冲液(含0.3M NaCl)配制成浓度为5mmol/L的HHL溶液，备用。配制马尿酸标准溶液，准确称取马尿酸标准样品，加超纯水溶解配制成浓度为50μg/mL马尿酸标准溶液，备用。于1.5mL离心管中，取25μL样品发酵液，加入25μL的ACE，漩涡震荡2min，37℃保温5min。加入50μL 5mmol/L底物HHL，37℃保温，反应1h。然后加入20μL，0.2M HCl终止反应。同时用25μL水代替样品作为空白对照组。反应液过0.45μm膜后，用HPLC(Waters)检测Hip(马尿酸)的生成量。色谱条件：Ghall 12S05-2546C18柱(250mm×4.6mm)；乙腈:水(含0.05％TFA)＝25:75，等梯度洗脱；流速0.5mL/min；检测波长228nm；进样量10μL。ACE抑制率按下式进行计算：

A:加入发酵样品组中马尿酸的峰面积；

B:空白对照组中马尿酸的峰面积。

本发明中溶栓活性主要依赖发酵产物中的纳豆激酶溶纤活性来实现，根据测试2所述方法测定纳豆激酶溶纤活性；根据测试3方法获得ACE抑制活性。ACE抑制活性可以说明发酵产物具有降压功能，ACE抑制活性越强，抑制率越高，降压活性越强。本发明的实施效果说明在发酵过程产生了降压性物质，纳豆菌发酵鲍鱼生殖腺的产物具有较强的溶栓和降压活性，对心血管疾病具有潜在的辅助治疗作用。

表1是本发明实施例制得的鲍鱼发酵产物在溶栓活性及ACE抑制活性测试中的检测数据。

表1

从表1中，可以发现，本发明制得的鲍鱼发酵产物具有溶栓降压效果，能够用于高血压及血栓性疾病的辅助治疗和控制。与对比例相比，本发明实施例制得的产品溶栓活更强更好。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。