产生糖苷的热处理的制作方法

序列表的引用本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，所述引用作为于2016年5月27日创建并且具有92千字节大小的标题为“car0211wo_sequence_listing.txt,”的ascii文本文件与此同时提交。所述序列表根据37c.f.r.§1.52(e)(5)特此以引用的方式整体并入。相关申请的交叉引用本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请号62/168,142的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。背景糖(诸如蔗糖、果糖和葡萄糖)被利用来为饮料、食物、药物、口腔卫生产品和化妆品提供令人愉快的味道。蔗糖尤其赋予大多数消费者所优选的味道。虽然蔗糖提供优异的甜味特征，但是它是含热量的。已经引入无热量或较低热量的甜味剂来满足消费者需求。消费者还希望这些甜味剂具有有利的味道特征。甜菊糖是向日葵家族(菊科)中的香草和灌木的约240种物种的属，原产自亚热带和热带地区以及从北美洲西部至南美洲。物种甜叶菊(steviarebaudiana)通常称为甜叶(sweetleaf)、甜叶、糖叶或简单地甜菊糖，它由于其甜叶而被广泛地种植。基于甜菊糖的甜味剂可通过从叶提取一种或多种甜化合物来获得。这些化合物中的许多是甜菊醇(二萜化合物)的糖苷。这些二萜糖苷是糖的约150至450倍甜。甜菊醇糖苷通过甜味能量以及促成味质的其他感官特征(诸如苦味、残留余味等)而彼此不同。参见kinghorn，a.d.，stevia：thegenusstevia，taylor&francis，london(2002)。甜菊醇糖苷的实例描述于pct国际专利申请公开号wo2013/096420(参见，例如，图1中的列表)；以及ohta等人，“characterizationofnovelsteviolglycosidesfromleavesofsteviarebaudianamorita,”j.appl.glycosi.，57，199-209(2010)(参见，例如，第204页处的表4)中。在结构上，二萜糖苷的特征在于单基甜菊醇，并且通过在位置c13和c19处的碳水化合物残基的存在而不同，如wo20013/096420的图2a-2k所呈现的。通常，在干重基础上，甜菊糖的叶中存在的四种主要的甜菊醇糖苷是杜尔可甙a(0.3％)、莱苞迪甙c(0.6-1.0％)、莱苞迪甙a(3.8％)和甜菊糖苷(9.1％)。在甜菊糖提取物中识别到的其他糖苷包括莱苞迪甙b、莱苞迪甙d、莱苞迪甙e、莱苞迪甙f、莱苞迪甙g、莱苞迪甙h、莱苞迪甙i、莱苞迪甙j、莱苞迪甙k、莱苞迪甙l、莱苞迪甙m、莱苞迪甙n、莱苞迪甙o、甜菊双甙和覆盆子苷中的一种或多种。虽然主要的甜菊醇糖苷莱苞迪甙a常用作饮料应用中的甜味剂，但是它具有异味问题。最近，存在对于具有更好的味道特性的某些次要的甜菊醇糖苷的关注。例如，莱苞迪甙m具有比其他甜菊醇糖苷更高的甜味强度并且更强效(例如，参见prakash，i.等人(2013)nat.prod.commun.，8：1523–1526和wo2013/096420)。莱苞迪甙d尝起来是蔗糖的约200-220倍甜，并且在感官评价中甜味起效缓慢并且非常清新，即总体上比蔗糖更甜，与蔗糖相比甜残留余味更少(例如，参见prakash，i.等人(2012)int.j.mol.sci.，13:15126-15136)。重组dna技术使得使用广泛种类的宿主细胞(诸如酵母)生产所需的甜菊醇糖苷成为可能并且在商业上可行。然而，由于需要使坚硬的酵母细胞壁破裂或水解，从宿主细胞内回收细胞内表达的产物存在很大困难。细胞壁破坏的选择还可能影响回收产物的下游处理及其从酵母细胞或发酵液的后续纯化，从而影响工艺的效率和成本效益。概述公开了一种有效地回收通过重组酵母技术以成本有效的方式产生的所需甜菊醇糖苷的方法。在本发明的一方面，公开了一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括将包含产生甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞的发酵培养基加热至50℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至48小时，以将一种或多种甜菊醇糖苷从工程化宿主细胞释放到发酵培养基中。在本发明的另一方面，公开了一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：a)提供包含进行工程化以产生一种或多种甜菊醇糖苷的宿主细胞的发酵培养基；以及b)通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从工程化宿主细胞释放一种或多种甜菊醇糖苷，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷从宿主细胞的细胞内部分释放到发酵培养基的细胞外部分。在本发明的又一方面，公开了一种从组合物释放甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括将所述组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时以从组合物中的工程化宿主细胞释放甜菊醇糖苷的步骤。在本发明的另一方面，公开了一种释放甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞的组合物；以及b)通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从工程化宿主细胞释放一种或多种甜菊醇糖苷。在本发明的另一方面，公开了一种组合物，其包含产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞和通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时而从工程化宿主细胞释放的一种或多种甜菊醇糖苷。此类方法实现将糖苷释放到组合物中，同时使细胞裂解最小化。附图描述图1示出代表性甲羟戊酸途径。图2示出代表性非甲羟戊酸途径。图3示出甜菊醇产生的代表性途径。图4示出从甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷的代表性途径。图5a是热处理之前亮视场显微镜图像的数字图像。图5b是热处理之后亮视场显微镜图像的数字图像。详细描述本文所描述的本公开的实施方案并不意图是详尽的或者将本发明限于在以下详细描述中公开的精确形式。相反，所选择并描述的实施方案的目的在于使得可有利于本领域的其他技术人员认识并理解本发明的原理和实践。本文所提及的所有出版物和专利均特此以引用的方式全部并入。在此所公开的出版物和专利仅出于其公开内容而提供。宿主细胞(诸如酵母和真菌)可进行工程化以用于合成甜菊醇糖苷。在发酵期间，由宿主细胞产生的糖苷的仅一小部分可从细胞内释放到发酵培养基中。为了增加从宿主细胞(诸如酵母)释放的糖苷量，可使用机械和化学破坏方法。机械破坏(即细胞的破碎)将细胞内组分释放到周围的培养基中。结果是不仅所需重组产物、并且其他产物(诸如蛋白质、核酸、细胞代谢物、细胞碎片)的复杂混合物，从而使所需产物的回收复杂化。化学方法需要化学地更改细胞膜和/或细胞壁结构或使其可透过，以使产物从细胞内扩散。然而，化学处理必须与所需产物的生物体和释放相容。公开了使用热处理的在发酵之后有效回收甜菊醇糖苷的方法。在给定的时间段和温度下向包含宿主细胞(例如，酵母和真菌)的发酵液或发酵培养基施加热。宿主细胞可产生所需的甜菊醇糖苷。当加热包含宿主细胞的发酵培养基时，所需糖苷可在最小的细胞裂解的情况下从宿主细胞释放，从而使发酵培养基或组合物富集所需糖苷。在一些实施方案中，所公开的方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可包含编码促进一种或多种甜菊醇糖苷在细胞中形成的酶的一种或多种外源性核酸。