本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种多功能微生物鱼肥的制备方法。
背景技术：
我国传统的池塘养鱼和种庄稼一样都要施肥，但对养鱼来说，施肥的目的主要是增加水的肥沃度，促进各种鱼饵生物的生长和繁殖，为养殖鱼类提供更多的食料。现有的鱼肥虽然施用后肥效持久，但分解缓慢，且分解时要消耗大量的氧气，施用不当易引起水产动物的缺氧死亡。有益微生物制剂对于水面施肥有比较明显的促进效果，与水产专用鱼肥同时使用，可以起到协同的作用。目前市场上的一些产品也是根据长效肥和短效肥复配制成的，通过促进水中的浮游生物来生产鱼类所需要的生物饵料，而高产鱼塘是通过全价鱼饲料来喂鱼的。池塘中鱼的密度非常之大，以至于浮游生物的生长速度比不上鱼类吃食生物饵料的速度，所以，最终浮游生物无法正常生长。且现有的鱼肥功能较为单一，大量施用会污染水质，不能抑制水体中病原菌的繁殖生长，因此，缺乏对鱼病的有效防治；同时，施加上述肥料在鱼池中，水温受到外界天气变化影响大，例如“倒春寒”，水质不稳定，苗种难以适应，应急反应强烈。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种多功能鱼肥的制备方法，通过添加牛乳铁蛋白肽发酵粉及利用复合微生物发酵发酵棉籽粕等营养成分，使得制备的鱼肥可以用于池塘、水库或湖泊中饲养鱼苗、鱼种、鳝种、虾苗、蟹苗等的饲养；一方面，牛乳铁蛋白肽特有的杀菌作用及代谢产生的各种酶类能对鱼池中的有害菌进行灭杀，降低疾病几率；另一方面，提供丰富的营养原料，改善水质，增加水中的溶氧含量。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种多功能微生物鱼肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有重组牛乳铁蛋白肽质粒的酿酒酵母菌接种到100～500ml液体培养基中，于28～35℃恒温培养箱中180～250rpm震荡培养10～24h；
(2)将上述菌液转接至1l～2.5l新鲜液体培养基中，180～250rpm震荡培养，待od600在1.5～2.5之间转接至经过灭菌的发酵罐中，于30～35℃发酵60～72h；
(3)待发酵结束后，将罐温升至90～98℃保持10min，自然冷却，冷却后收集发酵液，并用喷雾干燥机进行喷雾干燥，即得牛乳铁蛋白肽发酵粉；
(4)将14～24份的发酵棉籽粕、12～19份的兽骨粉、7～11份的玉米叶粉、5～9份的蹄胶粉、3～7份的贝壳粉、30～43份的水与复合微生物混合并搅拌均匀，放入到发酵池中自然发酵5～10天得物料a，期间每隔1天搅拌1次；
(5)将物料a置于烘干室内在52～83℃下放置2～5天，粉碎过筛；
(6)将粉碎后的物料a与23～36份的乳铁蛋白肽发酵粉、0.5～1.5份的微量元素、11～20份的柠檬酸在搅拌机上充分搅拌混匀得物料b；
(7)将物料b用压力为2～4.5公斤蒸汽调质至温度为60～66℃，用制粒机制粒，冷却后装袋保存，即得上述鱼肥成品；
优选的，所述复合微生物包括以下重量份的菌种：固氮芽孢杆菌5～11份、酒红土褐链霉菌6～10份、植物乳杆菌3～9份、产朊假丝酵母5～10份；
优选的，所述复合微生物包括以下重量份的菌种：固氮芽孢杆菌6份、酒红土褐链霉菌8份、植物乳杆菌7份、产朊假丝酵母8份；
优选的，所述发酵棉籽粕优选为20份、兽骨粉优选为15份、玉米叶粉优选为29份、蹄胶粉优选为27份、贝壳粉优选为25份、水优选为36份；
优选的，所述牛乳铁蛋白肽发酵粉优选为32份、微量元素优选为1份、柠檬酸优选为17份；
