一种生物复合肥及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物复合肥，属于肥料领域，特别涉及生物肥料；所述肥料重量份数组成为：枯草芽孢杆菌培养物8?15份，泡盛曲霉培养物5?10份，植物乳杆菌混合菌剂10?20份。用本品可提高粮食产量，提高蔬菜产量，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。CGMCC No.940520140702 CGMCC NO.1176320151130
【专利说明】
一种生物复合肥及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物肥加工方法，属于农用肥料技术领域，特别涉及一种生物复 合肥及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 化肥污染已成为当今世界一大公害。农业专家一致呼吁，治理环境，必须减少化肥 用量。业内专家、中国农业大学陈文新院士认为，目前我国过量施用化肥已到极限。以氮肥 为例，我国的平均施用量是美国的近3倍、澳大利亚的8倍多，这造成了土壤结构被破坏、自 然界生物多样性和生态系统稳定性降低等一系列严重问题。中国微生物学会农业微生物学 专业委员会主任李俊博士指出，大力推广微生物肥配合化肥施用就是解决这一问题的方法 之一。
[0003] 微生物肥是一种以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微 生物活体制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制农作物对重金属及农药等有害物质的 吸收、净化和修复土壤、促进农作物秸杆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面有 着不可替代的作用。微生物肥料的功效发挥主要是通过对传统化肥、有机肥的增效作用，对 土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式来实现的。
[0004] 因此，微生物肥料就有了化肥、有机肥、有益生物菌的多种肥力和功效，是活化肥 料养分、提高肥料效果、改良作物品质、促进农业增产增效的理想肥料。微生物肥料是活体 肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活动来完成。只有当这些有益微生 物处于旺盛的繁殖和新陈代谢的情况下，物质转化和有益代谢产物才能不断形成。因此，微 生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是 以氮、磷、钾等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所以其肥效与 活菌数量、强度及周围环境条件密切相关，包括温度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在土 壤中土著微生物排斥作用都有一定影响。
[0005] 多年以来，微生物肥料的多数加工方式只采用成品菌剂与填料混合，缺少发酵代 谢产物，严重影响了微生物肥料产品的肥效，例如公布号为CN103396252A的专利申请，公开 了一种含氨基酸的复合微生物肥料，其中添加的成品菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌 和巨大芽孢杆菌按照一定比例混合组成。
[0006] 而且目前市场上的农用微生物菌剂主要为单一的微生物菌种，难以还原微生态结 构，同时普通菌种和农作物的协同作用弱，不利如提高植物抗逆性和根系营养吸收，例如公 布号为CN102888356A的专利申请，公开了一种利用枯草芽孢杆菌制备微生物肥料的方法 及其应用。虽然目前市场上已出现一些复合微生物菌剂，但其或者功能单一，或者其使用方 法受到限制，使用后的作物增产效果还不能达到令人满意，所以目前仍需要开发适用于多 种施用途径、具有综合功能和良好增产效果的复合微生物菌剂或肥料。
[0007] 一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，申请号：201310566374.5.本发明公开了 一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Li-2013- 02于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏 号为CGMCCNo. 7926。该菌株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2010经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点，应用前景 非常广阔。
[0008] 一株高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，申请号：201310625005.9 本发明公开了一株高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌（Lactobacillus? plantarum)Li-2013-01，保藏编号为CGMCCNo .7928。其发酵罐培养基组成为:牛肉膏12g、蛋 白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁 1.2g、七水硫酸猛0.3g，逐一溶解后，自来水定容至6L，调节pH7.0-7.2。该菌株可高效利用 各种生物质原料，不仅可利用常见的淀粉质原料、单糖、双糖、六碳糖等，且可利用五碳糖， 代谢速率快，产乳酸浓度高，转化率高，杂酸含量少，遗传稳定性较强。
[0009] 由于我国长期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的微生物肥料产业依然 存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生物复合肥，重量 份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物8-15份，泡盛曲霉培养物5-10份，植物乳杆菌混合菌剂 10-20 份。
[0011] 所述枯草芽孢杆菌培养物制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种 子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。
[0012] 植物乳杆菌混合菌剂的重量份数组成为，植物乳杆菌CGMCC 7928 1-3份；
[0013] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5-9份.
