一种枯草芽孢杆菌、脱霉剂及脱霉剂的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种枯草芽孢杆菌、脱霉剂及脱霉剂的应用。
背景技术：
：霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌或其它真菌产生的有毒代谢产物，它们可通过饲料或食品进入人和动物的体内，引起人和动物的急性或慢性中毒。目前危害谷物饲料的主要有六大霉菌毒素包括：黄曲霉毒素、呕吐毒素、烟曲霉毒素、赭曲霉毒素、t2毒素和玉米赤霉烯酮。与传统的物理和化学脱霉方法相比，生物脱霉法不会破坏饲料的营养成分，也不会影响饲料的品质，生物脱霉法为霉菌毒素的脱霉提供了新的发展方向。现有的生物脱霉法去除霉菌毒素的具体方法为：采用筛选分离出具有降解霉菌毒素功能的菌株，通过菌株吸附霉菌毒素。但是，目前筛选分离出的菌株吸附效果不佳。技术实现要素：为了解决现有技术中筛选分离出的菌株吸附效果不佳的问题，本发明实施例提供了一种枯草芽孢杆菌、脱霉剂及脱霉剂的应用。所述技术方案如下：一方面，本发明实施例提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017230。具体地，所述保藏编号为cctccno:m2017230的枯草芽孢杆菌的16srdna序列如序列表中seqinno:1所示。另一方面，本发明实施例提供了一种脱霉剂，所述脱霉剂包括：上述枯草芽孢杆菌。具体地，所述脱霉剂还包括：蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌和维生素e，所述蒙脱石、所述酵母细胞壁、所述乳酸菌、所述维生素e和所述枯草芽孢杆菌的重量份分别为：33～43份、21～28份、11～16份、5～10份和10～20份，所述乳酸菌为屎肠球菌。具体地，所述蒙脱石为纳米级蒙脱石。该纳米级蒙脱石能够提高脱霉剂的吸附效率。进一步地，所述蒙脱石、所述酵母细胞壁、所述乳酸菌、所述维生素e和所述枯草芽孢杆菌的重量份分别为：40份、25份、15份、10份和10份。优选地，所述蒙脱石、所述酵母细胞壁、所述乳酸菌、所述维生素e和所述枯草芽孢杆菌的重量份分别为：43份、21份、16份、5份和15份。优选地，所述蒙脱石、所述酵母细胞壁、所述乳酸菌、所述维生素e和所述枯草芽孢杆菌的重量份分别为：33份、28份、12份、7份和20份。优选地，所述蒙脱石、所述酵母细胞壁、所述乳酸菌、所述维生素e和所述枯草芽孢杆菌的重量份分别为：37份、26份、11份、8份和18份。又一方面，本发明实施例提供了一种上述脱霉剂在降解霉菌毒素中的应用，所述应用包括：将所述脱霉剂按照质量分数为0.05％～2％添加到饲料中。具体地，将所述脱霉剂按照质量分数为1％添加到饲料中。具体地，所述霉菌毒素包括玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中的至少一种。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：(1)本发明实施例提供的枯草芽胞杆菌针对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中具有良好的吸附性能，对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中的脱霉能力强。特别地，该枯草芽孢杆菌的生物代谢的胞外产物能够高效降解呕吐毒素，在生物体内的消化道中能够将呕吐毒素降解为无毒的分子片段，且降解过程不产生毒副作用。(2)本发明实施例提供的脱霉剂具有良好的吸附性能、抑菌和杀菌的功能，可提高动物的繁殖性能，提高仔猪的生长性能，并具有对抗体效价的保护作用。其中，该脱霉剂通过物理吸附和生物吸附相结合使得该脱霉剂具有良好的脱霉效果。具体而言，该脱霉剂通过蒙脱石进行物理吸附，蒙脱石层间距离较大，这使得蒙脱石具有最佳的阳离子交换平衡性，从而使脱霉剂既能够对体积较大的霉菌毒素具有良好的吸附性能，如玉米赤霉烯酮，又能够对极性较弱的霉菌毒素的能力具有较强的吸附性能，如呕吐毒素和玉米赤霉烯酮，脱霉剂利用枯草芽胞杆菌实现生物吸附，同时酵母细胞壁能够结合霉菌毒素实现生物吸附，从而有效脱去饲料中的霉菌毒素。