优选的，所述微量元素为为含锰、铝、铜、硼、钼和锌无机盐中的一种或几种；
上所述液体培养基包括以下重量份的原料：工业葡萄糖10～20份、工业酵母膏5～12份、工业蛋白胨10～20份、食盐5～10份，磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钠3～7份、水60～78份；
优选的，所述接种的接种量为1％～10％。
本发明的有益效果为：
1、利用发酵工程技术获得高活性、高营养的的牛乳铁蛋白肽，其既能抑制水体中病原菌及有害藻类的生长繁殖，又能进入鱼的消化道中平衡微生态环境，增强细胞免疫反应，提高抵抗力，实现养殖效益的最大化。
2、根据水体养殖产品的营养需求及水体微生态环境的调控机制，利用多种微生物的发酵的生物鱼肥，为水产动物、浮游植物和浮游动物提供丰富的营养，促进养殖产品的生长和发育；固氮芽孢杆菌能够降解水中的氨态氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，同时产生氧气，促进水体中有益藻类及浮游生物饵料的生长繁殖，为水产养殖动物提供充足的天然生物饵料。植物乳杆菌能通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障。同时，通过其代谢所产生的代谢产物乳酸、细菌素、以及双乙酰对其它细菌的作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的粘附。
3、通过复合微生物发酵高分子蛋白原料，采用配方技术制得的鱼肥含有含有较多的蛋白质、糖类、氨基酸和多种维生素，为鱼等水产动物、浮游植物和浮游动物提供丰富的营养，改善水质，增加水中的溶氧含量，且制备方法简单，易于规模化生产。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种多功能微生物鱼肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将3％(v/v)含有重组牛乳铁蛋白肽质粒的酿酒酵母菌接种到100ml液体培养基中，于35℃恒温培养箱中190rpm震荡培养15h；
(2)将上述菌液转接至1.5l新鲜液体培养基中，190rpm震荡培养，待od600在1.7之间转接至经过灭菌的发酵罐中，于35℃发酵62h；
(3)待发酵结束后，将罐温升至98℃保持10min，自然冷却，冷却后收集发酵液，并用喷雾干燥机进行喷雾干燥，即得牛乳铁蛋白肽发酵粉；
(4)将14份的发酵棉籽粕、16份的兽骨粉、10份的玉米叶粉、7份的蹄胶粉、4份的贝壳粉、30份的水与5份的固氮芽孢杆菌、6份的酒红土褐链霉菌、3份的植物乳杆菌、10份的产朊假丝酵母混合并搅拌均匀，放入到发酵池中自然发酵5天得物料a，期间每隔1天搅拌1次；
(5)将物料a置于烘干室内在63℃下放置2天，粉碎过筛；
(6)将粉碎后的物料a与28份的乳铁蛋白肽发酵粉、0.2的mnso4份、0.3份的alcl3、0.1份的cucl2、0.4份的h3bo4、11份的柠檬酸在搅拌机上充分搅拌混匀得物料b；
(7)将物料b用压力为2公斤蒸汽调质至温度为63℃，用制粒机制粒，冷却后装袋保存，即得上述鱼肥成品。
上述液体培养基包括以下重量份的原料：工业葡萄糖14份、工业酵母膏7份、工业蛋白胨14份、食盐8份，磷酸氢二钾4份、磷酸二氢钠5份、水78份。
实施例2：
一种多功能微生物鱼肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1％(v/v)含有重组牛乳铁蛋白肽质粒的酿酒酵母菌接种到200ml液体培养基中，于28℃恒温培养箱中180rpm震荡培养24h；