如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪甙a、莱苞迪甙b、莱苞迪甙c、莱苞迪甙d、莱苞迪甙e、莱苞迪甙f、莱苞迪甙g、莱苞迪甙h、莱苞迪甙i、莱苞迪甙j、莱苞迪甙k、莱苞迪甙l、莱苞迪甙m、莱苞迪甙n、莱苞迪甙o、甜菊糖苷、甜菊双甙、杜尔可甙a和/或覆盆子苷。工程化酵母可产生天然存在的(“天然发生的”)甜菊醇糖苷或自然界中不存在的(非天然发生的)甜菊醇糖苷。如本文所用，术语“总甜菊醇糖苷”(tsg)计算为在干燥(无水)基础上组合物中的全部甜菊醇糖苷含量的总和。在结构上，根据以下所示的基上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(它是单一甜菊醇基)和吡喃葡萄糖基残基或连接到甜菊醇基的c13和c19原子的其他糖残基。即，吡喃葡萄糖基残基表示以下式中的基团r1和r2：以下表a示出某些甜菊醇糖苷和对应的r1和r2基团：表aglu：葡萄糖rha：鼠李糖所公开的甜菊醇糖苷可在发酵过程中产生。发酵过程可使用进行工程化以用于产生一种或多种甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪甙a(reba)、莱苞迪甙m(rebm)和/或莱苞迪甙d(rebd))的基因修饰生物体。甜菊醇糖苷的产生可使用具有提供合成甜菊醇糖苷的途径的一组酶的工程化微生物菌株来进行。各种酵母或真菌宿主细胞可进行工程化以提供向一种或多种甜菊醇糖苷的途径。此类细胞可转化有编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种dna构建体。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源性dna构建体的宿主的示例性酵母和真菌包括但不限于假丝酵母、毕赤酵母(汉逊酵母)、克勒克酵母(有孢汉生酵母)、克鲁维酵母、红酵母、球拟酵母、接合酵母、酵母菌、耶氏酵母和酵母属(saccharomyces)的属。示例性物种包括白假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母。另外，宿主细胞还可包含除了甜菊醇糖苷途径的那些基因修饰以外的可在发酵期间提供改善的性能的基因修饰。“工程化宿主细胞”是指具有引入到细胞中(整合到细胞的基因组中或存在于染色体外的构建体(诸如细菌或附加体中的质粒)上)的至少一个外源性dna序列的酵母和真菌。虽然本说明书可详细描述酵母细胞，但是应理解，本公开也可适于真菌细胞。术语“外源性的”适用于分子(诸如核酸)或活性(诸如酶活性)。外源性分子被引入到宿主酵母或真菌中。外源性核酸可通过熟知的技术引入到宿主生物体中，并且可维持在宿主染色体物质外部(例如，维持在非整合载体上)或者可诸如通过重组事件整合到宿主的染色体中。通常，工程化酵母或真菌的基因组通过稳定地引入一种或多种重组基因而得以增加。外源性核酸可编码对于宿主生物体是同源的或异源的酶或其部分。外源性核酸可呈“重组基因或dna构建体”的形式，这是指通过分子技术以一种或多种方式调控为呈并非天然地存在的形式的核酸。术语“非天然的”可用于表征诸如核酸或蛋白质的分子或在自然界中并非天然地存在的生物体。术语“异源的”(例如，“非原生的”)适用于来自不同于所引用的分子或生物体的来源的分子或活性。因此，对于所引用的生物体是异源的基因或蛋白质是此生物体中不存在的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源糖基转移酶”是指不同于可对于宿主生物体是原生的任何糖基转移酶多肽的糖基转移酶多肽。例如，存在于第一物种中并且外源性地引入到不同于所述第一物种的宿主酵母或真菌生物体中的特定糖基转移酶基因对于所述宿主酵母或真菌生物体是“异源的”。工程化酵母或真菌可使用对于转化体适于进行选择的营养缺陷型标记。宿主细胞可包含控制营养缺陷型的一种或多种基因(诸如lys2、leu2、his3、ura3、ura5和trp1)的修饰(例如，缺失)。使用具有用于引入一种或多种外源性基因的所需遗传背景的宿主细胞，将一种或多种基因构建体引入到细胞中以整合到基因组中或稳定地维持并实现表达。用于将基因构建体引入到宿主细胞中的方法包括转化、转导、转染、共转染、电穿孔。具体地，酵母转化可使用乙酸锂方法、原生质体法等进行。待引入的基因构建体可以质粒的形式、或通过插入到宿主的基因中或通过与宿主的基因的同源重组来并入到染色体中。基因构建体引入到其中的转化的酵母可使用选择性标记(例如，如上所提及的营养缺陷型标记)来选择。进一步的确认可通过测量所表达的蛋白质的活性来进行。包含甜菊醇途径基因的外源性核酸序列的转化可使用本领域中熟知的方法来确认。此类方法例如包括核酸分析(诸如针对基因产物的表达的rna印迹法或聚合酶链反应(pcr)扩增或免疫印迹法)或测试所引入的核酸序列或其对应的基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域的技术人员应理解，外源性核酸以足以产生所需产物的量表达，并且还应理解，可使用本领域中熟知的和如本文所公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。萜类化合物(异戊烯基二磷酸(ipp)和二甲基烯丙基二磷酸(dmapp))可充当工程化宿主细胞(例如，酵母)中的甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物体(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有通过一系列化学中间体将乙酰辅酶a转化为ipp和dmapp的甲羟戊酸(mva)途径。一些生物体通过以甘油醛-3-磷酸(g3p)和丙酮酸(pyr)开始的非甲羟戊酸途径(还称为甲基d-赤藓糖醇-4-磷酸或mep途径)产生ipp和dmapp。酵母酿酒酵母天然地表达甲羟戊酸途径的基因。甲羟戊酸途径基因包括：(a1)乙酰乙酰辅酶a硫解酶(ec2.3.1.9)、(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶a(hmg-coa)合酶(ec4.1.3.5)；(c1)hmg-coa还原酶(ec1.1.1.34)；(d1)甲羟戊酸激酶(ec2.7.1.36)；(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(ec2.7.4.2)；以及(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(ec4.1.1.33)。甲羟戊酸途径酶如下将乙酰辅酶a转化为ipp：乙酰辅酶a→乙酰乙酰辅酶a→3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶a→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→ipp。也参见图1在一些实施方案中，工程化酵母可包含一种或多种修饰以增加从乙酰辅酶a到ipp和/或dmapp的转变，从而提供用于向甜菊醇的途径的ipp和/或dmapp的增加的库。所述修饰可例如包括诸如通过在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供与天然酶相比更高水平的酶活性的异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代)或变体异源酶来放置编码对于酵母细胞是同源或异源的酶的核酸来增加一种或多种甲羟戊酸途径酶(a1)–(f1)的表达或活性。可替代地，可使用非甲羟戊酸(mep)途径来向甜菊醇糖苷产生提供作为前体的ipp和dmapp。酵母酿酒酵母不天然地表达mep途径的基因，但是可任选地进行工程化以提供mep途径基因。理论上，mep途径通常是在能量学上更有效的，因为它与mva途径相比失去呈co2形式的更少的碳(mep途径：1co2/ipp；mva途径：4co2/ipp；糖作为碳源)。具体地，非甲羟戊酸(mep)途径化合物异戊烯基二磷酸(ipp)、二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)通过以甘油醛-3-磷酸(g3p)和丙酮酸(pyr)引导的一系列中间体生成，并且多种酶负责此转化。