一种酸性蛋白酶在食品和/或饲料领域中的应用的制作方法

本发明属于生物工程
技术领域：
，特别涉及一种酸性蛋白酶在食品和/或饲料领域中的应用。
背景技术：
：凝乳酶是奶酪生产中使乳液凝固的关键性酶，它对奶酪的产量和风味有重大的影响，据统计，凝乳酶的产值占整个酶制剂总产值的15.5％。凝乳酶可以分为3类：动物性凝乳酶，植物性凝乳酶和微生物凝乳酶。动物性凝乳酶约占市场份额的70％，其中的小牛皱胃酶是目前效果最好的凝乳酶，但新生小牛的皱胃数量有限，这种方法的成本大产量少，无法满足工业生产的需要，另外从猪羊等其他动物提取凝乳酶生产的奶酪的风味不佳，无法很好的替代；植物性凝乳酶主要来自木瓜、无花果等植物，有木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、无花果蛋白酶、合欢蛋白酶、菠萝蛋白酶、朝鲜蓟蛋白酶等，但这些凝乳酶凝乳活性低，蛋白水解活性强且容易产生苦味；而微生物产的凝乳酶，其生产周期短，产量大，受环境因素影响小，生产成本较低，拥有巨大的发展前景。此外，现有的大部分凝乳酶热稳定较高，给奶酪熟化带来不利影响，降低奶酪的产量，而且对风味造成不利的影响。谷朊粉是是以小麦为原料，经过深加工提取的一种天然谷物蛋白。它在食品、饲料、化工和造纸等工业有着广泛的用途，如用于面包、面条、肉类、鱼类、家禽产品、宠物食品、饲料、比萨和调味品等。但是谷朊粉蛋白含有较多的疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，分子内的疏水作用区域较大，溶解度极低，溶解的蛋白质在水溶液中的回收率低，往往不能满足实际应用中加工的需要，很大程度上限制了谷朊粉的应用。所以目前针对于谷朊粉的改性方法研究是一个突破口，改性方法可以分为物理法、化学法和酶法。相对于物理法、化学法，酶法改性速度快，条件温和，能耗低，反应效率高，不需要特殊的设备，一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理方面的问题。因此，酶法改性在提高谷朊粉的应用价值中具有重大意义和发展前景。目前在对谷朊粉进行酶法改性的研究中，2007年Kong的研究表明碱性蛋白酶Alcalase2.4L对谷朊粉的改性效果远好于PTN6.0S，胃蛋白酶，Neutrase，胰酶和Protamex；2014年付博菲报道了在对谷朊粉改性的效果中，复合蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞风味蛋白酶；碱性蛋白酶由于其低廉的价格和较好的改性效果是目前谷朊粉酶解中较为理想的蛋白酶。大豆蛋白中含有甲硫氨酸，其余必需氨基酸含量均较丰富，是目前最具营养价值的植物性蛋白质。而且以大豆蛋白为代表的植物蛋白，产量大，获取渠道简单，加工简单，成本价格远低于动物性蛋白，是人类食品添加蛋白以及动物饲料添加蛋白的廉价优质蛋白来源。但是大豆蛋白溶解度较低，有一定抗原性，消化率和生物效价低于动物蛋白，而且其中含有抗营养因子，不容易消化吸收，对喂养的动物产品尤其是水产动物的质量与产量造成不利影响，限制了其在动物饲料中的广泛应用。通过水解获得的大豆蛋白多肽，具有容易吸收，迅速为机体提供能力和氨基酸，无残渣，分子量小，易溶于水等多项优点，是理想的大豆深加工产品。2015年Pia的研究表明在大豆蛋白水解中碱性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果要比Neutrase、Corolase、PTN6.0S、Flavourzyme、Protamex和ProteaseN-01要好。目前为止，尚未有人分离纯化过哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人将其用于乳类凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酸性蛋白酶在食品和/或饲料领域中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种酸性蛋白酶在食品和/或饲料领域中的应用，所述的酸性蛋白酶为蛋白酶P6281。所述的应用优选为所述的酸性蛋白酶在改性乳类和/或豆类中的应用。所述的应用优选为所述的酸性蛋白酶在乳类凝乳中的应用。所述的乳类优选为脱脂奶粉、全脂奶粉、配方奶粉、鲜乳和加工乳中的一种或至少两种。所述的食品优选为奶酪。所述的应用优选为所述的酸性蛋白酶在溶解谷朊粉中的应用。所述的应用优选为所述的酸性蛋白酶在大豆蛋白水解中的应用。所述的蛋白酶P6281的应用条件优选为：pH为2.5～6，温度为35℃±5℃；进一步优选为pH为2.5，温度为40℃。所述的蛋白酶P6281优选通过如下步骤制备得到：克隆p6281编码基因，并构建可以表达P6281的菌株，表达蛋白酶P6281，纯化后获得蛋白酶P6281。所述的p6281编码基因来源于哈茨木霉。所述的哈茨木霉优选为哈茨木霉GIM3.442。