本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳清多肽螯合亚铁生物补铁剂及其制备方法。
背景技术：
乳清多肽具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性，这有利于提高乳清产品的附加值。乳清多肽更容易被人体吸收，还减少婴幼儿过敏反应。它可安全食用，营养价值高，有较强的生理保健功能。因此，在日常生活照常被用作食品添加剂、功能性食品及药品。另外，它还有益于机体的生长和发育，对疾病等也起到良好的防治效果。
铁是人体必需的矿物质，膳食中的铁主要以fe3+存在，机体无法直接利用，易引起铁缺乏。全球约三分之一的人口患有缺铁性贫血，其中孕妇、乳母、婴幼儿、老年人中更易发生。正常小儿每日损失的铁量极微小，但小儿因不断生长发育需要，故每日需从膳食中补充的铁比成人多，约6mg/day-16mg/day。孕妇在怀孕早期缺铁性贫血的发病率为10%，孕中期为14%，孕晚期为33%。老年人易发生缺铁性贫血是因为其吸收利用铁的能力下降，造血功能衰退。
对食品进行铁强化是补铁的理想解决方法。但是，如果在食品中直接添加无机铁、有机铁进行强化，会对食品品质产生不利影响。例如，溶解度低、呛口、沙粒感等，而且这样直接食用的补铁剂在血液中的铁吸收率较低、稳定性差，而且会刺激胃肠道。因此，探求利用率高、副作用小的铁强化剂是今后研究的重点。
金属离子与肽螯合后不必走离子通道，可进入肽通道被吸收，较大程度促进了铁的吸收。根据“小肽吸收理论”，小肽作为蛋白质的消化终产物，可整体通过肠粘膜细胞并参与体循环。肽在人体内具有相对独立的吸收机制，具有吸收快、效率高、能耗低、载体不易饱和等优势。乳清多肽螯合亚铁是乳清多肽与二价铁离子螯合而生成的生物态铁，在体内始终处于可吸收的二价状态，可以直接被肠粘膜细胞吸收，无毒副作用，不产生任何消化道刺激症状，生物利用率高，是一种理想的补铁剂。
本发明提高了乳清产品的附加值，为金属螯合物及补铁剂的研究提供理论基础，制备的乳清多肽螯合亚铁具有一定的抗菌、抗氧化、抗贫血活性，安全无毒，生物活性高，其可作为具有抗菌、抗氧化、抗贫血功能的添加剂应用于食品、药品、保健品、化妆品等行业中。此外，乳清多肽螯合亚铁具有一定的生物学活性，本发明将加大推动乳清多肽螯合亚铁在医药领域的深入研究。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种吸收利用率高、稳定性好的制备乳清多肽螯合亚铁生物补铁剂的方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种乳清多肽螯合亚铁生物补铁剂及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将乳清多肽配置成一定浓度的溶液，调节ph，按比例加入fecl2溶液，响应面法优化螯合条件，在ph7.0、30℃条件下螯合反应30min，得到乳清多肽螯合亚铁，螯合率为94.54%；
（2）根据乳清多肽螯合亚铁的溶解性、吸湿性、热变性、紫外全波段扫描，研究不同铁离子添加量对乳清多肽螯合亚铁理化性质的影响，确定最适的铁离子添加量；
（3）将乳清多肽螯合亚铁透过分子质量为3ku的超滤膜，在0.3mpa压力下超滤60min，再经旋转蒸发浓缩、冻干，测定乳清多肽螯合亚铁的抗菌、抗氧化活性；