参与从g3p和pyr向ipp和dmapp的生物合成途径的酶包括：(a2)1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶(dxs)、(b2)1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原酶(ispc)-、(c2)4-二磷酸胞苷-2c-甲基-d-赤藓糖醇合酶(ispd)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇合酶(ispe)、(e2)2c-甲基-d-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(ispf)、(f2)1-羟基-2-甲基-2-(e)-丁烯基-4-二磷酸合酶(ispg)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(e)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(isph)、以及(h2)异戊烯基-二磷酸异构酶(idi)。参见图2用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可具有一种或多种基因修饰以增加从g3p和pyr到ipp和/或dmapp的转变，从而提供用于向甜菊醇的途径的ipp和/或dmapp的增加的库。所述修饰可例如包括诸如通过在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供高水平的酶活性的异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或变体异源酶来放置编码对于酵母细胞是异源的酶的核酸来增加一种或多种酶(a2)–(h2)的表达或活性。用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母还可包含将ipp和/或dmapp转化为甜菊醇的途径。例如，在一些方面，工程化酵母可包含表达以下酶的外源性核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)、(b3)柯巴基二磷酸合酶(cps)、(c3)贝壳杉烯合酶(ks)、(d3)贝壳杉烯氧化酶(ko)、以及(e3)贝壳杉烯酸13-羟化酶(kah)。甲羟戊酸途径的酶如下将ipp和/或dmapp转化为甜菊醇：ipp/dmapp→香叶基香叶基二磷酸合酶→柯巴基二磷酸合酶→贝壳杉烯→贝壳杉烯酸→甜菊醇。(参见图3)编码对于酵母细胞是异源的酶(a3)-(e3)的外源性核酸可在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供高水平的酶活性的变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或变体异源酶来放置。本公开的用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的方法可使用包含选自以下组中的一种或多种甜菊醇生物合成酶的工程化酵母：香叶基香叶基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(kah)、甜菊醇合酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(dxs)、d-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(dxr)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇合酶(cms)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶(cmk)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(mcs)、1-羟基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸合酶(hds)、1-羟基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸还原酶(hdr)、乙酰乙酰辅酶a硫解酶、截短的hmg-辅酶a还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、细胞色素p450还原酶等。用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可具有将甜菊醇转化为甜菊醇糖苷的任何途径。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则酵母可能够产生不同的甜菊醇糖苷。例如，酵母可能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于10种不同的甜菊醇糖苷物质。在一些实施方案中，reba、rebd和/或rebm通过工程化酵母细胞产生。甜菊醇糖苷途径可包含介导糖基残基从活化的核酸糖向受体分子的转移的一种或多种尿苷二磷酸(udp)糖基转移酶(ugt)。在甜菊醇糖苷途径的情况下，单糖单元可转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或转移到连接到甜菊醇基的葡萄糖基团上的羟基。参见图4。ugt基于序列同源性被分类为家族和亚家族。参见li等人，2001，j.biol.chem.276:4338-4343。编码ugt(各自包含42个氨基酸共有序列)的超过100个基因的超家族已经在模型植物拟南芥中识别到，并且编码ugt的基因也已经在若干其他高级植物物种中识别到。示例性udp-糖基转移酶可以是能够向甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元以提供所需的甜菊醇糖苷的任何udp-糖基转移酶。在一个实施方案中，工程化酵母可包含选自以下组的一种或多种udp-糖基转移酶：ugt74g1(seqidno：1)、ugt85c2(seqidno：2)、ugt76g1(seqidno：3)、ugt91d2(seqidno：4)、以及与这些多肽具有基本上(例如，>85％、>75％、>65％、>55％、>45％和>35％)同一性的ugt。工程化酵母可包含编码这些ugt的一种或多种外源性核酸分子。工程化酵母还可包含一种或多种ugt和udp-葡萄糖再循环酶。能够向覆盆子苷添加至少一个葡萄糖单元以形成甜菊糖苷的示例性udp-糖基转移酶是ugt91d2(seqidno：4)。能够向甜菊糖苷添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙a的示例性udp-糖基转移酶是ugt76g1(seqidno：3)。能够向莱苞迪甙a添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙d的示例性udp-糖基转移酶是ugt91d2(seqidno：4)。能够向莱苞迪甙d添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙m的示例性udp-糖基转移酶是ugt76g1(seqidno：3)。描述用于甜菊醇糖苷产生的工程化微生物的示例性出版物包括例如美国专利申请公开号2014/0357588、国际专利申请公开号wo2014/193934、wo2014/193888和wo2014/122227，所述专利特此以引用的方式全部整体并入。在一个实施方案中，用于产生甜菊醇糖苷的工程化酵母表达以下酶：香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)、内部-柯巴基二磷酸合酶(cdps)、贝壳杉烯氧化酶(ko)、贝壳杉烯合酶(ks)；甜菊醇合酶(kah)、细胞色素p450还原酶(cpr)、ugt74g1、ugt76g1、ugt91d2、ugt85c2和eugt11。wo2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。