所述的菌株优选为毕赤酵母；进一步优选为毕赤酵母GS115。所述的蛋白酶P6281更优选通过如下具体步骤得到：(1)培养哈茨木霉；(2)提取哈茨木霉总RNA；(3)通过RT-PCR获得p6281编码基因；(4)获取TA克隆与重组质粒的筛选鉴定；(5)将经过鉴定的基因p6281转化毕赤酵母GS115；(6)酸性蛋白酶P6281的发酵诱导及纯化；(7)重组蛋白的SDS-PAGE检测。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.目前尚未有人分离纯化过哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人将其用于凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。本发明在首次成功表达纯化了哈茨木霉的酸性蛋白酶P6281的基础上，首次将其应用于凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。2.本发明所用的P6281蛋白酶，其发酵液蛋白酶活为每毫升321.8个单位，比酶活为每毫克4373.1个单位，高于现有技术中木霉属酸性蛋白酶，如2007年Liu在酿酒酵母表达的哈茨木霉SA76酸性蛋白酶发酵液酶活10.5U/mL，2010年Guo在酿酒酵母表达的粗糙链孢菌酸性蛋白酶发酵液酶活6.8U/mL，2013年Yang在毕赤酵母表达的棘孢木霉酸性蛋白酶发酵液酶活18.5U/mL，2014年Dou在大肠杆菌表达的棘孢木霉ASP55酸性蛋白酶纯酶液酶活9.52U/mL。3.蛋白酶P6281的凝乳活性好，且热稳定性较低，解决了现有技术中的蛋白酶会给奶酪熟化带来不利影响，降低奶酪的产量，影响风味等技术问题。4.蛋白酶P6281对谷朊粉或大豆蛋白的高效水解，效果均优于目前在谷朊粉体外水解中被认为是效果最好的碱性蛋白酶和水解大豆蛋白性能最好的碱性蛋白酶和胃蛋白酶。同时，蛋白酶P6281作为酸性蛋白酶，更适合在哺乳动物酸性胃液中发挥作用。谷朊粉和大豆蛋白都是动物饲料的重要原料，酸性蛋白酶P6281对其高效水解，使其在食品或饲料中具有很好的应用前景。附图说明图1是蛋白酶P6281热稳定性测定的结果分析图。图2是蛋白酶P6281的凝乳效果照片图。图3是蛋白酶P6281对提高谷朊粉溶解度的效果照片图。图4是重组表达载体pPIC9BM-p6281的质粒图谱图。图5是重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，M表示标准分子量蛋白，泳道1是经过4天发酵诱导后得到的粗酶液，泳道2是经过5天发酵诱导后纯化后的样品，泳道3是经过5天发酵诱导的粗酶液，泳道4是经过5天诱导的转化空载体的毕赤酵母上清液。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中所用的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、大豆蛋白均购自奥博星生物技术公司；脱脂奶粉、BCA试剂盒均购自生工生物工程股份有限公司；谷朊粉(总蛋白量为75％)购自蜜丹儿天猫旗舰店。实施例1蛋白酶P6281的获得与酶活测定(1)将通过基因工程技术获得的重组毕赤酵母接种到BMGY培养基(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)中，在30℃下220rpm培养1～2天，离心获得菌体沉淀并转接于2倍体积的BMMY培养基中，在28℃下220rpm培养5天，每隔24小时添加相当于1.5％培养基体积的甲醇，最终获得发酵液；(2)将发酵液离心获得粗酶液，通过镍柱亲和层析和SephadexG-75分子筛层析获得纯酶液，其中镍柱亲和层析所用洗脱液为0.01M咪唑、0.5MNaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH7.4)；SephadexG-75柱层析所用冲洗液为0.05MNaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH6.0)；(3)蛋白酶活测定：采用《SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法》中的“福林法”测定P6281的蛋白酶活。把1mL用pH2.5乳酸缓冲液(0.1M乳酸钠溶液用乳酸调至pH＝2.5)适当稀释的酶液与1mL含有2％酪蛋白的pH2.5乳酸缓冲液分别在40℃预热10分钟，充分混匀后在40℃水浴反应20分钟，马上加入2mL0.4M三氯乙酸终止反应，在12000rpm离心10分钟后吸取1mL上清加入5mL0.4M的碳酸钠溶液，然后再加入1mL稀释的福林酚溶液，充分混匀后在40℃水浴显色20分钟，然后在660nm吸光度测量吸光值，并根据实验前作好的标准酪蛋白梯度浓度溶液-吸光值曲线计算蛋白酶酶活，以100℃沸水浴10分钟的酶液作为空白对照。