一种低非淀粉多糖的花生蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及一种低非淀粉多糖的花生蛋白及其制备方法，属于动物饲料领域。

背景技术：

花生粕是花生仁经高温压榨提油后的副产品，含有丰富的植物蛋白。花生粕的营养价值较高，2015年，中国花生粕产量300多万吨，蛋白含量高达48％左右，是潜在的重要饲料蛋白。然而，花生粕存在约占总量的30％的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides，NSP)，主要包括纤维素、半纤维素和果胶等，半纤维素又包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖等。非淀粉多糖在动物小肠内会增加食糜粘性，阻碍营养物质和消化酶的结合；由于食糜通过速度与消化率的降低，为细菌特别是致病菌的繁殖提供了有利条件，可导致动物腹泻率增加、刺激肠道粘膜层增厚，损害微绒毛，减少养分吸收；此外，大量的非淀粉多糖会充当营养稀释剂作用，降低了饲料的能量，导致饲料表观代谢能降低。

目前已有申请号为201510583133.0和200810202911.7等专利中所述。对于降解非淀粉多糖的思路都是在饲料原料中直接添加复合酶制剂，和饲料复配后一同进食到动物的肠胃中，然后在肠胃的大环境中发生酶解反应，降解非淀粉多糖，消除其部分抗营养作用。这些专利存在以下不足：(1)由于在动物的肠胃中尤其是在胃中，酸性极强，不是复合酶制剂中各单一酶的最适反应条件，这种体外添加、体内起作用的方法对于降解非淀粉多糖的效果极其有限；(2)部分未降解的非淀粉多糖与营养素充分结合，从而影响营养素的消化、吸收，影响饲料利用率；(3)饲料原料的非淀粉多糖组成存在差异，未针对花生粕进行非淀粉多糖降解酶进行特异开发。针对这些不足，有必要进行花生粕非淀粉多糖降解酶的特异性复配，通过发酵技术进行动物体外降解，非淀粉多糖降解率高，同时降解产物可以被有益微生物转化成有益代谢产物，起到调节动物生长性能和免疫性能的作用。

花生蛋白分为两大类：水溶性蛋白和盐溶性蛋白，其中约有10％的蛋白质是水溶性蛋白，其余的90％为盐溶性蛋白。花生粕中优质蛋白不足，不利于动物消化吸收的大分子蛋白偏多；花生粕肽的含量偏少，跟鱼粉、发酵豆粕等市场上主要的饲料蛋白原料相比，蛋白质的可消化吸收率较低。另外，花生粕中缺乏赖氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸，赖氨酸是花生粕的第一限制性氨基酸；当花生粕中的可利用赖氨酸不足时，用它来替代豆粕饲喂鸡、猪等单胃动物就会降低动物的生长性能。花生粕蛋白的这些缺陷，严重影响了花生粕在饲料行业的高效利用。

目前在对花生粕的利用上，专利201410283363.0的利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，虽然能够得到多肽和乳酸含量较高的饲料，但是其非淀粉多糖含量约占总量的20％以上。此外，本研究组在中国发明专利申请号为201510662262.9的专利申请中，将绿色木霉、枯草芽孢杆菌和干酪乳酸菌接种于花生粕上，能够获得黄曲霉毒素B₁无检出、多肽丰富的花生粕，但未对非淀粉多糖进行处理。

综上，有效提高非淀粉多糖含量以提高动物对饲料蛋白的利用率以及提高花生粕中必需氨基酸是目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种低非淀粉多糖的花生蛋白及其制备方法。

本发明的低非淀粉多糖的花生蛋白的制备方法，依次包括如下步骤：将花生粕原料加水灭菌后，接种解淀粉芽孢杆菌发酵一段时间，然后再加一定量的水和复合酶制剂进行酶解，酶解后升温灭酶，冷却，加入活化后的乳酸菌或者同时加入酵母菌，半固态发酵，发酵结束后固液分离、烘干、粉碎，即得到花生蛋白。

在一种实施方式中，所述花生粕加水灭菌，是按照1:(0.6～1)的料水比添加水。

在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌的接种量为2～5wt％(比如100g花生粕原料添加2～5g解淀粉芽孢杆菌种子液)。

在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌发酵的时间为60～84h。

在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌发酵是在32～40℃下进行。

在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌发酵后加入的水，是加水至料水比1:(2.5～3.5)。