（4）进行动物实验，研究乳清多肽螯合亚铁的安全性和抗贫血性。
采用响应面法优化乳清多肽与亚铁离子螯合反应的步骤如下，以螯合时间、螯合温度、ph、铁肽质量比为考察因素，以螯合率为评价指标，先后设计单因素实验和响应面实验，分析得到最佳的反应条件，并测得在此条件下的螯合率。
研究最适的铁离子添加量的步骤如下：按乳清多肽加入量的1/1、1/2、1/3、1/4加入铁盐，根据加入的铁盐的不同，将实验分成四组，分别测定乳清多肽螯合亚铁的溶解性和吸湿性，分析乳清多肽螯合亚铁的紫外全波段扫描图，确定螯合反应的铁离子的添加量。
超滤法分离乳清多肽螯合亚铁，测定抗菌、抗氧化活性的步骤如下：将乳清多肽亚铁螯合物在0.3mp压力下一次透过分子质量为1、3、5、10ku的超滤膜超滤，测定此条件下的抗菌、抗氧化活性，确定超滤膜的分子质量；根据确定的超滤膜，以料液温度、超滤时间、料液ph和原料质量分数为研究对象，以抗菌、抗氧化活性为评价指标，正交实验优化超滤分离条件，获得在此条件下的抗菌、抗氧化活性。
采用动物实验测定乳清多肽螯合亚铁的安全性和抗贫血效果的步骤如下：以大鼠为研究对象，雌雄各半，平均分为5组（a、b、c、d、e组），a组为正常大鼠，其余各组均为贫血大鼠，根据正常大鼠每日摄入铁量，b组每天以乳清螯合亚铁补铁剂灌胃，c组每天以硫酸亚铁灌胃，d组不做处理，e组喂养正常饲料，分别检测0、7、14、30天后各组大鼠的体重、血常规指标、血清铁蛋白含量、肠道微生物变化和肝脏、小肠的he染色结果，由此得出乳清多肽螯合亚铁的抗贫血效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为以下几个方面：
（1）本发明首次实现了乳清多肽螯合亚铁的研究，制备有机铁营养强化剂，一方面减少胃酸对铁剂的分解作用，大大提高了铁的生物利用率，另一方面，乳清多肽过敏性低、营养价值高、易吸收，起到肽与铁同补功效，填补了国内在此方面的研究空白；
（2）本发明研究了乳清多肽与亚铁离子的反应规律以及乳清多肽螯合亚铁的理化性质，并确定了最适铁离子的添加量，为补铁剂的生产提供理论基础；
（3）目前国内还没有乳清多肽螯合亚铁的大规模生产，本发明方法适合工业化生产，填补了国内在该领域的空白；
（4）利用该发明技术生产的乳清多肽螯合亚铁具有一定的生物学活性，本发明将加大推动多肽螯合物在医学领域的深入研究。
具体实施方式
以下结合具体实施实例对本发明作进一步的详细说明。
一、乳清多肽螯合亚铁最佳螯合工艺的确定
将乳清多肽配制成一定浓度的溶液，调节ph，按比例加入fecl2溶液，设计响应面实验，考察螯合温度、螯合时间、ph、铁肽比对螯合工艺的影响，优化出乳清多肽螯合亚铁的最佳工艺为：螯合温度30℃、螯合时间30min，ph7.0、铁肽质量比1:3，螯合反应完成后进行真空浓缩，真空浓缩的温度40-45℃，时间为3-4h，最后冷冻干燥后得到乳清多肽亚铁螯合物粉末，冷冻干燥的温度为-40~-50℃，时间为18-24h。
螯合率的测定：采用邻二氮菲法