[0014] 植物乳杆菌剂的制备方法:从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转 接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加 载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀;浓缩液与载体的重量比为〇. 5-0.6:1，载体 组成为:CaC03 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥温度50 °C。
[0015]泡盛曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:孢子液接种到米曲霉固态发酵培 养料中，26-33 °C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。
[0016]所述高效微生物肥制备方法如下:按照上述比例将各种菌剂混合，或混合后制粒。 [0017]本发明采用的菌种如下：
[0018] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926
[0019] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 7928
[0020] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 [0021 ]泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0022]上述三种菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址:北京市中 关村北一条13号中科院微生物研究所;邮编：100080。
[0023]有益效果
[0024]本发明的肥料能够增强作物的抗旱能力。发明的肥料能够改良土壤。肥料中有益 微生物能产生糖类物质与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒 结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还能参与腐殖质形 成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。
[0025]本产品使用方法简单，每亩地使用量0.3-1公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或生 长期灌水前地表喷洒。
[0026] 土壤生物酶的转化，在降低农业生产成本、减少化肥的使用、恢复土壤生态地力和 有效提高农作物产量等方面均能起到显著的作用，充分发挥土壤的有机质效能。
【具体实施方式】
[0027] 除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另 外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要 求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施 方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0028] 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。实施例1
[0029] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02,该菌株已于2013年7月15日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳 区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7926。
[0030] 所述菌株特性是产耐高温α-淀粉酶的酶活力高，耐热、耐酸性强。
[0031] 所述菌株制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000u/ml;适用温度范围为 105-115°(：，最适反应温度110°(：，在110°(：酶活完全稳定;适用反应?田直范围为3.0-7.0，在 pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2。
[0032]所述菌株特点如下：
[0033] 所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运 动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实 验成阳性。
[0034] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is )Li-2013_02由一株产耐高温α-淀粉酶的 枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如 下：
[0035] (1)菌悬液的制备
[0036]将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培 养12h后，取lmL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。
[0037] (2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0038]将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将 经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做 对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40°C培养48h，在长出菌落的平板 上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释 后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂 布于氯化锂平板。
[0039] (3)高产菌种的初筛
[0040] 将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌 落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌LijOlS-OULijOU-i^lijOn- OSo
[0041] (4)摇瓶发酵复筛
[0042] 将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02, Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的 250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上 清液制得粗酶液。
[0043] (5)酶活测定
[0044] 酶活单位的定义:lmL粗酶液，于105°C、pH 4.2条件下，1111；[11液化111^可溶性淀粉， [0045]即为1个酶活力单位，以U/mL表示。
[0046] 经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL。
[0047] 所述氯化锂平板：淀粉 1%，蛋白胨 1%，（NH)2S〇4 0.4%，K2HP〇4 0.8%，CaCl2 0.2%，氯化锂0.9%，琼脂2%。
[0048] 所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCl 1%。
[0049] 所述的发酵培养基：玉米粉5%-15%，豆饼粉4%-10%，（NH)2S〇4 0.4%，K2HP〇4 0.8%，CaCl2 0·2%〇
[0050] 所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10% (V/V)，100r/min、40°C发酵培养72h。
[0051 ]所述耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：
[0052] (1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在100-110°C之间，且在110°C以下保存 的，温度稳定性较好，而11 〇 °C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0053] (2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0 时酶活完全稳定。
[0054] (3)酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力 为30000-35000U/ml。
[0055] 本发明所提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)Li_2013-01，该菌株保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7928，保藏地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期 2013年7月15日。该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性， 无边毛，不产芽孢;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较 整齐。理化特征为:过氧化氢酶(_)，明胶液化(_)，吲哚实验(+ )，运动性(_)，发酵产气(_)， 亚硝酸盐还原(_)，发酵产气(_)，产硫化氢气体(_)，pH4.5MRS培养基中生长(+ )。
[0056] 本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
[0057]原始出发菌种-试管活化-硫酸二乙酯(DES)诱变-平板初筛-亚硝基胍(NTG) 诱变-平板初筛-摇瓶复筛-传代稳定性试验。
[0058]原始出发菌种为CICC20242,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0059]本发明所采用的原始菌株在木聚糖培养基中，乳酸的产量为12.5g/L。为了提高其 乳酸产量，依次采用DES和NTG对该菌种进行诱变，诱变采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后 采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株， 然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
[0060]菌株CGMCC No. 7928遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比 较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCC No.7928作为选育得到的目的菌株。 [0061 ]将目的菌株CGMCC No.7928做10L发酵罐实验，结果表明：发酵72h后，以木聚糖为 碳源，植物乳杆菌CGMCC No.7928的乳酸浓度可以达到57g/L，与出发菌株相比提高了 356% 〇
