本发明涉及食品加工和食品安全领域，具体为水产品食源性致病菌风险控制，特别涉及三文鱼加工与贮藏中李斯特菌的控制。
背景技术：
三文鱼(salmon)是大中型冷水性鱼类，体内不饱和脂肪酸含量丰富，肉质鲜美营养价值较高。随着人民生活水平的提高和对健康饮食的追求，作为一种高营养的健康食品，三文鱼进口量迅速上升，我国已经成为三文鱼的主要进口国之一。由于三文鱼主要以切片生食为主，在加工和贮藏过程中，三文鱼易受单增李斯特菌等食源性致病菌的污染感染。
单增李斯特菌全称单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes)是一种重要的人畜共患疾病病原体，具有耐热(60℃)、耐寒、耐盐、耐干燥等特性，尤其因其耐低温的特点，可在冷藏温度4℃下繁殖生长；一旦人体食用李斯特菌污染的食品，可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等，发病者死亡率可达30％～40％。因此有效地控制三文鱼中的单增李斯特菌极其重要。
用热处理方法可杀灭冷熏三文鱼中的单增李斯特菌(“冷熏三文鱼单增李斯特菌热灭菌规律及其品质变化动力学研究”，《现代食品科技》2015，31(6))，其处理方法为，在58～66℃下加热冷熏三文鱼，使单增李斯特菌失活。随着加热温度升高、时间延长会导致蛋白质组分变性，鱼肉色泽受到影响，并且鱼肉的硬度会发生变化，影响其品质。因此热处理法虽然可以杀灭冷熏三文鱼中的单增李斯特菌，但需要严格控制温度和加热时间，工艺较为复杂。而且加热的方法会影响三文鱼的品质和风味，不适用于生食的鲜三文鱼。
二氧化氯是自来水消毒剂，在众多消毒剂中二氧化氯具有高效性、安全性、经济可行性，而且二氧化氯有很强的反应活性和氧化能力，常用于饮用水处理，表现出良好的消毒效果。二氧化氯还可以进行预氧化和中间氧化，投加在原水沉淀池前或过滤池前，可以控制嗅味、防止微生物滋长，还可以去除水中铁、锰、色度和藻类、氧化硫化物等，逐渐成为氯替代消毒剂而被应用于饮用水处理以及食品保鲜防腐。
本发明对现有技术做出改进，避免加工处理过程中的李斯特菌污染，采用更为安全简单的方法处理用于生食的三文鱼，而不影响三文鱼品质。
技术实现要素：
本发明的目的在于将二氧化氯用于控制三文鱼中的李斯特菌。本发明还提供一种高效控制和预防三文鱼中单增李斯特菌的方法。
本发明技术方案为，将二氧化氯用于控制三文鱼中的李斯特菌，尤其是单增李斯特菌。用二氧化氯溶液浸泡三文鱼，尤其是解冻和去除表皮的三文鱼，能够去除其中的李斯特菌，特别是单增李斯特菌。
一种控制三文鱼中李斯特菌的方法，步骤包括：将待处理的三文鱼在浓度45～200mg/l的二氧化氯溶液中浸泡15～40min。浸泡处理的温度为0℃～室温，优选为4℃～20℃。
优选的方案为，将待处理的三文鱼在浓度48～100mg/l的二氧化氯溶液中浸泡20～40min。更优选的，二氧化氯溶液浓度为48～80mg/l。
更为优选的，将三文鱼去除表皮和解冻后，再用二氧化氯溶液浸泡处理。
优选方案为，三文鱼经过解冻和去除表皮，并且在浓度48～65mg/l二氧化氯溶液中浸泡20～40min。
在本发明的一个优选方案中，三文鱼经过解冻和去除表皮，并且在浓度48～53mg/l二氧化氯溶液中浸泡20～30min，能够完全去除其中被侵染的高浓度单增李斯特菌。
上述处理后的三文鱼肉，经过感官实验，其品质和风味能够满足生食要求。