(4)热稳定性测定：先把1mL用pH2.5乳酸缓冲液适当稀释的酶液分别置于30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下温育相应时间(不温育、温育5min、10min、30min、60min、120min)，再用前述蛋白酶活测定方法分别测定蛋白酶酶活。以在pH2.5、40℃下每分钟水解生产1μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活单位(U)测得发酵液蛋白酶活为每毫升321.8个单位，比酶活为每毫克4373.1个单位。与现有报道的木霉属酸性蛋白酶相比处于较高水平，如2007年Liu在酿酒酵母表达的哈茨木霉SA76酸性蛋白酶发酵液酶活10.5U/mL，2010年Guo在酿酒酵母表达的粗糙链孢菌酸性蛋白酶发酵液酶活6.8U/mL，2013年Yang在毕赤酵母表达的棘孢木霉酸性蛋白酶发酵液酶活18.5U/mL，2014年Dou在大肠杆菌表达的棘孢木霉ASP55酸性蛋白酶纯酶液酶活9.52U/mL。蛋白酶P6281的最适作用温度为40℃，温度超过40℃不稳定。热稳定性测试结果如图1所示，结果显示热稳定性不强。最适作用pH为2.5，在pH3.0～6.0较为稳定；米氏动力学常数Km为1.880g/L，Kmax为1.961g/L；Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)对P6281有非常显著的抑制作用，Ca2+，Mn2+和Cu2+对酶有促进作用，非离子型离子去污剂几乎不影响酶的活性。实施例2蛋白酶P6281凝乳活性测定蛋白酶P6281凝乳活性测定再用Arima法，用pH3.0的乳酸缓冲液配制含有10mMCaCl2的10％的脱脂奶粉溶液，在脱脂奶粉溶液中添加0.1mL适当稀释的发酵液，在35℃水浴反应直至奶粉溶液凝固，记录反应时间，按照MCU＝(24,000×D)/t计算凝乳酶活，其中D为稀释倍数，t为反应时间。以在pH3.0、35℃每40分钟凝固1mL脱脂奶粉溶液所需的酶量为1个酶活单位(MCU)。测得发酵液凝乳活性为每毫升64.3个单位，比酶活为每毫克2188.6个单位，热稳定性较低。图2为P6281对脱脂奶粉溶液的凝乳效果，左边为加入经沸水浴10分钟灭活后的P6281对照组的凝乳结果，右边为P6281的凝乳结果；该结果可以看出经蛋白酶P6281处理后的脱脂奶粉溶液已经凝集成固体，可粘附在倒置的试管底部，而添加灭活酶的脱脂奶粉溶液依然是液态。实施例3蛋白酶P6281在谷朊粉溶解中应用的效果实验用pH2.5的乳酸缓冲液配制5％(w/v)谷朊粉溶液，分别加入P6281与沸水浴10分钟灭活的P6281，40℃水浴6小时，5000rpm离心10分钟。图3为加入已灭活的蛋白酶P6281水浴6小时(左边)和经P6281酶解6小时后(右边)谷朊粉不溶物残余量的对比，酶解后的谷朊粉中可溶解蛋白明显增多，不溶物明显减少。用乳酸缓冲液配制pH2.5、质量体积浓度为5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入P6281纯酶液，得到最终总体积为10mL的溶液；用磷酸缓冲液(0.05M磷酸钠缓冲液)配制pH6.0、质量体积浓度为5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入木瓜蛋白酶，得到最终总体积为10mL的溶液；用碳酸钠缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液)配制pH11.0、质量体积浓度为5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入碱性蛋白酶，得到最终总体积为10mL的溶液。将得到的三组溶液分别在不同蛋白酶各自的最适pH和温度条件(即P6281在pH2.5和40℃、木瓜蛋白酶在pH6.0和60℃、碱性蛋白酶在pH11.0和45℃)下，水浴反应6小时，然后在100℃沸水浴10分钟，5000rpm离心10分钟，上清用BCA试剂盒测定可溶性蛋白质含量，计算可溶蛋白量占初始谷朊粉中总蛋白量的比例为其蛋白回收率。测得蛋白酶P6281蛋白回收率为79.7％，蛋白回收效果比木瓜蛋白酶(16.8％)和碱性蛋白酶(73.2％)好。在谷朊粉体外水解中，碱性蛋白酶被认为是目前效果最好的蛋白酶。在本发明中，P6281对谷朊粉的水解优于碱性蛋白酶，并且P6281作为酸性蛋白酶，更适合在哺乳动物酸性胃液中发挥作用。谷朊粉是动物饲料的重要原料之一，酸性蛋白酶P6281对其高效水解，使其在饲料用的蛋白酶中有很好的应用前景。蛋白酶P6281处理谷朊粉后水溶回收率与其它蛋白酶的比较结果见表1：表1不同蛋白酶处理谷朊粉的蛋白回收率蛋白酶谷朊粉的蛋白回收率未添加蛋白酶3.2％木瓜蛋白酶16.8％碱性蛋白酶73.2％蛋白酶P628179.7％实施例4蛋白酶P6281在大豆蛋白水解中应用的效果实验分别用乳酸缓冲液、磷酸缓冲液和碳酸钠缓冲液配制大豆蛋白在pH2.5，6.0，11.0下饱和浓度的溶液。