udp-葡萄糖基转移酶可以是编码多肽的基因，所述多肽例如ugt74g1(seqidno：1)、ugt85c2(seqidno：2)、ugt76g1(seqidno：3)、ugt91d2(seqidno：4)、以及eugt11(seqidno：13)；这些基因编码能够进行多个反应的多肽，诸如a)编码能够进行甜菊醇糖苷的19-o-葡萄糖的c2'的β1,2糖基化的多肽的基因；(b)编码能够进行甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖的c2'的β1,2糖基化的多肽的基因；(c)编码能够进行甜菊醇糖苷的19-o-葡萄糖的c3'的β1,3糖基化的多肽的基因；(d)编码能够进行甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖的c3'的β1,3糖基化的多肽的基因；(i)编码能够进行甜菊醇或甜菊醇糖苷的13-oh的糖基化的多肽的基因；(j)编码能够进行甜菊醇或甜菊醇糖苷的c-19羧基的糖基化的多肽的基因。例如，ugt85c2进行反应(i)；ugt74g1进行反应(j)；ugt91d2进行反应(a；微弱地)、(b)；ugt76g1进行反应(c)和(d)；eugt11进行反应(a)、(b；稍差地)。在一个实施方案中，工程化宿主细胞表达编码对宿主细胞是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：ggpps多肽、内部-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽、贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽、贝壳杉烯合酶(ks)多肽；甜菊醇合酶(kah)多肽、细胞色素p450还原酶(cpr)多肽、ugt74g1多肽、ugt76g1多肽、ugt91d2多肽、以及eugt11多肽。在另一个实施方案中，工程化酵母表达编码对宿主细胞是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：ggpps多肽、截短的玉米cdps多肽、拟南芥ks多肽、甜叶菊ko多肽、拟南芥atr2多肽、水稻eugt11多肽、srkahe1多肽、甜叶菊cpr8多肽、甜叶菊ugt85c2多肽、甜叶菊ugt74g1多肽、甜叶菊ugt76g1多肽、甜叶菊ugt91d2变体或功能同源物、以及ugt91d2e-b多肽。产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株使用如在wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328中所描述的方法来构建，所述专利中的每个以引用的方式整体并入。以下序列用于构建亲株(菌株a)：编码聚球蓝细菌属某种ggpps多肽(seqidno:6)的重组基因、编码截短的玉米cdps多肽(seqidno:7)的重组基因、编码拟南芥ks多肽(seqidno:8)的重组基因、编码重组甜叶菊ko多肽(seqidno:9、seqidno:10)的重组基因、编码拟南芥atr2多肽(seqidno:11、seqidno:12)的重组基因、编码玉米eugt11多肽(seqidno:13)的重组基因、编码srkahe1多肽(seqidno:14、seqidno:15)的重组基因、编码甜叶菊cpr8多肽(seqidno:16、seqidno:17)的重组基因、编码甜叶菊ugt85c2多肽(seqidno:2)的重组基因、编码甜叶菊ugt74g1多肽(seqidno:1)的重组基因、编码甜叶菊ugt76g1多肽(seqidno:3)的重组基因、编码产生甜菊醇糖苷的甜叶菊ugt91d2(seqidno:4)变体(或功能同源物)ugt91d2e-b多肽的重组基因。ugt91d2的ugt91d2e-b变体(来自pct/us2012/050021的seqidno:5)包含在位置211处的亮氨酸的甲硫氨酸取代和在位置286处的缬氨酸的丙氨酸取代。(可使用在pct/us2012/050021的表12和实施例11中所描述的另外的变体(除了t144s、m152l、l213f、s364p和g384c变体之外)，所述专利特此以引用的方式整体并入。)geneart密码子优化序列编码具有氨基酸修饰l211m和v286a的甜叶菊ugt91d2e-b(seqidno:4针对氨基酸序列；密码子优化核苷酸序列在seqidno:5中列出)。菌株b衍生自以上所述的亲株并且另外地包含来自甜叶菊的密码子优化cpr1(对应于氨基酸seqidno:19的seqidno:18)。在一个实施方案中，工程化酵母表达编码对酵母是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：ggpps多肽、内部-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽、贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽、贝壳杉烯合酶(ks)多肽；甜菊醇合酶(kah)多肽、细胞色素p450还原酶(cpr)多肽、ugt74g1多肽、ugt76g1多肽、ugt91d2多肽、以及eugt11多肽。在另一个实施方案中，工程化酵母表达编码对酵母是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：ggpps多肽、截短的玉米cdps多肽、拟南芥ks多肽、甜叶菊ko多肽、拟南芥atr2多肽、水稻eugt11多肽、srkahe1多肽、甜叶菊cpr8多肽、甜叶菊ugt85c2多肽、甜叶菊ugt74g1多肽、甜叶菊ugt76g1多肽、甜叶菊ugt91d2变体或功能同源物、以及ugt91d2e-b多肽工程化宿主细胞(例如，酵母细胞)可用于通过发酵产生所需的甜菊醇糖苷，诸如莱苞迪甙m、莱苞迪甙d和莱苞迪甙a。如在此所述的“发酵”是指通过需氧发酵产生所需的甜菊醇糖苷的培养基(诸如碳水化合物)的同化作用。术语“培养基”或语法等同物(诸如“培养基(media)”)是指工程化酵母或真菌可在其中维持、生长或发酵或其组合的液体组合物。“培养基”还可称为“培养液”或“细胞培养物”，并且形容术语“培养基”及其等同物的术语(诸如“发酵”)可用于更具体地定义发生在培养基中的细胞活动的类型。培养基可关于存在于培养基中的组分及其量来限定，所述组分包括但不限于：(a)碳源，包括碳水化合物(诸如葡萄糖)和淀粉制品(诸如麦芽糖糊精)；(b)氮源，诸如酵母氮基、氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物或其任何组合；(c)盐，诸如磷酸钾(一价的、二价的)、硫酸镁、氯化钠、以及氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、hcl吡哆醇、核黄素、hcl硫胺、以及柠檬酸；和/或(e)痕量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、氯化铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠、以及硫酸锌。培养基还可关于其ph和用于控制培养基中的ph的生物相容性酸、碱和缓冲液来限定。工程化酵母的发酵可使用可得自任何植物和植物部分(诸如块茎、根、茎、叶和种子)的含有淀粉和/或糖的植物物质来进行。含有淀粉和/或糖的植物物质可从谷物(诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、土豆、木薯或大米或其任何组合)获得。含有淀粉和/或糖的植物物质可诸如通过诸如研磨、麦芽制造或部分麦芽制造的方法进行处理。在一些实施方案中，发酵培养基包含处理的淀粉。例如，发酵培养基可包含部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可包括高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。可使用淀粉和淀粉降解产物的量在所需范围内的部分水解的淀粉制品。