本发明的有益效果在于，采用二氧化氯作为消毒剂，能够在三文鱼加工贮存中控制单增李斯特菌等食源性致病菌的风险，处理时间短，操作简便。经过上述方法处理的三文鱼，可完全去除其中污染的李斯特菌及其他病原性菌，尤其是彻底杀灭其中的李斯特菌，并有一定的控制和预防效果；安全可靠，处理后的三文鱼肉符合生食的标准；而且本方法避免了热加工破坏三文鱼品质的缺点，用二氧化氯浸泡处理后的三文鱼仍保持较好的感官特性，不影响其品质及风味，适用于生食。
具体实施方式
以下结合具体的实施例来对本发明的技术方案加以说明。下面将结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
(1)单增李斯特菌的准备：将菌株wax12和标准菌株atcc13932在palcam选择性培养基平板上划线，37℃静置过夜培养。分别挑取单菌落至5mlbhi液体培养基于37℃，180r/min震荡培养24h至od600nm＝0.8～1.2左右，得到浓度为108～109cfu/ml菌液。用生理盐水将菌液稀释至8～12cfu/g，将标准菌株atcc13932和野生菌株wax12等量混合，装于灭菌喷壶中备用。
菌株来源为：atcc13932为标准菌株，血清型4b；菌株wax12为野生菌株，由上海海洋大学农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)从生猪肉中分离保存，经过形态学分析、生化特性以及分子生物学鉴定，血清型1/2a。用这两种单增李斯特菌混合菌液模拟可能存在的三文鱼被单增李斯特菌污染的情景。
(2)原料鱼单增李斯特菌检测：三文鱼整鱼带冰运输至上海海洋大学农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室。冰水解冻后，在无菌安全柜中，用棉拭子直接涂擦三文鱼原鱼(表皮、去皮后鱼肉表面及内腔)，平板涂布于palcam选择性培养基平板上，37℃培养24小时，检测鱼体单增李斯特菌污染情况，结果显示均为阴性，原料鱼上无单增李斯特菌污染，如表1。
表1原料鱼上单增李斯特菌检验
采用两种方法检测三文鱼中可能存在的单增李斯特菌，分别是基于国标gb4789.30-2016的单增李斯特菌palcam平板计数法(palcamagar)，以及采用特异性引物pcr序列扩增的分子生物学方法(u.sfdadetectionandenumerationoflisteriamonocytogenesinfoods)。单增李斯特菌特异性引物序列如表2。
表2单增李斯特菌特异性引物序列
(3)单增李斯特菌侵染三文鱼和二氧化氯溶液处理：三文鱼整鱼经冰水解冻后，用步骤(1)的李斯特菌混合菌液喷淋接种(8～12cfu/g鱼肉)，4℃下菌株粘附和侵染3h。或者，三文鱼整鱼冰水解冻后去除，用步骤(1)的李斯特菌混合菌液喷淋接种(8～12cfu/g鱼肉)，4℃下菌株粘附和侵染3h。
用二氧化氯泡腾片配制成溶液。侵染后的三文鱼用不同浓度的二氧化氯(clo2)溶液浸泡处理，每个实验重复三次。检验结果如表3所示。
a.不去除表皮的三文鱼侵染李斯特菌后，分别用浓度为48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l的二氧化氯溶液在4℃～10℃下浸泡20min，评判灭杀单增李斯特菌的效果。
(a)按照国标，用palcam平板法检测三文鱼表皮、去皮后鱼肉表面和内腔中单增李斯特菌残留量，流程如下：
三文鱼→冰水解冻→喷淋接菌(8～12cfu/g)→菌株粘附和侵染(4℃，3h)→二氧化氯(clo2，48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l)浸泡20min→棉拭子涂擦取样(表皮、去皮后鱼肉表面和内腔)→平板涂布(palcamagar)。