(3)本发明实施例提供的脱霉剂具有解毒护肝的益生功能，该脱霉剂能够促进超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽等抗氧化物质的产生，从而减少肝脏因霉菌毒素中毒而受到氧化损伤，进而减少脂肪肝的发生，保护肝脏细胞免受自由基损伤。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例四提供的对照组与脱霉剂组的对比图，图中左侧为对照组，右侧为脱霉剂组；图2是本发明实施例四提供的培养有大肠杆菌k88的培养基的抑菌圈结果图；图3是本发明实施例四提供的培养有大肠杆菌k99的培养基的抑菌圈结果图；图4是本发明实施例四提供的培养有大肠杆菌o157的培养基的抑菌圈结果图；图5是本发明实施例四提供的培养有大肠杆菌o139的培养基的抑菌圈结果图；图6是本发明实施例四提供的培养有金葡萄球菌的培养基的抑菌圈结果图；图7是本发明实施例四提供的培养有沙门氏菌的培养基的抑菌圈结果图。本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌tm02(bacillussubtilistm02)于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017230，保藏单位地址为中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本实施例提供的蒙脱石来源于赤峰市恒润工贸有限公司，该公司提供的蒙脱石含量92％以上；酵母细胞壁来源于山东潍坊雅致生物有限公司，该公司提供酵母细胞壁的粗蛋白＜25％；乳酸菌来源于湖北华大瑞尔科技有限公司，该公司提供的乳酸菌大于30亿cfu/g；维生素e来源于北京卓龙兴业有限公司，该公司提供的维生素e的单位为2000iu。实施例一本发明实施例提供了一种脱霉剂，该脱霉剂包括：蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌tm02，蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌的重量份分别为：40份、25份、15份、10份和10份，具体地，蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌分别为40g、25g、15g、10g和10g。其中，枯草芽孢杆菌于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017230，其16srdna序列如序列表中seqinno:1所示。其中，乳酸菌的来源为湖北华大瑞尔科技有限公司生产的屎肠球菌。蒙脱石为纳米级蒙脱石，该纳米级蒙脱石能够提高脱霉剂的吸附效率。霉菌毒素包括玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中的至少一种。实施例二本发明实施例提供了一种脱霉剂，该脱霉剂包括：纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌的重量份分别为：43份、21份、16份、5份和15份。具体地，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌分别为43g、21g、16g、5g和15g。实施例三本发明实施例提供了一种脱霉剂，该脱霉剂包括：纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌的重量份分别为：33份、28份、12份、7份和20份。具体地，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌分别为33g、28g、12g、7g和20g。实施例四本发明实施例提供了一种脱霉剂，该脱霉剂包括：纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌的重量份分别为：37份、26份、11份、8份和18份。具体地，纳米级蒙脱石、酵母细胞壁、乳酸菌、维生素e和枯草芽孢杆菌分别为37g、26g、11g、8g和18g。脱霉剂体外吸附性能测试在四个20ml带塞离心管中，分别加入浓度为1μg/ml的zen(玉米赤霉烯酮)-pbs缓冲液中，向四个离心管中分别添加实施例一、二、三和四中所得的脱霉剂5mg，振荡2h之后，离心10min，测定上清液中zen含量，计算脱霉率，筛选最佳脱霉剂。