5000rpm离心10分钟取上清，然后分别用BCA试剂盒测定大豆蛋白上清溶液的蛋白浓度，并以之作为大豆蛋白分别在pH2.5、pH6.0、11.0下的最大溶解浓度，作为样品中原大豆蛋白浓度。取1000U量的P6281纯酶液、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，和上述离心后得到的大豆蛋白上清溶液在40℃分别预热10min，然后分别混合(总体积为10mL)，分别在蛋白酶P6281、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶各自对应的最适条件下(温度和pH条件同实施例3)反应6个小时，沸水浴10min终止反应。分别取上清用甲醛滴定法测定氨基酸含量，取2mL上清加入5mL蒸馏水，用0.1MNaOH标准溶液调节pH至8.2，加入己用0.1MNaOH标准溶液中和的甲醛(pH8.2)，然后用0.1MNaOH标准溶液滴定pH到9.2，记录消耗的NaOH标准溶液体积V1。用蒸馏水代替样品，操作方法相同，测得空白体积V0。则样品中游离氨基的浓度(mmol/L)＝1000×0.1×(V1-V0)/5.0，样品水解度为DH(％)＝100(1000×0.1×(V1-V0)/5.0/C-0.33)/7.8,其中，C为样品中原大豆蛋白浓度(即上文测得的不同pH下的最大溶解浓度)，g/L；0.33为大豆蛋白中游离氨基浓度，mmol/g；7.8为每克大豆蛋白的肽键当量数，mmol/g；通过甲醛滴定法测得蛋白酶P6281的水解度为15.68％，水解度高于其它蛋白酶。不同酶处理大豆蛋白水解度的测定结果见表2：表2不同蛋白酶处理大豆蛋白的水解度酶类大豆蛋白水解度木瓜蛋白酶5.69％碱性蛋白酶8.66％蛋白酶P628115.68％碱性蛋白酶和胃蛋白酶是水解大豆蛋白性能最好的蛋白酶。碱性蛋白酶价格较低，但是它不适合在动物酸性的胃液及中性的肠道中发挥作用，而胃蛋白酶价格昂贵，都限制了它们在动物饲料中的添加。本发明中，P6281对大豆蛋白的水解度远高于碱性蛋白酶，并且P6281作为酸性蛋白酶，更适合在哺乳动物酸性胃液中发挥作用。大豆蛋白是动物饲料的重要原料之一，酸性蛋白酶P6281对其高效水解，使其在饲料用的蛋白酶中有很好的应用前景。上述结果表明酸性蛋白酶P6281具备乳类凝乳、提高谷朊粉溶解度及大豆蛋白水解的应用潜力。实施例5蛋白酶P6281的异源表达及纯化(一)哈茨木霉培养：将哈茨木霉GIM3.442(购于广东省微生物菌种保藏中心)接种至PDA固体培养基(马铃薯粉滤过液200mL，葡萄糖4g，硫酸镁0.75g，磷酸二氢钾0.75g，琼脂粉4g)中，30℃培养2天。(二)哈茨木霉总RNA提取：(1)用高压蒸汽灭菌后的镊子摄取约100mg的菌丝体放入液氮预冷的研钵中，加入少量液氮，用研钵快速研磨，再加入少量液氮，继续研磨，反复3次，直至全部菌丝体彻底变成白色粉末。(2)向研钵中加入2mLRNAisoPlus(购于大连宝生物工程有限公司)，尽量将粉末完全覆盖，然后室温静置，直至RNAisoPlus完全融化，用研钵继续研磨至裂解液呈透明状。将所得的裂解液等量转移至1.5mL离心管中，室温静置5分钟。12000rpm，4℃离心5分钟，小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。(3)向步骤(2)中得到的上清液加入400μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15秒。待溶液充分乳化后，再室温静置数分钟后12000rpm，4℃离心15分钟。(4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色的上清液、中间的白色蛋白层和带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中；(5)向步骤(4)得到的上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟。(6)离心之后，试管底部有沉淀。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1mL75％的乙醇(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒，洗涤离心管管壁，12000rpm，4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。(7)打开离心管盖子，倒置管子，室温干燥沉淀5分钟，加入20μL的RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，将溶解液转移至RNase-free离心管中，置于-80℃保存。