（1）标准曲线的绘制：精确称取0.497g硫酸亚铁（feso4·7h2o）溶于100ml水中，加入5ml浓硫酸，微热，溶解后即滴加2%高锰酸钾溶液，至最后一滴红色不褪色为止，用水定容至100ml，摇匀，得标准贮备液，此液每毫升含100μgfe3+；取铁标准贮备液10ml于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，得标准工作液。此液每毫升含fe3+10μg；精确吸取上述铁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加入1mol/l盐酸溶液1ml、10%盐酸羟铵1ml、0.12%邻二氮菲（现配现用）1ml，然后加入10%乙酸钠溶液5ml，用水稀释至刻度，摇匀；以不加铁的试剂空白液作参比液，在510nm波长处，用1cm比色皿测光密度，绘制标准曲线；
（2）螯合铁源溶液浓度的确定：取1mlfe2+的铁源溶液稀释定容到100ml，取1ml按标准曲线绘制操作，定容至50ml，测定其光密度，在标准曲线上查到相应的铁浓度c1(μg/ml)，通过换算，可求得加入铁源溶液中总的亚铁含量m1(g)，即m1(g)=c1×50×100/106×v1，其中，v1（ml）表示加入的总铁源溶液的体积。
（3）游离亚铁离子含量测定：将螯合液定容到100ml，精确吸取5ml螯合液定容到100ml，取1ml按标准曲线绘制操作，定容至50ml，测定其光密度，在标准曲线上查得相应的铁浓度c2（μg/ml），通过计算可求得游离亚铁离子含量为m2（g），
螯合率的计算公式为：
公式中，m1—铁源溶液中总的亚铁含量（g）；m2—游离亚铁离子含量（g）。
本发明中乳清多肽螯合亚铁的螯合率为94.54%。
二、最适铁离子添加量的确定
根据加入的铁盐的不同，将实验分成四组，分别测定乳清多肽螯合亚铁的溶解性和吸湿性，分析乳清多肽螯合亚铁的紫外全波段扫描图，确定螯合反应的铁离子的添加量。
乳清多肽螯合亚铁溶解性的测定：按乳清多肽加入量的1/1、1/2、1/3、1/4加入铁盐，在不同ph（3、4、5、6、7、8）条件下进行螯合，在12000r/min、4℃条件下离心10min，溶解性=（上清液含氮量/样品总氮）×100%。
乳清多肽螯合亚铁吸湿性测定：按乳清多肽加入量的1/1、1/2、1/3、1/4加入铁盐，根据加入的铁盐的不同，将实验分成四组，将乳清多肽亚铁螯合物进行冷冻干燥后的粉末准确称取1g于培养皿中，置于培养箱中吸湿，控制相对湿度分别为43%，温度25℃，分别吸湿2、4、6、8、10、12、24h后各试样的质量；
吸湿性=[（wn-wo）/wo]×100%，其中，wn：吸湿后样品质量，wo：吸湿前样品质量。
乳清多肽螯合亚铁紫外全波段扫描分析：按乳清多肽加入量的1/1、1/2、1/3、1/4加入铁盐，根据加入的铁盐的不同，将实验分成四组，分别称取相同质量的螯合物，用适量的去离子水溶解后进行紫外全波段扫描，扫描间距为0.1mm，观察吸收峰。
本发明确定的乳清多肽螯合亚铁的最适铁离子添加量为乳清多肽的1/3。
三、超滤法分离乳清多肽螯合亚铁，测定抗菌、抗氧化活性。
将乳清多肽螯合亚铁在0.3mp压力下进行超滤，一次透过分子质量为1、3、5、10ku的超滤膜超滤，分别得到质量分数为<1ku，1-3ku，3-5ku，5-10ku的乳清多肽亚铁螯合物滤出液，经旋转蒸发浓缩、冻干，测定此条件下的抗菌、抗氧化活性，确定超滤膜的分子质量。
乳清多肽螯合亚铁的抗氧化活性（清除dpph自由基活性）的测定：称取dpph试剂0.0992g，用无水乙醇定容至25ml容量瓶中作为储备液，4℃避光保存；使用时取2ml储备液用无水乙醇定容至100ml容量瓶中，摇匀备用；向不同试管加入等体积不同浓度的溶剂、样品液，混匀后室温避光反应30min，在517nm处测定其吸光度，每个浓度组平行测3次取平均值。