(b)分子生物学方法检测经过浸泡后鱼肉内部的单增李斯特菌：二氧化氯溶液浸泡后，去除三文鱼表皮，取鱼肉(对不同部位分别取肉5g，共50g)均质后收集菌体，提取细菌dna，用特异性引物pcr扩增，检测三文鱼鱼肉表面单增李斯特菌残留量，流程如下：
三文鱼→冰水解冻→喷淋接菌(8～12cfu/g)→菌株粘附和侵染(4℃，3h)→二氧化氯(clo2，48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l)浸泡20min→去皮→取样→取鱼肉(对不同部位分别取肉5g，共50g)→均质→收集菌体→提取细菌dna→特异性引物pcr扩增单增李斯特菌。
b.三文鱼除表皮后用李斯特菌侵染菌，并分别用浓度为48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l的二氧化氯溶液在4℃～10℃下浸泡20min，评判灭杀单增李斯特菌的效果。
(a)检测去皮后三文鱼鱼肉表面和内腔中单增李斯特菌残留量，流程如下：
三文鱼→冰水解冻→去皮→喷淋接菌(8～12cfu/g)→菌株粘附和侵染(4℃，3h)→二氧化氯(clo2，48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l)浸泡杀菌20min→棉拭子涂擦取样(鱼肉表面和内腔)→平板涂布(palcamagar)。
(b)分子生物学方法检测经过去皮后侵染和浸泡的三文鱼鱼肉内部单增李斯特菌：二氧化氯溶液浸泡后，取鱼肉(对不同部位分别取肉5g，共50g)均质后收集菌体，提取细菌dna，用特异性引物pcr扩增，流程如下：
三文鱼→冰水解冻→去皮→喷淋接菌(8～12cfu/g)→菌株粘附和侵染(4℃，3h)→二氧化氯(clo2，48～53mg/l、38～43mg/l、28～33mg/l)浸泡杀菌20min→取样→取鱼肉(对不同部位分别取肉5g，共50g)→均质→收集菌体→提取细菌dna→特异性引物pcr扩增单增李斯特菌。
分子生物学方法(u.sfdadetectionandenumerationoflisteriamonocytogenesinfoods)特异性引物的序列如表2所示，各处理方法的杀灭效果的检测结果如表3所示。
表3不同处理方法下不同浓度二氧化氯对三文鱼上单增李斯特菌的杀灭效果
去皮前三文鱼整鱼解冻后侵染单增李斯特菌(8～12cfu/g)，再去除三文鱼表皮并用48～53mg/l二氧化氯浸泡20min，平板涂布检测鱼肉表面和鱼内腔，以及分子生物学方法检测鱼肉内部，均未检出单增李斯特菌。
用48～53mg/l二氧化氯将去皮后侵染的三文鱼或者侵染后再去皮的三文鱼浸泡20min，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌也未检出。
去除表皮后用48～53mg/l二氧化氯浸泡20min处理的三文鱼再次于无菌条件下冷冻保存48h，解冻后再次检测，未检出单增李斯特菌。
实施例2
将去除表皮和解冻的三文鱼用48～53mg/l二氧化氯溶液在4℃～10℃下浸泡20min，进行感官实验(处理后的鱼肉未检出李斯特菌，并符合生食的要求)。
参照《db46118-2008》方法，由6名经过训练的评价员组成感官评定小组，对二氧化氯(48～53mg/l)浸泡20min三文鱼的色泽、气味、口感、肉质进行评价打分。评价结果为：浸泡后三文鱼肉颜色桔红、色泽明亮、纹理清晰，有海鲜味，味道鲜美，可生食，肌肉有弹性、紧实。与未经二氧化氯处理的可生食三文鱼相比，无差异。由此可见，用二氧化氯处理三文鱼，不仅能够控制三文鱼的微生物，尤其可以完全杀灭其中的李斯特菌，而且无残留和异味，不影响生食用的风味。