(三)RT-PCR克隆p6281编码序列：(1)把下列组分加入到一个无核酶的PCR管中：表3RT-PCR体系(2)65℃保温上述混合物5分钟后迅速置于冰上，再加入4μL5×First-Strandbuffer，2μL0.1MDTT，1μL40U/mLRNase抑制剂于上述混合物中，轻轻混合并在37℃培养2分钟；(3)加入1μL反转录酶，轻轻混合后在37℃培养50分钟；(4)70℃培养15分钟灭活反转录酶，置于-20℃保存；(5)设计正向引物F(5’-CTGCGAATTCTCGCCGGTAAAGCCAAGT-3’)和反向引物R(5’-ACTTACGCGTAGCGGCGGTAGCAAAGC-3’)，下划线的序列分别表示EcoRI酶切位点和MluI酶切位点。以上一步获得的哈茨木霉cDNA为模板，按照以下PCR体系及程序，进行PCR反应获得目的DNA片段；表4PCR体系PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸2分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；然后将产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为120V，25min，琼脂糖凝胶电泳的操作过程参见《分子克隆实验指南》。得到酸性蛋白酶基因条带大小约为1100bp，使用凝胶回收试剂盒回收目的基因。(四)TA克隆与重组质粒的筛选鉴定(1)高保真酶产物经切胶回收后，利用Ex-taq酶进行加A反应，按以下体系将步骤(三)得到的目的基因片段(p6281)与pMD18-T载体(购于大连宝生物工程有限公司)连接，连接条件16℃，2h；表5T载体连接体系然后42℃热击70秒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购买于大连宝生物工程有限公司)，涂布含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL)中，37℃培养过夜。然后使用2×TaqPCRMix进行菌落PCR筛选阳性菌落，反应体系及程序如下：表6菌落PCR体系菌落PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸1分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；然后将产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖浓度为1％，电泳条件为120V，25min，得到酸性蛋白酶基因条带大小约为1100bp；(2)挑取阳性克隆加入到含氨苄抗性的LB液体培养基于37℃，220rpm摇床上扩大培养12h。取扩大培养的菌液于离心管中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，经过测序测得克隆基因长度为1107bp，测序结果如下：其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；(五)基因p6281转化毕赤酵母GS115：(1)提取克隆有酸性蛋白酶基因的pMD18-T-p6281克隆载体质粒，以之为模板进行PCR扩增，PCR体系参照前文表4，然后将产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用试剂盒纯化回收。把表达载体pPIC9K(购买于Invitrogen公司)多酶切位点改造，依次为BamHI，EcoRI，ApaI和MluI，并命名为pPIC9BM(图4)。构建载体使用RF克隆，引物为5’-GAAGCTGGATCCGAATTCCCGCTCGAGGGGCCCACGCGTCATCATCATCATC-3’(下划线的序列分别表示EcoRI酶切位点和MluI酶切位点)，反应体系为：表7RF克隆体系反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10秒；58℃退火15秒；72℃延伸8分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；产物测序鉴定；使用EcoRI和MluI对回收产物和pPIC9BM载体按照说明书进行双酶切(双酶切体系如表8)，用普通DNA回收试剂盒对酶切后的DNA分别进行纯化回收，然后用核酸浓度检测仪检测DNA浓度；表8双酶切体系酶切条件37℃，4h；(2)将纯化回收的蛋白酶基因片段p6281和pPIC9BM载体片断按摩尔比为1：5的比例利用T4连接酶进行体外连接，连接条件22℃，8h，连接体系如下表。表9T4连接酶连接体系将连接后的重组质粒42℃热击70秒转化至大肠杆菌DH5α菌株中。在含有的平板上挑选阳性单菌落，提取其质粒进行双酶切鉴定，并且对该菌株也进行菌液和质粒测序鉴定；对构建成功的表达质粒命名为pPIC9BM-p6281。