在一种实施方式中，所述复合酶制剂中含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶。

在一种实施方式中，所述纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的添加量为50～150U/g；果胶酶的添加量为100-300U/g。

在一种实施方式中，所述酶解的条件为：45～55℃下酶解反应3～5h。

在一种实施方式中，所述乳酸菌的接种量为4-8wt％。

在一种实施方式中，所述酵母菌的接种量为2-5wt％。

在一种实施方式中，所述酵母菌为酿酒酵母。

在一种实施方式中，所述半固态发酵是在料水比1:(2.5～3.5)下发酵。

在一种实施方式中，所述半固态发酵的发酵时间为42～54h。

在一种实施方式中，所述半固态发酵的温度为25～40℃，可以是30℃。

在一种实施方式中，所述方法，具体是：以花生粕为原料，按1:(0.6～1)的料水比与水混合并搅拌均匀，灭菌；灭菌后接入2～5wt％的解淀粉芽孢杆菌，搅拌均匀后，在32～40℃下发酵60～84h，发酵完毕后加水至料水比1:(2.5～3.5)，并添加复合酶制剂，置于35～55℃下酶解反应3～5h；其中纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的添加量为50～150U/g；果胶酶的添加量为100～300U/g；酶解反应后于80～110℃处理10～30min，冷却后添加经活化好乳酸菌4～8wt％或者酵母与乳酸菌的复合物，半固态发酵42～54h后固液分离，烘干、粉碎。

在一种实施方式中，所述酵母与乳酸菌的复合物，是指同时添加酵母与乳酸菌；其中酵母添加量为2-5wt％、乳酸菌添加量为4-8wt％。

在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌为CGMCC NO.9021；所述乳酸菌为戊糖片球菌CGMCC NO.9182；所述酿酒酵母为CGMCC 2.146。其中，CGMCC NO.9021已经在申请号201410235025X、申请公布号CN103966147A的专利中公开了；CGMCC NO.9182已经在申请号2014102833630、申请公布号CN104161172A的专利中公开了；CGMCC 2.146为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

在一种实施方式中，所述纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶均购自白银赛诺生物科技有限公司；所述β-葡聚糖酶购自康地恩生物科技有限公司。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过添加复合酶制剂与混合发酵相结合的方法，非淀粉多糖含量可降低至7％-10％，蛋白质含量高达62％，必需氨基酸整体提升19.6％，其他各项指标明显变好，本方法对花生粕的品质提升具有重要作用。

(2)本发明通过特定的复合酶制剂的组成和添加量，有效降低了非淀粉多糖含量；降解的非淀粉多糖，经再次发酵，被微生物利用形成一系列有利于消化吸收的代谢产物，提高了消化吸收利用率、提高了免疫力。

(3)本发明还通过添加酵母菌的方式，一方面进一步分解非淀粉多糖的降解物，另一方面提高了花生蛋白的风味；得到的花生蛋白，适口性更好。

(4)本发明的花生蛋白中黄曲霉毒素B₁含量极低(≤10μg/kg)；多肽含量为23％-30％，乳酸含量1.5％-3.0％，有益微生物含量达10⁸CFU/g以上，可以替代鱼粉等优质蛋白。

附图说明

图1：处理前后花生粕NSP和蛋白质含量变化；

图2：处理前后花生粕的SDS-PAGE电泳图；其中，M为Marker、1为原料、2为本实施例处理后得到的产品。

具体实施方式

非淀粉多糖测定：按总糖含量减去还原糖的含量计算，总糖和还原糖采用3，5-二硝基水杨酸比色法进行测定。

蛋白质含量测定：按照GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定方法测定。

必需氨基酸的测定：按照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定方法测定。

一般来说菌种为解淀粉芽孢杆菌、戊糖片球菌和酿酒酵母，所添加的饲料用酶制剂为纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶。不同的解淀粉芽孢杆菌、戊糖片球菌和酿酒酵母进行发酵，结果差异不大。本发明使用的解淀粉芽孢杆菌为CGMCC NO.9021；所述戊糖片球菌为CGMCC NO.9182；所述酿酒酵母为CGMCC 2.146。

实施例1

以花生粕为原料和水按1:0.8比例混合，121℃灭菌20min，冷却后接种5wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加复合酶制剂(纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反应4h；酶解反应后将样品进行沸水浴20min，冷却后添加5wt％的酿酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。