按下列公式计算吸附率y(％)：y＝100×(c0-c)/c0，其中：c0和c分别表示反应前zen的浓度(mg/l)和反应后zen的浓度(mg/l)。每个做3个平行样，取平均值作为测定结果。根据吸附率的大小评价各脱霉剂对zen的体外吸附效果的优劣，具体结果见表1。在四个20ml带塞离心管中，分别加入浓度为5μg/ml的don(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)-pbs缓冲液中，向四个离心管中分别添加实施例一、二、三和四中所得的脱霉剂5mg，振荡2h之后，离心10min，测定上清液中don含量，计算脱霉剂的吸附率，筛选最佳脱霉剂。按下列公式计算吸附率y(％)：y＝100×(c0-c)/c0，其中：c0和c分别表示反应前don的浓度(mg/l)和反应后don的浓度(mg/l)。每个做3个平行样，取平均值作为测定结果。根据吸附率的大小评价各脱霉剂对don的体外吸附效果的优劣，具体结果见表1。在四个20ml带塞离心管中，分别加入浓度为0.1μg/ml的afb1(黄曲霉毒素b1)-pbs缓冲液中，向四个离心管中分别添加实施例一、二、三和四中所得的脱霉剂5mg，振荡2h之后，离心10min，测定上清液中afb1含量，计算脱霉剂的吸附率，筛选最佳脱霉剂。按下列公式计算吸附率y(％)：y＝100×(c0-c)/c0，其中：c0和c分别表示反应前afb1的浓度(mg/l)和反应后afb1的浓度(mg/l)。每个做3个平行样，取平均值作为测定结果。根据吸附率的大小评价各脱霉剂对afb1的体外吸附效果的优劣，具体结果见表1。对照例一为0.01g纳米级蒙脱石分别加入浓度为1μg/ml的zen(玉米赤霉烯酮)-pbs缓冲液、浓度为5μg/ml的don(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)-pbs缓冲液和浓度为0.1μg/ml的afb1(黄曲霉毒素b1)-pbs缓冲液中。对照例二为0.01g酵母细胞壁分别加入浓度为1μg/ml的zen(玉米赤霉烯酮)-pbs缓冲液、浓度为5μg/ml的don(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)-pbs缓冲液和浓度为0.1μg/ml的afb1(黄曲霉毒素b1)-pbs缓冲液中。对照例三为0.01g本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌分别加入浓度为1μg/ml的zen(玉米赤霉烯酮)-pbs缓冲液、浓度为5μg/ml的don(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)-pbs缓冲液和浓度为0.1μg/ml的afb1(黄曲霉毒素b1)-pbs缓冲液中。表1为本发明四个实施例对zen、don和afb1的吸附率组别zendonafb1对照例一(蒙脱石)27.4％26.4％60.6％对照例二(酵母细胞壁)41.73％43.07％21.73％对照例三(枯草芽孢杆菌)15.5％57.7％25.5％实施例一48.6％44.1％90.2％实施例二60.4％34.2％94.1％实施例三78.3％64.8％93.3％实施例四72.3％45.5％87.3％由此可见，本发明实施例提供的脱霉剂的吸附率均较高，且当枯草芽孢杆菌tm02含量丰富时能够对非极性的don具有良好的吸附能力。脱霉剂对抗体效价的保护作用试验分3组，分别为对照组、霉变日粮组和脱霉剂组，每组选用16头猪，其中，8头阉割公猪，8头母猪，且每组试验做4个重复试验并取平均值，每组共取64头猪。3组猪先喂养相同的未霉变的基础日粮3天(预饲期)，然后再分别喂养35天(正式期)未霉变的基础日粮、霉变日粮(将未霉变的基础日粮放在潮湿处，随后测定其中霉菌毒素含量，确认霉菌毒素超标后用于试验。在本实施例中，选取将基础日粮放置13天后霉变的霉变日粮，经测定该霉变日粮中黄曲霉毒素的浓度为47ppb，呕吐毒素的浓度为1500ppb，玉米赤霉烯酮的浓度为668ppb，并将该霉变日粮用于试验)和霉变日粮+实施例一提供的脱霉剂。