清除率计算公式：e（%）=[a0-(a1-a2)]/a0×100%；
其中，a0为无水乙醇+dpph的吸光度；a1为样品液+dpph的吸光度；a2为样品液+无水乙醇的吸光度。
乳清多肽螯合亚铁抗菌活性的测定：采用试管法，测定其抑制金黄色葡萄球菌生长的活性；取4ml灭菌的液体培养基，加入0.3ml含菌量的液体培养基，加入0.3ml含菌量为107-108个/ml，混匀后于37℃培养24h，测od600；空白对照为灭菌液体培养基，加入0.3ml含菌量为107-108个/ml的金黄色葡萄球菌，制成悬浮液，再加无菌水1ml。
抑菌活性（%）=[（od对照-od样品）/od对照]×100%，式中，od为三次平行实验的平均值。
本发明选择透过分子量为3ku的超滤膜作为作用膜。
根据确定的超滤膜，以料液温度、超滤时间、料液ph和原料质量分数为研究对象，以抗菌、抗氧化活性为评价指标，正交实验优化超滤分离条件为超滤膜分子质量为3ku，多肽螯合亚铁质量分数30%，ph6.5，温度35℃，时间60min，乳清多肽螯合亚铁抗菌活性为93.5%，抗氧化活性为84.2%
四、乳清多肽螯合亚铁的抗贫血研究
以大鼠为研究对象，雌雄各半，平均分为5组（a、b、c、d、e组），a组为正常大鼠，其余各组均为贫血大鼠，根据正常大鼠每日摄入铁量，b组每天以乳清螯合亚铁补铁剂灌胃，c组每天以硫酸亚铁灌胃，d组不做处理，e组喂养正常饲料，分别检测0、7、14、30天后各组大鼠的体重、血常规指标、血清铁蛋白含量、肠道微生物变化和肝脏、小肠的he染色结果，由此得出乳清多肽螯合亚铁的抗贫血效果。
本发明动物实验结果为，所有实验组大鼠在给药期间均毛色正常、精神状态良好，说明乳清多肽螯合亚铁具有一定的安全性；乳清多肽螯合亚铁对大鼠体重升高的影响显著，从侧面验证了乳清多肽螯合亚铁具有易吸收的特性；血常规实验中，乳清多肽螯合亚铁对rbc、mcv、hgb、mch均有显著升高的趋势，并且比硫酸亚铁和含铁饲料效果好；血清铁蛋白实验中，乳清多肽螯合亚铁较硫酸亚铁、含铁饲料，对血清铁蛋白的升高作用最显著；肠道菌实验中，贫血大鼠灌胃乳清多肽螯合亚铁后与正常大鼠相比，肠道细菌及菌量未有较大改变，说明乳清多肽螯合亚铁不会对肠道菌产生影响；he染色实验中，灌胃乳清多肽螯合亚铁的贫血大鼠的内脏组织并未发生病变，从另一方面证明了乳清多肽螯合亚铁的安全性；综上所述，乳清多肽螯合亚铁确实有一定的安全抗贫血效果。
总结
（1）本发明通过响应面优化实验，得到乳清多肽螯合亚铁的最优条件为：螯合温度30℃、螯合时间30min，ph7.0、铁肽质量比1:3，在此条件下的螯合率为94.54%；通过考察乳清多肽螯合亚铁的溶解性、吸湿性和紫外全波段扫描，研究不同铁离子的添加量对乳清多肽螯合亚铁的理化性质的影响，确定铁离子的最适添加量为乳清多肽的1/3；采用超滤膜对乳清多肽螯合亚铁进行分级分离，并分析其抗菌抗氧化活性，获得最佳膜分离条件是：超滤膜分子质量为3ku，多肽螯合亚铁质量分数30%，ph6.5，温度35℃，时间60min，此时多肽亚铁螯合物抗菌活性为93.5%，抗氧化活性为84.2%。
（2）乳清多肽螯合亚铁生物补铁剂的铁含量为115.18mg/g，对其补铁效果进行研究表明，乳清多肽螯合亚铁安全无毒，且具有较好的抗贫血效果，可成为新一代的补铁剂。