[0062]将目的菌株CGMCC No.7928做10L发酵罐实验，结果表明：发酵72h后，以葡萄糖为 碳源，植物乳杆菌CGMCC No. 7928的乳酸浓度可以达到68g/L。
[0063] 具体过程如下：
[0064] 培养基：
[0005]液体MRS木聚糖培养基（牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸钠5g、梓 檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸猛0.05g，逐一溶解后，自来水定容 1000mL，调节?!17.0-7.2);11?木聚糖筛选固体培养基（牛肉膏28、蛋白胨1(^、酵母膏58、木 聚糖90g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g，逐一 溶解后，自来水定容l〇〇〇mL，调节pH7 · 0-7 · 2，加入20g琼脂）。
[0066] 1.硫酸二乙酯(DES)诱变选育
[0067] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培 养基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0068] 2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0069] 3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0070] 4)取32mL ρΗ7·0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1 % (v/v)。
[0071] 5)在30°C摇床中150rpm反应30min，取lmL混合液，加入0.5mL 25 %Na2S2〇3溶液中 止反应。
[0072] 6)稀释涂布于含90g//L木聚糖的MRS木聚糖筛选固体培养基平皿中。在40°C培养2 ~3天后挑取透明圈/菌落直径最大的菌株，标号为DES菌。
[0073] 2.亚硝基胍诱变
[0074] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌DES-环，接入装有50mL液体MRS木聚糖 培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0075] 2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0076] 3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0077] 4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0078] 5)在30°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水 洗涤数次，中止反应。
[0079] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖 筛选固体培养基平皿中。在40°C培养2~3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株150支。
[0080] 3.摇瓶复筛
[0081] 1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木 聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培养3-4天，每天检测葡萄糖浓度和L-乳酸浓度 变化。发酵结束后，比较150株菌种的木聚糖消耗速率和乳酸产生速率、乳酸的转化率以及 杂酸含量。
[0082] 2)选择木聚糖代谢速率快、乳酸浓度高、转化率高以及杂酸含量少的菌种为最终 菌种，命名为Li菌。
[0083] 4.遗传稳定性试验
[0084]将Li-2013-Ol菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后 的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标 都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0085] 发明所述所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编:100101。。
[0086] 植物乳杆菌益生特性如下：
[0087]本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC N0.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件 下存活，在1 %胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC N0.11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kg以下；CGMCC NO. 11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力测定的自凝集率为95 · 71 %。
[0088] CGMCC N0.11763对胆固醇降解能力研究和测定：
[0089] 取lml CGMCC N0.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 0· lmg/ml，pH 6 · 2)中，37°C的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入lmL无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0 . lml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1. 〇ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，以同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCC NO. 11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0090]表1对胆固醇的降解情况
[0092] CGMCC N0.11763菌株的耐胆盐试验：
[0093] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液体培养基(？!1=6.4)，置于37°(：下分别培养0、2、411， 每个处理3个重复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 Ο· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[0094] 表2耐胆盐能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0095]
[0096] 0611〇：从).11763菌株的耐酸试验
[0097] 取CGMCC腸.11763母液按11111接种菌种于不同？!1值(？!1梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37 °C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取lml 样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37°C生化 培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说 明该菌具有很强的耐酸能力。
[0098]表3 耐酸能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0099]
[0100] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力测定
[0101] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌DH5a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离心10min，收集菌泥，分别用pH = 7.0的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离心 lOmin，收集菌体）。自凝集率（％ :用无菌的roS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600nm处 的吸光值为〇. 4±0.1 (A0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率（％ ) 公式为(A0-A24)/A0。；他凝集率（％ :将CGMCC N0.11763和大肠杆菌DH5a的悬菌液调节成 在波长600nm处的吸光值为0.6 ± 0.1 (A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝 集率（％ )公式为（A0-A24)/A0。测定结果见表4,可知CGMCC N0.11763的自凝集率为 95.71%，有很强的黏附能力。
[0102] 表4黏附能力表
[0104] 菌株生理特性
[0105] 所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 11763，保藏地 址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0106] 该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛， 不产芽孢;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0107] 理化特征为:过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (_)，亚硝酸盐还原（_)，发酵产气(_)，产硫化氢气体(_)，pH4.0MRS培养基中生长(+ )。经过 生理生化鉴定为为植物乳杆菌（Lactobacillus plan tarum)，命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0108] 菌株能够在57°C下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
[0109] 本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到， 采集时间2015年6月2日。
[0110] 5L发酵罐试验
[0111] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC N0.11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处 于对数生长中期。