发酵可在适于产生所需甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪甙m、莱苞迪甙d和莱苞迪甙a)的条件下和培养基中进行。发酵条件通常使用氧气(需氧条件)、碳源和营养物(氮)基。发酵可使用分批补料或连续工艺来进行。发酵基本培养基包含葡萄糖(5g/l)、硫酸铵(5g/l)、磷酸二氢钾(3g/l)、硫酸镁(0.5g/l)、痕量元素、以及维生素(例如，参见，verduyn，c.等人(1992)yeast8，501-517)。发酵培养基的ph可以是约ph4至ph5，并且发酵可在约30℃的温度下进行。在一些实施方案中，发酵可使用基础培养基中的第一生长阶段、接着使用含有葡萄糖的限定进料培养基(具有痕量金属、维生素和盐)的较长进料阶段来进行。在其他实施方案中，发酵可使用大于5.0的ph来进行。在一些实施方案中，ph的范围可以是约5.5至8或5.8至7.5。在一些实施方案中，工程化酵母可初始地在较低ph(诸如小于6.0)下生长，并且发酵在较高ph(诸如大于5.0)下进行。用于产生所需甜菊醇糖苷的发酵的其他方法描述于标题为“fermentationmethodsforproducingsteviolglycosidesusinghighphandcompositionsobtainedtherefrom,”美国专利申请号62/168,345的申请和标题为“fermentationmethodsforproducingsteviolglycosides,”代理人案卷号n00291wo01(car0210/wo)并且与本申请同时提交的国际pct申请中，所述申请各自特此以引用的方式整体并入。任选地，发酵可在含有其他中间体的培养基中进行，所述其他中间体诸如甜菊醇、莱苞迪甙a、甜菊糖苷、覆盆子苷、甜菊单甙、甜菊双甙、杜尔可甙a、莱苞迪甙c、莱苞迪甙e等。发酵步骤还可称为“甜菊醇糖苷产生步骤”。在一些实施方案中，发酵培养基在发酵步骤期间维持在小于40℃的温度下。在一些实施方案中，发酵培养基在发酵步骤期间维持在约25℃至35℃范围内的温度下。在发酵之后但是在释放或富集所需甜菊醇糖苷的任何处理(例如，热处理)之前，发酵液可仅含有一小部分的所需糖苷，其中所需糖苷的大部分在工程化宿主细胞内。公开了通过使用热来使所需糖苷从宿主细胞释放或富集的方法。热处理可在全部细胞发酵液上进行，所述细胞发酵液含有能够产生所需甜菊醇糖苷和所需甜菊醇糖苷产物的工程化酵母。在其他实施方案中，发酵之后但是在任何处理(例如，热处理)之前的工程化酵母可从发酵液分离并且转移到任何合适的组合物(诸如液体培养基)中。含有转移的酵母细胞的发酵液或组合物可在50℃至95℃范围内的温度下加热。在其他实施方案中，加热在70℃至95℃的温度下进行。加热进行5分钟至48小时。在一些实施方案中，加热在70℃至95℃下持续5分钟至2小时、在95℃下持续5分钟至1小时、在75℃下持续5分钟至2小时或在50℃下持续24小时。在一些实施方案中，加热在70℃至95℃下持续5分钟或在70℃至95℃下持续2小时。在一些实施方案中，热处理使甜菊醇糖苷释放到培养基中或使培养基的甜菊醇糖苷含量富集，使得细胞外糖苷含量大于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)糖苷含量的90％。在一些实施方案中，热处理步骤使甜菊醇糖苷释放到发酵培养基中，使得细胞外甜菊醇糖苷含量大于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)甜菊醇糖苷含量的80％、85％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，热处理步骤使甜菊醇糖苷释放到发酵培养基中，使得细胞外甜菊醇糖苷含量的范围是发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)甜菊醇糖苷含量的约80％至100％、85％至100％、90％至100％、90％至99％、92％至98％或90％至95％。在一些实施方案中，发酵液或组合物的热处理使reba、rebb、rebm、rebd或其组合释放。在一些实施方案中，热处理使reba富集，使得细胞外reba大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)reba的50％。在一些实施方案中，细胞外reba大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)reba的40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，reba量可以在发酵期间产生的reba的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围释放在细胞外。在一些实施方案中，热处理使rebd和/或rebm富集，使得释放在细胞外的rebd和/或rebm大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)rebd和/或rebm的33％。在一些实施方案中，细胞外rebd、rebm和/或rebd和rebm的总数大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)rebd、rebm和/或rebd和rebm的总数的40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，释放在细胞外的rebd和rebm的组合量可以存在于发酵液或组合物中的rebd和/或rebm的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在。在其他实施方案中，释放的rebd可以存在于发酵液或组合物中的rebd的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在于细胞外。在其他实施方案中，释放的rebm可以存在于发酵液或组合物中的rebm的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在于细胞外。在一些实施方案中，释放的rebb可以存在于发酵液或组合物中的rebb的总量的约25％至约100％、约30％至约95％、约40％至约80％的范围存在于细胞外。在一些实施方案中，细胞外rebb大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)rebb的30％、33％、35％、40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，所公开的热处理不引起从rebdm和/或reba向rebb的显著降解。在一些实施方案中，所公开的热处理引起所需糖苷的释放，但是不引起细胞的大量裂解。细胞裂解可例如通过在发酵和热处理之后释放到发酵液(例如，不含细胞)或组合物中的氮或磷或两者的量来测定。在一些实施方案中，发酵液或组合物的加热不增加不含细胞的发酵液或组合物中的氮和/或磷含量。在一些实施方案中，热处理之后不含细胞的发酵液或组合物中的细胞外氮含量增加不大于存在于全部细胞发酵液或组合物中的总(即，细胞外和细胞内两者)氮的45％。在一些实施方案中，热处理之后发酵液或组合物中的细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总(即，细胞外和细胞内两者)磷的70％。在又其他的实施方案中，当在70℃至95℃下加热5分钟至2小时时，细胞外氮含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总氮的45％，并且/或者热处理之后发酵液或组合物中的细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总磷的70％。在一些实施方案中，当发酵培养基或组合物在50℃至95℃下加热5分钟至48小时时，细胞外氮含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总氮的30％、33％、35％、37％、40％、42％、47％或50％。