(2)将上述菌液转接至1l新鲜液体培养基中，180rpm震荡培养，待od600在1.5之间转接至经过灭菌的发酵罐中，于30℃发酵60h；
(3)待发酵结束后，将罐温升至94℃保持10min，自然冷却，冷却后收集发酵液，并用喷雾干燥机进行喷雾干燥，即得牛乳铁蛋白肽发酵粉；
(4)将19份的发酵棉籽粕、9份的兽骨粉、7份的玉米叶粉、9份的蹄胶粉、3份的贝壳粉、30份的水与8份的固氮芽孢杆菌、6份的酒红土褐链霉菌、6份的植物乳杆菌、5份的产朊假丝酵母混合并搅拌均匀，放入到发酵池中自然发酵7天得物料a，期间每隔1天搅拌1次；
(5)将物料a置于烘干室内在83℃下放置4天，粉碎过筛；
(6)将粉碎后的物料a与23份的乳铁蛋白肽发酵粉、0.3份的alcl3、0.4份的cucl2、0.1份的h3bo4、0.1份的namoo4、35份的柠檬酸在搅拌机上充分搅拌混匀得物料b；
(7)将物料b用压力为4.5公斤蒸汽调质至温度为60℃，用制粒机制粒，冷却后装袋保存，即得上述鱼肥成品。
上述液体培养基包括以下重量份的原料：工业葡萄糖10份、工业酵母膏5份、工业蛋白胨20份、食盐5份，磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠6份、水65份。
实施例3：
一种多功能微生物鱼肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10％(v/v)含有重组牛乳铁蛋白肽质粒的酿酒酵母菌接种到500ml液体培养基中，于32℃恒温培养箱中250rpm震荡培养10h；
(2)将上述菌液转接至2l新鲜液体培养基中，250rpm震荡培养，待od600在2.5之间转接至经过灭菌的发酵罐中，于33℃发酵60h；
(3)待发酵结束后，将罐温升至90℃保持10min，自然冷却，冷却后收集发酵液，并用喷雾干燥机进行喷雾干燥，即得牛乳铁蛋白肽发酵粉；
(4)将24份的发酵棉籽粕、12份的兽骨粉、11份的玉米叶粉、5份的蹄胶粉、7份的贝壳粉、43份的水与11份的固氮芽孢杆菌、10份的酒红土褐链霉菌、9份的植物乳杆菌、6份的产朊假丝酵母混合并搅拌均匀，放入到发酵池中自然发酵7天得物料a，期间每隔1天搅拌1次；
(5)将物料a置于烘干室内在52℃下放置5天，粉碎过筛；
(6)将粉碎后的物料a与36份的乳铁蛋白肽发酵粉、0.4份的alcl3、0.4份的cucl2、0.5份的h3bo4、0.2份的namoo4、20份的柠檬酸在搅拌机上充分搅拌混匀得物料b；
(7)将物料b用压力为2.5公斤蒸汽调质至温度为66℃，用制粒机制粒，冷却后装袋保存，即得上述鱼肥成品。
上述液体培养基包括以下重量份的原料：工业葡萄糖20份、工业酵母膏12份、工业蛋白胨10份、食盐10份，磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钠3份、水78份。
实施例4：
一种多功能微生物鱼肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将5％(v/v)含有重组牛乳铁蛋白肽质粒的酿酒酵母菌接种到300ml液体培养基中，于30℃恒温培养箱中220rpm震荡培养18h；
(2)将上述菌液转接至1.5l新鲜液体培养基中，220rpm震荡培养，待od600在2.0之间转接至经过灭菌的发酵罐中，于32℃发酵60h；
(3)待发酵结束后，将罐温升至96℃保持10min，自然冷却，冷却后收集发酵液，并用喷雾干燥机进行喷雾干燥，即得牛乳铁蛋白肽发酵粉；