[0112] (2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵 罐中。接种量为10%，37°C下lOOrpm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.5L/min)，后 期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCC N0.11763的乳酸产量达到110g/L。这样 的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
[0113] (4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝 酸钠的改性MRS筛选培养基）的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下lOOrprn培养8小时，对数 前期溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加 20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCC N0.11763 对亚硝酸钠的降解速率。结果发现:在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/ h/L〇
[0114] (5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸 钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家 标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0115] 泡盛曲霉菌剂的制备方法：
[0116] 斜面菌种活化培养:将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27 °C培养3天。 [0117]固体一级种子培养:挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角 瓶中进行种子培养，30°C培养3天即可。
[0118] 固体二级种子培养:将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克 培养基的5000_升三角瓶中进行种子培养，培养条件:30 °C培养3天即可。
[0119] 固体发酵培养:将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混 合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35 °C，湿度80-90 %，每隔10小时翻料一次，培养时 间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术;待培养料长满菌丝即可结束培养，培养 基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121°C，时间1小时。
[0120] 干燥粉碎:发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制 在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以 上。
[0121]培养基组成：固体原料:麸皮80，豆饼粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自来水;初 始pH自然。
[0122] 实施例2
[0123] 枯草芽孢杆菌培养物的制备方法：
[0124] 发酵液的获得:采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；
[0125] (1)-级种子培养:将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100 毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0126] (2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0127] (3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0128] (4) 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐， 发酵培养基装量100L，培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量（V/V) 1: 0.5，罐压 0.05MPa，培养时间24小时；
[0129] (5)发酵培养:将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐， 发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5，罐压 0.05MPa，培养时间24小时。发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得含枯草芽孢杆菌剂 在内的枯草芽孢杆菌培养物。
[0130] 培养基组成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03 1%，ρΗ6.8。
[0131] 植物乳杆菌剂的制备方法：
[0132] (1) 一级种子培养:将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升， 培养温度30 °C，培养时间24小时；
[0133] (2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0134] (3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0135] (4) 一级种子罐培养:将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐， 发酵培养基装量100L，培养温度30 °C，罐压0.05MPa，培养时间18小时；
[0136] (5)发酵罐培养:将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发 酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30°C，罐压0.05MPa，培养时间22小时。发酵完毕发酵 液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好 的载体，混合均匀;浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0 3 25份，糊精12份，流 化床干燥，干燥温度50 °C。
[0137] 培养基组成为:酪蛋白胨1 %，牛肉提取物1 %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸钠0.5%，柠檬酸二胺0.2%八￥6611 80 0.1%，1(2耶04 0.2%，]\^504.7!120 0.02%， MnS〇4.H20 0.005%，CaC03 2%，琼脂 1·5%，ρΗ6·8〇
[0138] 实施例3
[0139] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生物复合肥，重量 份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物10份，泡盛曲霉培养物8份，植物乳杆菌混合菌剂20份。
[0140] 植物乳杆菌混合菌剂的重量份数组成为，植物乳杆菌CGMCC 7928 1份；
[0141] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 8份.
[0142] 本发明采用的菌种如下：
[0143] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926
[0144] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 7928
[0145] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763
[0146] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0147] 上述菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市中关村 北一条13号中科院微生物研究所;邮编：100080。
[0148] 实施例4
[0149] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生物复合肥，重量 份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物8份，泡盛曲霉培养物10份，植物乳杆菌混合菌剂20份。
[0150] 植物乳杆菌混合菌剂的重量份数组成为，植物乳杆菌CGMCC 7928 3份；
[0151] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5份.
[0152] 产品效果实验
[0153] 试验地的选择与试验设计:试验于2015年在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。
[0154] 旱地田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.5公斤，出苗1个月左 右通过锄地松土方式使用发明产品0.5公斤，对照组使用常规肥料。
[0155] 发明产品使用玉米地玉米产量达到360公斤，对照组达到150公斤。
【主权项】
1. 一种生物复合肥，重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物8-15份，泡盛曲霉培养物5-10份，植物乳杆菌混合菌剂10-20份。2. 根据权利要求1所述生物复合肥，其特征在于，植物乳杆菌混合菌剂的重量份数组成 为，植物乳杆菌CGMCC 7928 1-3份，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5-9 份。3. 根据权利要求1所述生物复合肥，其特征在于，生物复合肥，重量份数组成为:枯草芽 孢杆菌培养物8份，泡盛曲霉培养物10份，植物乳杆菌混合菌剂20份;植物乳杆菌混合菌剂 的重量份数组成为，植物乳杆菌CGMCC 7928 3份;植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC 11763 5份。4. 根据权利要求1-3任一所述生物复合肥的制备方法，如下:按照上述比例将各种菌剂 混合，或混合后制粒。
【文档编号】C05G3/04GK105936599SQ201610248489
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】李秉京
【申请人】义乌市锦钰信息科技有限公司