在一些实施方案中，当发酵培养基或组合物在50℃至95℃下加热5分钟至48小时时，细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总磷的50％、55％、60％、63％、65％、67％、73％、75％、77％或80％。发酵液或组合物的各种组分(例如，甜菊醇糖苷、氮或磷)的细胞内和/或细胞外含量可如实施例1中所述进行测定。发酵液或组合物的热处理还可基于细胞活力进行评估。当所需糖苷可从酵母细胞释放到发酵液或组合物中时，酵母活力降低，同时限制细胞裂解。细胞裂解可例如通过将全部细胞培养液铺板在马铃薯葡萄糖抗生素琼脂上或通过细胞活力计数器(例如，cellometertm)来测定。加热可通过使用热交换器(其中热转移到热水或蒸汽)来进行。在一些实施方案中，加热可使用具有保持回路的热交换器、直接蒸汽注射或利用施加到夹套容器的蒸汽的材料的批量加热来进行。在一些实施方案中，酵母可例如通过离心或过滤来浓缩，之后进行热处理。在其他实施方案中，离心的或过滤的酵母可转移到其他合适的培养基或组合物中并且然后用于加热。在所需重组产物(例如，甜菊醇糖苷)从宿主细胞释放到培养基中、从而使所需产物富集之后，各种程序可用于进一步分离或纯化所需重组产物。此类程序包括离心、超滤、沉淀和层析程序。在甜菊醇糖苷释放或富集之后，甜菊醇糖苷可通过如例如在国际专利申请公开号wo2009/140394中所描述的制备型hplc来进一步纯化，所述专利以引用的方式整体并入。热处理之后的发酵液或组合物然后可进行离心或过滤以去除工程化细胞。发酵液可任选地进行处理(诸如通过膜透析)以去除低分子量组分(葡萄糖、基本营养物和盐)。如果希望提供呈富集或纯化形式的具有甜菊醇糖苷(包括reba、rebb、rebm、rebd或其组合)的组合物，或者希望reba、rebb、rebm、rebd或其组合从其他甜菊醇糖苷分离或彼此分离，则可进行进一步的纯化。甜菊醇糖苷组分的此富集或纯化可在液体发酵培养基上进行，或者发酵培养基然后可在纯化之前进行干燥。例如，发酵培养基可使用冻干来进行干燥以形成可后续进行处理的干燥组合物(例如，粉末或薄片)，所述干燥组合物包含具有reba、rebb、rebm、rebd及其组合的甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，富集包括reba、rebb、rebm和/或rebd的甜菊醇糖苷的干燥发酵液或组合物可用作用于纯化的起始材料。例如，可向干燥发酵液添加溶剂或溶剂组合以使包含甜菊醇糖苷的物质溶解或悬浮。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水和醇的混合物(例如，50:50乙醇:水)。为了促进溶解或重悬浮，可在高于室温的温度(诸如在40℃-60℃的范围内)下加热干燥培养液物质。干燥发酵液物质的机械破坏还可诸如通过超声处理来进行。溶解的或重悬浮的发酵液物质可使用微米或亚微米过滤系统进行过滤，之后诸如通过制备型层析进行进一步纯化。富集甜菊醇糖苷化合物的干燥发酵液或组合物可经受其他纯化过程，诸如反相液相层析。可使用合适的树脂来将甜菊醇糖苷化合物保持在柱中，去除使用液体(诸如水)通过柱洗涤的亲水性化合物。甜菊醇糖苷(包括reba、rebb、rebm、rebd及其组合)从柱的洗脱可使用合适的溶剂或溶剂组合(诸如乙腈或甲醇)来实现。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷(诸如reba、rebb、rebm、rebd及其组合)可使用制备型液相层析(诸如高压液相层析(hplc)或超高压液相层析(uhplc))来进行纯化。具有reba、rebb、rebm、rebd及其组合的甜菊醇糖苷组合物可在流动相(诸如水和溶剂(例如，甲醇、乙醇、乙腈)的混合物)中在所需比率(例如，60％水，40％甲醇，v/v)下溶解。还可加热所述组合物以增强甜菊醇糖苷物质的溶解，诸如在约50℃下加热。所述溶液还可在注射到柱中之前诸如使用0.2μm过滤器进行过滤。phenomenexkinetexxb-c185μm，芯壳二氧化硅固体支撑物和具有异丁基侧链和tms封端的c18的固定相。通过柱的流动速率可基于柱特性(诸如约20ml/min)，最大压力为400bar。reba、rebb、rebm、rebd及其组合可通过其从柱洗脱的时间来识别。在示例性流动条件下，reba、rebb、rebm、rebd及其组合可在60分钟内从柱洗脱。本领域技术人员应认识到，reba、rebb、rebm、rebd及其组合的洗脱时间可随着溶剂和/或装备的变化而改变。本领域技术人员还应理解，虽然以下所述的工艺采用某一顺序的所述步骤，但是此顺序可在一些情况下更改。在一些实施方案中，富集包括reba、rebm和/或rebd的甜菊醇糖苷的发酵液或组合物可进行干燥并且用作用于进一步纯化的起始材料。具有reba、rebm、rebd及其组合的甜菊醇糖苷组合物可溶解在水中并且穿过吸附层析柱以去除组合物中的亲水性杂质。吸附的甜菊醇糖苷可从具有乙醇/水混合物的柱解吸。在去除乙醇之后，甜菊醇糖苷液流可使用离子交换层析进一步纯化以去除离子和有色体。可进行使用活性炭的附加处理。为了使特定的甜菊醇糖苷与其他甜菊醇糖苷进一步分离，可使用结晶步骤。晶体可富集有rebm、rebd、reba或其他甜菊醇糖苷。晶体可在加热和真空下干燥或者可与水再次制浆并进行喷雾干燥。实施例1以氢氧化铵作为主要氮源的分批补料发酵中的rebd、rebm和reba的产生为了制备接种物，在250rpm和30℃下在1升摇瓶中的150ml种瓶培养基中培养命名为菌株b的酵母菌株20-24小时。表1-种瓶培养基组分式浓度单位biospringer0251酵母提取物7.5g/l葡萄糖一水合物c6h12o6*h2o22.0g/l为了进行发酵，将75ml种子培养物转移到具有0.75升起始体积的初始发酵培养基中(表2、表3和表4)。温度始终维持在30℃下。空气流速为1.75slpm，并且自动地控制搅拌速率以在发酵期间以逐步方式从400rpm增加至900rpm。通过控制进料培养基的流动速率保持限制葡萄糖浓度(表5)。2阶段进料策略涉及初始指数阶段，其以u＝0.12l/h的生长速率在10小时处开始，而第二进料阶段(或进料阶段ii)以0.180ml/min的恒定流动速率在33小时处开始。继续进料，直至通过120小时获得1.95升的最终体积为止。使用12％nh4oh在整个发酵期间将ph维持在ph5下。通过利用具有10重量％消泡溶液的泡沫控制探针(ivanhoe1163b)来控制消泡剂添加。培养基基于verduyn等人(verduync，postmae，schefferswa，vandijkenjp.yeast.1992年7月；8(7)：501-17)，具有如表2至表5所述的修改。表2-初始发酵培养基组分式浓度单位葡萄糖一水合物c5h12o5*h2o22.0g/l硫酸铵(nh4)2so45.0g/l磷酸二氢钾kh2po43.0g/l七水硫酸镁mgso4*7h2o0.5g/l痕量金属储备液10.0ml/l维生素储备液12.0ml/l表3-痕量金属储备溶液组分式浓度单位依地酸二钠c10h14n2na2o5*2h2o15g/l七水硫酸锌znso4*7h2o4.5g/l六水氯化锰(ii)mncl2*4h2o1.026g/l七水硫酸钴(ii)cocl2*6h2o0.32g/l七水硫酸铜(ii)cuso4*5h2o0.3g/l二水钼酸钠na2moo4*2h2o0.4g/l二水氯化钙cacl2*2h2o3g/l七水硫酸铁(ii)feso4*7h2o3g/l硼酸h3bo31g/l碘化钾kl0.1g/l表4-维生素储备溶液组分式浓度单位d-生物素c10h15n2o3s50mg/l泛酸钙c15h32can2o101000mg/l烟酸c5h5no21000mg/l盐酸硫胺素c12h17cln4os·hcl1000mg/l盐酸吡哆醇c5h11no3·hcl1000mg/l对氨基苯甲酸c7h7no2200mg/l肌醇c5h12o525000mg/l表5-发酵进料培养基组分式浓度单位葡萄糖一水合物c5h12o5*h2o660g/l尿素(仅在尿素处理中)nh2conh233g/l消泡剂1.3g/l硫酸钾k2so44.2g/l硫酸钠na2so40.336g/l七水硫酸镁mgso4*7h2o6.12g/l磷酸二氢钾kh2po410.8g/l痕量金属储备液14.4ml/l维生素储备液14.4ml/l实施例2甜菊醇糖苷的富集或释放和分析使用如在实施例1中所述的从重组酵母发酵生成的发酵液。