(3)采用质粒小提试剂盒从阳性克隆菌株的菌悬液中提取表达质粒载体，然后对表达质粒载体用BglII内切酶酶切，将表达质粒载体线性化，酶切体系如下：表10单酶切体系酶切之后，用回收试剂盒回收质粒并测定浓度；(4)制备毕赤酵母GS115感受态，具体步骤如下：a.将-80℃冻存的毕赤酵母GS115菌株于YPD平板(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL)上划线接种，30℃培养3天；b.挑取毕赤酵母GS115菌株的单菌落接种至含有25mLYPD培养液(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养2天；c.取1mL步骤b最终得到的菌悬液接种至另一瓶含有50mLYPD培养液三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养数小时，至菌悬液的OD600达到2.0；d.将菌悬液转移已灭菌的50mL离心管中，5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用预冷的无菌水10mL将菌体重悬，然后转移至15mL离心管中；e.5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用预冷的1M山梨醇10mL将菌体重悬，重复一次；f.5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用1mL1M山梨醇重悬菌体，置于冰上用于电转化；(5)使用电转化法把步骤(3)得到的线性化质粒转入毕赤酵母中，电击条件为1.5kV，2mm电转杯，10ng线性化质粒。把电转化后的菌液涂布MD平板，30℃培养2天，挑选5个单菌落分别接种YPD液体培养基，然后低温裂解毕赤酵母转化子细胞，裂解方法如下：a.从MD平板(葡萄糖20g，YNB13.4g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL)上，挑取10个毕赤酵母转化子单菌落分别接种至2mLYPD培养液中，30℃，220rpm振荡培养2天；b.分别将1mL菌液转移至离心管中，8000rpm离心2min，弃上清；c.加入1mLTEbuffer重悬菌体，8000rpm离心2min，弃上清，重复一次；d.沸水浴30min后转移至-80℃冰箱放置一个小时，然后沸水浴10min；e.8000rpm离心2min，所得上清置于-20℃保存；使用2×TaqPCRMix进行菌落PCR鉴定，反应体系及程序参照表6；(六)P6281的发酵诱导及纯化：挑选阳性重组毕赤酵母菌株划线MD平板，30℃培养2天，挑取单菌落接种于装有50mLBMGY培养液(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)的三角瓶中，30℃，220rpm振荡培养至OD600≈5.0。然后离心收集菌体，等量转移菌体沉淀至装有100mLBMMY培养液的三角瓶中28℃，220rpm振荡培养，每24小时添加1.5％的甲醇溶液进行诱导表达，诱导4～5天。发酵液5000rpm，4℃离心10min取得上清测定酶活；采用《SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法》中的“福林法”测定P6281的蛋白酶活。然后使用镍柱亲和层析和SephadexG-75柱层析纯化目的蛋白，其中镍柱亲和层析上样量为150mL，所用洗脱液为0.01M咪唑、0.5MNaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH7.4)；SephadexG-75柱层析上样量为95mL，冲洗液为0.05MNaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH6.0)。以转化空载体pPIC9BM的GS115菌株作为实验对照。通过前述方法，测得本发明所得的发酵液蛋白酶活为321.8U/mL，比酶活为4373.1U/mg。通过生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白浓度试剂盒测得纯化后的蛋白酶的产量为116.5mg/1000mL发酵液。Suarez等曾分别添加1％的P.ultimum，B.cinerea，R.solani细胞壁和几丁质作为碳源对哈茨木霉的蛋白表达进行研究，哈茨木霉在其中添加B.cinerea细胞壁的条件下表达P6281表达量最大，但其表达的总蛋白量仅为18μg/300mL(包含P6281，未纯化)。由此可见，本发明不仅首次成功异源表达纯化得到P6281，且产量实现了明显提高。(七)重组蛋白的SDS-PAGE检测：利用SDS-PAGE凝胶电泳来确认重组蛋白酶的表达情况、纯度和分子质量的大小。采用的浓缩胶浓度为12％以及分离胶浓度为5％，上样量为20μL，以标准分子量的标准蛋白作为Marker。SDS-PAGE凝胶电泳的操作过程参见《蛋白质电泳实验技术》。