对本实施例的花生粕原料(空白组)和按本实施例方法得到的产品进行NSP和蛋白质含量的分析，结果如图1所示。结果显示，花生粕的NSP从30％左右降至7.3％，蛋白质含量从48％左右提升至62％，NSP含量的减少可降低花生粕的抗营养作用，提高其饲用品质。此外，由图2的蛋白质品质的改善情况可知，SDS-PAGE电泳图显示本实施例得到的花生粕蛋白中的大分子蛋白明显降解为小分子蛋白；发酵后多肽占比29.2％，多肽相比于大分子蛋白更利于动物吸收，促进肠道发育。

发明人还比较了处理前后花生粕中必需氨基酸组成的变化，如表1所示。

表1处理前后花生粕中必需氨基酸组成的变化(％)

注：-表示低出检出线

由表1可知，必需氨基酸含量提升了20.88％；花生粕氨基酸得到了一定的平衡。

此外，本实施例方法得到的发酵花生粕中黄曲霉毒素B₁含量为9.14μg/kg，乳酸含量达到2.4％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

实施例2

以花生粕为原料和水按1:0.8比例混合，100-105℃灭菌20min，冷却后接种5wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵72h。添加复合酶制剂(纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反应3h；酶解结束后100℃处理20min，冷却后添加5wt％的酿酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。发酵花生粕中NSP降至8.7％，总蛋白含量60.3％，多肽占比23.6％，必需氨基酸含量提升了16.76％；黄曲霉毒素B1含量为10μg/kg，乳酸含量2.1％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

实施例3

以花生粕为原料和水按1：3比例混合，接种5wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵72h；添加复合酶制剂(纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶以100U/g添加，果胶酶以150U/g添加)并置于45℃下酶解反应4h；酶解反应后将样品进行沸水浴20min，冷却后添加5wt％的酿酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。发酵花生粕NSP降至9.6％，总蛋白含量58.9％，多肽占比26.3％，必需氨基酸含量提升了17.48％；黄曲霉毒素B1含量为23.5μg/kg，乳酸含量2.4％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

实施例4

以花生粕为原料和水按1:0.6比例混合，100℃灭菌20min，冷却后接种2wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵84h；取出后加水至料水比1:3.5，添加复合酶制剂(纤维素酶120U/g、木聚糖酶50U/g、β-葡聚糖酶120U/g、果胶酶200U/g添加)并置于48℃下酶解反应5h；酶解反应后将样品进行沸水浴20min，冷却后添加8wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。

发酵花生粕NSP降至9.6％，总蛋白含量60％，多肽占比24.2％，必需氨基酸含量提升了16.56％；乳酸含量2.8％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

实施例5

以花生粕为原料和水按1:1比例混合，110℃灭菌20min，冷却后接种4wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵60h；取出后加水至料水比1:2.5，添加复合酶制剂(纤维素酶50U/g、木聚糖酶100U/g、β-葡聚糖酶50U/g、果胶酶300U/g添加)并置于49℃下酶解反应3.8h；酶解反应后将样品进行沸水浴20min，冷却后添加3wt％的酿酒酵母和4wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。

发酵花生粕NSP降至9.6％，总蛋白含量61.1％，多肽占比25.1％，必需氨基酸含量提升了16.72％；乳酸含量2.2％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

对照组1

省略实施例1中的酶解步骤，其他步骤与实施例一致，即：

以花生粕为原料和水按1:0.8比例混合，121℃灭菌20min，冷却后接种5wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加复合酶制剂(纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶各以150U/g添加)后，将样品进行沸水浴20min，冷却后添加5wt％的酿酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。

结果显示，按照实施例方法得到的发酵花生粕的NSP含量29.5％，总蛋白含量52.3％，多肽占比20.3％；发酵花生粕中黄曲霉毒素B₁含量为18.9μg/kg，乳酸含量1.3％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

对照组2

省略实施例1中添加的木聚糖酶，其他步骤与实施例一致，即：

以花生粕为原料和水按1:0.8比例混合，121℃灭菌20min，冷却后接种5wt％的解淀粉芽孢杆菌，发酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加复合酶制剂(纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反应4h；酶解反应后将样品进行沸水浴20min，冷却后添加5wt％的酿酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固态发酵48h后固液分离，烘干、粉碎。

结果显示，按照实施例方法得到的发酵花生粕的NSP含量23.5％，总蛋白含量55.9％，多肽占比22.3％；乳酸含量1.9％，有益菌活菌数量达到10⁸CFU/g以上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。