总甜菊醇糖苷(包括细胞内和细胞外浓度以及总氮含量(细胞内和细胞外)和总磷含量(细胞内和细胞外))的测量通过搅拌包含酵母细胞的发酵样品以确保酵母细胞混合并且不沉降到小瓶底部来进行。将100μl的混合发酵液移取到2ml微量离心管中。将900μl的61％甲醇(提取溶剂)添加到2ml微量离心管中并且通过放置在样品旋转器上搅拌10min以提取甜菊醇糖苷。然后将样品在微量离心机中在10krpm下离心3min，并且将澄清的上清液移取到自动取样机小瓶中以用于分析。在不同温度下加热发酵液(包含细胞)并且持续不同时间。使用热水浴来实现加热并且如下制备样品：针对所研究的各个温度和时间点，将1ml发酵液(包含细胞)放置到顶部空间小瓶中。将小瓶密封并放置到水浴中，并且使其在所研究的各个温度下平衡5分钟，之后将样品维持在所需温度下持续所需量的时间。在指定时间结束时，从水浴取出样品并且在4℃下冷却。向每个小瓶添加4ml无菌水，之后将样品转移到14ml无菌管。涡旋样品并且取出1ml以用于通过平板培养法测定细胞活力。将样品的剩余部分在室温下在4700rpm下离心30分钟以获得澄清的不含细胞的上清液。取出不含细胞的上清液以用于进一步分析，例如发酵培养基中的甜菊醇糖苷、氮和磷的细胞外含量(通过icp测量磷，通过antek测量氮，并且通过uhplc测量糖苷)。测定热处理之后释放到发酵液中的糖苷的量。通过超高效液相层析(uplc)测量reba、rebd和rebm。不含细胞的上清液还用于评估释放到发酵液中的氮和磷。使用燃烧法和antektm氮分析器分析氮水平(antek9000氮检测器利用与臭氧进行的氮燃烧和反应来产生亚稳二氧化氮，所述二氧化氮通过化学发光检测，并且使用电感耦合等离子体光谱测定法icp、perkinelmeroptima3200dv、在213.617nm处的uv检测分析磷水平，样品溶解在0.5％hno3中)。使用在室温下孵育5天的马铃薯葡萄糖抗生素easy硅胶板(微生物实验室测试试剂盒)测定酵母活力。用于糖苷分离的uplc方法使用具有eclipseplusc18保护(柱3mmx5mmx1.8um)的eclipsec18plusrrhd柱(3mmx150mmx1.8um)分离甜菊醇糖苷。所使用的流动相是通道a：10mm磷酸盐缓冲液，ph2.6和通道b乙腈。流动速率是0.6ml/min，柱温是40℃，并且检测在210nm的紫外吸收下进行。磷酸盐缓冲液与乙腈的比率改变的梯度洗脱分布在以下示出：i.初始：80％a/20％bii.7分钟：70％a/30％biii.12分钟：70％a/30％biv.15分钟：45％a/55％bv.18分钟：45％a/55％bvi.20分钟：20％a/80％bvii.25分钟：20％a/80％bviii.27分钟：15％a/85％bix.30分钟：15％a/85％bx.30.5分钟：80％a/20％bxi.35分钟：80％a/20％b示出为热处理之后从酵母细胞释放的细胞外reba、rebd&m的％的uplc结果在表6中示出。还示出细胞外氮和磷的％。使用leco氮分析器(lecotrumacn，st.joseph，mi)来测定包含细胞的发酵液中的总氮。向衬镍的陶瓷燃烧容器施加1ml的包含细胞的均匀混合的发酵液以用于氮燃烧分析。通过在陶瓷坩埚中使用丙烷火炬使5ml均匀混合的发酵液灰化来测定包含细胞的发酵液中的总磷。将所得的灰在525℃下保持过夜，之后使用10ml的0.5％hno3使灰溶解。使用icp测定硝酸溶液中的磷含量。表6.如可从表6所看到的，在较高温度下和较短时间内的热处理引起reba、rebd和rebm从酵母细胞内的释放的增加，同时影响热杀死，但是具有最小细胞裂解，如通过热处理之后培养基中的氮和磷的量所评估的。所述表还示出在较高温度(50℃、75℃和95℃和较长时间)下，rebdm和reba可降解为rebb，从而引起培养液中rebdm含量较低并且rebb含量增加。热处理之后的活的酵母数在表7中示出。在50℃下需要2与24小时之间来杀死酵母，而在75℃或95℃下需要不大于5分钟来杀死酵母。表7实施例3将来自二阶段工艺的命名为a的菌株的发酵液在75℃下加热一小时。二阶段进料速率在以下示出：基于nexcelomcellometer方法通过荧光染料对酵母细胞进行染色。热处理之前活细胞在显微镜下显示绿色，并且热处理之后死细胞显示红色。亮视场显微镜图像显示热处理之后缺少碎片(将图5a与图5b进行比较)，从而指示酵母细胞甚至在热处理之后也是完整的。序列表<110>嘉吉公司<120>产生糖苷的热处理<130>car0211/wo<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>460<212>prt<213>steviarebaudiana<400>1metalagluglnglnlysilelyslysserprohisvalleuleuile151015propheproleuglnglyhisileasnpropheileglnpheglylys202530argleuileserlysglyvallysthrthrleuvalthrthrilehis354045thrleuasnserthrleuasnhisserasnthrthrthrthrserile505560gluileglnalaileseraspglycysaspgluglyglyphemetser65707580alaglyglusertyrleugluthrphelysglnvalglyserlysser859095leualaaspleuilelyslysleuglnsergluglythrthrileasp100105110alaileiletyraspsermetthrglutrpvalleuaspvalalaile115120125glupheglyileaspglyglyserphephethrglnalacysvalval130135140asnserleutyrtyrhisvalhislysglyleuileserleuproleu145150155160glygluthrvalservalproglypheprovalleuglnargtrpglu165170175thrproleuileleuglnasnhisgluglnileglnserprotrpser180185190glnmetleupheglyglnphealaasnileaspglnalaargtrpval195200205phethrasnserphetyrlysleugluglugluvalileglutrpthr210215220arglysiletrpasnleulysvalileglyprothrleuprosermet225230235240tyrleuasplysargleuaspaspasplysaspasnglypheasnleu245250255tyrlysalaasnhishisglucysmetasntrpleuaspasplyspro260265270lysgluservalvaltyrvalalapheglyserleuvallyshisgly275280285progluglnvalglugluilethrargalaleuileaspseraspval290295300asnpheleutrpvalilelyshislysglugluglylysleuproglu305310315320asnleusergluvalilelysthrglylysglyleuilevalalatrp325330335cyslysglnleuaspvalleualahisgluservalglycyspheval340345350thrhiscysglypheasnserthrleuglualaileserleuglyval355360365provalvalalametproglnpheseraspglnthrthrasnalalys370375380leuleuaspgluileleuglyvalglyvalargvallysalaaspglu385390395400asnglyilevalargargglyasnleualasercysilelysmetile405410415metgluglugluargglyvalileilearglysasnalavallystrp420425430lysaspleualalysvalalavalhisgluglyglyserseraspasn435440445aspilevalgluphevalsergluleuilelysala450455460<210>2<211>481<212>prt<213>steviarebaudiana<400>2metaspalametalathrthrglulyslysprohisvalilepheile151015propheproalaglnserhisilelysalametleulysleualagln202530leuleuhishislysglyleuglnilethrphevalasnthraspphe354045ilehisasnglnpheleugluserserglyprohiscysleuaspgly505560alaproglypheargphegluthrileproaspglyvalserhisser65707580proglualaserileproilearggluserleuleuargserileglu859095thrasnpheleuaspargpheileaspleuvalthrlysleuproasp100105110proprothrcysileileseraspglypheleuservalphethrile115120125aspalaalalyslysleuglyileprovalmetmettyrtrpthrleu130135140alaalacysglyphemetglyphetyrhisilehisserleuileglu145150155160lysglyphealaproleulysaspalasertyrleuthrasnglytyr165170175leuaspthrvalileasptrpvalproglymetgluglyileargleu180185190lysasppheproleuasptrpserthraspleuasnasplysvalleu195200205metphethrthrglualaproglnargserhislysvalserhishis210215220ilephehisthrpheaspgluleugluproserileilelysthrleu225230235240serleuargtyrasnhisiletyrthrileglyproleuglnleuleu245250255leuaspglnileprogluglulyslysglnthrglyilethrserleu260265270hisglytyrserleuvallysglugluproglucyspheglntrpleu275280285glnserlysgluproasnservalvaltyrvalasnpheglyserthr290295300thrvalmetserleugluaspmetthrglupheglytrpglyleuala305310315320asnserasnhistyrpheleutrpileileargserasnleuvalile325330335glygluasnalavalleuproprogluleuglugluhisilelyslys340345350argglypheilealasertrpcysserglnglulysvalleulyshis355360365proservalglyglypheleuthrhiscysglytrpglyserthrile370375380gluserleuseralaglyvalprometilecystrpprotyrsertrp385390395400aspglnleuthrasncysargtyrilecyslysglutrpgluvalgly405410415leuglumetglythrlysvallysargaspgluvallysargleuval420425430glngluleumetglygluglyglyhislysmetargasnlysalalys435440445asptrplysglulysalaargilealailealaproasnglyserser450455460serleuasnileasplysmetvallysgluilethrvalleualaarg465470475480asn<210>3<211>458<212>prt<213>steviarebaudiana<400>3metgluasnlysthrgluthrthrvalargargargargargileile151015leupheprovalpropheglnglyhisileasnproileleuglnleu202530alaasnvalleutyrserlysglypheserilethrilephehisthr354045asnpheasnlysprolysthrserasntyrprohisphethrphearg505560pheileleuaspasnaspproglnaspgluargileserasnleupro65707580thrhisglyproleualaglymetargileproileileasngluhis859095glyalaaspgluleuargarggluleugluleuleumetleualaser100105110glugluaspglugluvalsercysleuilethraspalaleutrptyr115120125phealaglnservalalaaspserleuasnleuargargleuvalleu130135140metthrserserleupheasnphehisalahisvalserleuprogln145150155160pheaspgluleuglytyrleuaspproaspasplysthrargleuglu165170175gluglnalaserglypheprometleulysvallysaspilelysser180185190alatyrserasntrpglnileleulysgluileleuglylysmetile195200205lysglnthrlysalaserserglyvaliletrpasnserphelysglu210215220leugluglusergluleugluthrvalilearggluileproalapro225230235240serpheleuileproleuprolyshisleuthralaserserserser245250255leuleuasphisaspargthrvalpheglntrpleuaspglnglnpro260265270proserservalleutyrvalserpheglyserthrsergluvalasp275280285glulysasppheleugluilealaargglyleuvalaspserlysgln290295300serpheleutrpvalvalargproglyphevallysglyserthrtrp305310315320valgluproleuproaspglypheleuglygluargglyargileval325330335lystrpvalproglnglngluvalleualahisglyalaileglyala340345350phetrpthrhisserglytrpasnserthrleugluservalcysglu355360365glyvalprometilepheserasppheglyleuaspglnproleuasn370375380alaargtyrmetseraspvalleulysvalglyvaltyrleugluasn385390395400glytrpgluargglygluilealaasnalaileargargvalmetval405410415aspgl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