对于发酵液样品的制备，诱导表达产生的重组蛋白酶的量较高，可以直接将发酵液稀释1倍后与上样缓冲液混匀，沸水煮沸10min后，12000rpm离心1min，上样后进行电泳。粗酶液(指未经过镍柱亲和层析和SephadexG-75柱层析的发酵液)与纯化后酶液的SDS-PAGE电泳图如图5所示，M表示标准分子量蛋白，泳道1是经过4天发酵诱导后得到的粗酶液，泳道2是经过5天发酵诱导后通过亲和层析和分子筛层析纯化的样品，泳道3是经过5天发酵诱导的粗酶液，泳道4是经过5天诱导的转化空载体的毕赤酵母上清液。由图中可以看出，转化空载体的毕赤酵母并无蛋白表达，而未经纯化的阳性诱导(即泳道1和泳道3)的上清液中均有一深一浅两个蛋白条带，其中深色条带大小接近40kDa，与预期结果相符；而诱导5天的蛋白表达量比4天要大，由泳道2可看出，经过纯化处理后只剩下单一的预期蛋白条带，表明已经成功获得电泳纯级别的酸性蛋白酶P6281。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>华南理工大学<120>一种酸性蛋白酶在食品和/或饲料领域中的应用<130>1<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>28<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RT-PCR正向引物F<400>1ctgcgaattctcgccggtaaagccaagt28<210>2<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RT-PCR反向引物R<400>2acttacgcgtagcggcggtagcaaagc27<210>3<211>1107<212>DNA<213>哈茨木霉<220><223>哈茨木霉蛋白酶p6281目的基因<400>3tcgccggtaaagccaagtgccaagactgccgcgctatcagtgaagcgtgtctcgaacgtc60aaatcattgaagaatattgtccaaaagggccaggcacgcatcaacaagatcaacggcgtc120aaagacatcgaggccagagctagcggcccagccaccaacgaggatgttagctatgttgcc180tcggtcactattggtggtaaatcctgggacctcatcgtcgacactggatcttcaaacacg240tggtgtggtgctcaaagctcatgcgagccttcatctactggcaagtccacgggcggttcc300gtccaggtcagctatggttccggctccttctccggcaccgagtacaaggacacagttagc360ttcggtggtttgactgtcacatcacagtcggttggagctgcccgttcatcctctggcttt420tcaggtgtcgatggaattattggctttggtccggtggatctcactgaggacaccgtctcc480aacgccaacacggttccaaccttcttggataatctctacagccaaggttccatctcgact540gaggtgctgggcgtttctttcaagccagagtctggcagtgacagtgatgacaccaacggc600gagttgaccctcggcggtactgatagctccaagtacacgggctctctcacctacttctca660actctcaagagtggctctgctgctccctactggggcatctctattgctagtttcacctac720ggctcgacgaccctcgcatcgtctgcgaccggcattgtcgacactggtactacgctcatc780tacatccccaccaaggcttacaatgcattcctgtctgccgctggtggcaagactgacagc840tcttctggcctcgccgtcttctcaaaagcgccaacatccaactttgctatcaagtttggc900tcaacgacctacaccctcacaccttctcaatacttggttcccacctctcagtacagcttc960tacggactcagctctggaaagtactacgcttggattaacgacggtggcagctcgggtgtc1020aacaccattattggccagaagttcctggaaaactactactccgtttttgatactaccaac1080ggccgcatcggctttgctaccgccgct1107<210>4<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RF克隆引物<400>4gaagctggatccgaattcccgctcgaggggcccacgcgtcatcatcatcatc52当前第1页1 2 3