(4)将20份的发酵棉籽粕、15份的兽骨粉、9份的玉米叶粉、7份的蹄胶粉、5份的贝壳粉、36份的水与6份的固氮芽孢杆菌、8份的酒红土褐链霉菌、7份的植物乳杆菌、8份的产朊假丝酵母混合并搅拌均匀，放入到发酵池中自然发酵7天得物料a，期间每隔1天搅拌1次；
(5)将物料a置于烘干室内在65℃下放置3天，粉碎过筛；
(6)将粉碎后的物料a与36份的乳铁蛋白肽发酵粉、0.4份的alcl3、0.4份的cucl2、0.5份的h3bo4、0.2份的namoo4、17份的柠檬酸在搅拌机上充分搅拌混匀得物料b；
(7)将物料b用压力为3公斤蒸汽调质至温度为63℃，用制粒机制粒，冷却后装袋保存，即得上述鱼肥成品。
上述液体培养基包括以下重量份的原料：工业葡萄糖13份、工业酵母膏6份、工业蛋白胨13份、食盐7份，磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠5份、水66份。
应用例1：
养殖实验在安徽省合肥市巢湖市江卡种苗繁育有限公司进行，自然水域温度为25～30℃，ph值8～8.5。标苗设施有6.4×12.5×2.1水泥池数口，1kw增氧泵数台。将池底和池壁刷净，漂白粉消毒，冲洗3遍测试余氯，合格即可。
实验设置1个空白组，1个阳性对照组(市售有机鱼肥)，4个试验组(分别投放本发明实施例1～4组制得的鱼肥)，每组设置平行池。放苗前7天，阳性对照组和试验组每池按照每亩3kg施相应的鱼肥，优选在晴天8～12时施肥。3天后取养殖水进行观察，结果见表1。
表1微生物鱼肥的施肥效果
施肥第5天开始放苗，每池品均放10000尾鳜鱼苗，放苗后每隔10～15天施肥一次，施肥量为每亩3kg，每组按常规养殖方式进行日常管理。
饲喂第15天，空白组发病，其他鱼池正常。养殖第30天，收鱼分池，计算成活率和增长率，见表2。
表2鳜鱼成活生长情况
本次实验表明，添加本发明的微生物鱼肥不仅可以促进鱼的快速生长，还可以提高鱼的品质和质量，而且还使水体中的有益微生物增加，可以有效防治鱼病的发生，是一种经济有效的养殖方法。牛如铁蛋白肽本身具有很好的生物相容性、胃肠道粘膜亲和性，水体中病原菌及有害藻类的生长繁殖，又能进入鱼的消化道中平衡微生态环境，增强细胞免疫反应，提高抵抗力，肥效时间延长3个月以上，有效抑制动物病原菌的增值，提高生产者的效益。
应用例2
实验地点选在亳州市谯城丰水源养殖厂，养殖池塘随机选取5个规格相同的池塘，实验前，池塘均经过清塘、晒塘处理，养殖用水采用沙滤井过滤后的清洁海水，无敌害生物。
实验设置1个空白组，1个阳性对照组(市售有机鱼肥)，4个试验组(分别投放本发明实施例1～4组制得的微生物鱼肥)，每组设置平行池。放苗前5天，阳性对照组和试验组每池按照每亩2kg施相应的鱼肥，优选在晴天12～16时施肥。3天后取养殖水进行观察，对照组以绿藻为主呈绿色水，试验组以硅藻、金藻为主呈褐色水。施肥第6天出现带卵轮虫开始放苗，每池放鲢鱼10000尾。按常规养殖方式进行日常管理，放苗后每隔7～10天施肥一次。
饲养第20和26天，对照组发病排塘，其他鱼池正常。养殖110天，收鱼，计算成活率，见表3。
表3鲢鱼成活生长情况
本次实验表明，利用本发明的微生物鱼肥可以提高水体中黄绿色和褐色藻类的生物量，水体中带卵轮虫的生物量有所提高，为养殖动物提供了丰富的自然饵料，有效节约了养殖成本。而且养殖水中的溶解氧升高，养殖动物不易发病，有效提高养殖效率。
参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。