试验的35天可以具体从猪的28日龄开始饲养到62日龄结束，饲喂试验的时间为仔猪保育阶段，饲养试验结果见表2。表2为试验分组处理将表2中的三组分别进行特异性抗体测定，具体方法如下：特异性抗体指标包括猪瘟(hc)抗体，用相应的酶联免疫吸附测定抗体检测试剂盒(由武汉科前动物生物制品有限责任公司提供)检测猪疫苗免疫后机体抗体水平。具体操作按照酶联免疫吸附测定抗体检测试剂盒的说明书进行。表3为特异性抗体试验结果组别od630nm对照组一0.51±0.04对照组二0.33±0.07脱霉剂组0.48±0.04由表3可知，脱霉剂组的特异性抗体的数值明显该与对照组二，并接近对照组二，可见本发明实施例提供的脱霉剂能够使服用过脱霉剂的猪产生抗体，从而能有效降低饲料中霉菌毒素对猪的免疫系统的损伤，进而提高疫苗的保护效力。脱霉剂对繁殖性能的影响试验对象：经产的怀孕母猪(避免使用第一次怀孕的母猪)，且母猪怀孕的胎次在2-5次之间。试验分组：随机分为2个组，分别为试验组和对照组，其中，试验组的母猪选取253头，对照组母猪选取251头，且每组做4个重复试验并取平均值。对照组喂基础日粮。试验组基础日粮+实施例一提供的脱霉剂，且脱霉剂按照质量分数为0.1％添加到基础日粮中。试验组母猪产活仔为3163头，对照组母猪产活仔为3037头。分别对试验组和对照组的活仔进行统计用于评估脱霉剂对繁殖性能的影响，结果见表4。表4为脱霉剂对繁殖性能的影响项目试验组(头)对照组(头)改善程度窝产活仔猪数12.512.1+0.4头窝产弱仔数0.8971.175减少23.7％窝产健仔数11.610.9+0.7头木乃伊数88153减少42.9％死胎数137220减少38.5％表4中改善程度表示：试验组相对于对照组的改善程度，计算时采用：(试验组-对照组)/对照组×100％。由表4可知，使用脱霉剂后可以提高怀孕母猪的生产健康仔猪的数量，利于母猪的繁殖性能，从而提高经济效益。同时，根据窝产死胎数/(活仔数+窝产死胎数)计算试验组中窝产死胎率为4.15％，对照组中窝产死胎率为6.75％。试验组中窝产死胎率相比于对照组中窝产死胎率降低了2.6％。可见使用脱霉剂后可以降低窝产死胎率。脱霉剂对仔猪生长性能的影响试验对象：体况良好、体重相近的35日龄的断奶仔猪300头。试验分组：随机分为2个组，分别为试验组和对照组，每组50头，且每组做3个重复试验并取平均值。预饲期3天，正式期为25天。对照组喂基础日粮(保育料)，试验组在每吨基础日粮中添加1kg本实施例一提供的脱霉剂。表5为脱霉剂对仔猪生长性能的影响由表5可知，试验组相比于对照组对仔猪的生长性能均具有促进作用，同时还能降低料肉比，可见使用脱霉剂可以提高仔猪生长性能，降低料肉比，从而提高经济效益。脱霉剂的抑菌性能将大肠杆菌k88、大肠杆菌k99、大肠杆菌o157、大肠杆菌o139、金葡萄球菌和沙门氏菌分别进行平板划线培养，大肠杆菌k88、大肠杆菌k99、大肠杆菌o157、大肠杆菌o139、金葡萄球菌和沙门氏菌均来自于湖北华大瑞尔科技有限公司，培养于36℃下20h，挑取单菌落置于mh肉汤培养基中(直接购买的商品化培养基，称取21g，加入1000mlddh2o完全溶解后，调ph值至7.3±0.1，121℃灭菌15min后使用)，置于37℃振荡培养16h。将培养后的菌液通过0.01mol/lpbs缓冲液(磷酸盐缓冲液)配置成1×107cfu/ml的指示菌菌液待用。将枯草芽孢杆菌tm02进行平板划线培养，培养于36℃下20h，挑取枯草芽孢杆菌tm02菌株于50ml的lb液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加入1000mlddh2o完全溶解后，调ph值至7.3±0.1，121℃灭菌20min后使用)中，于37℃摇床转速200r/min的条件下培养24h后作为种子液；将种子液以1％的接种量接种到100ml的lb液体培养基中，于37℃摇床转速200r/min的条件下培养24h作为发酵液；将制备好的发酵液于10000r/min的条件下离心5min，取离心后的上清液并用0.22μm的无菌过滤器过滤后待用。取6个指示菌菌液各100μl，分别滴于6个lb固体平板培养基上并用涂布棒涂布均匀，直至无可见水滴，再用无菌镊子取灭菌的牛津杯，轻轻放于lb固体平板培养基的表面，每个lb固体平板培养基上均匀放置1只牛津杯。用微量移液器吸取枯草芽孢杆菌tm02菌液265μl，注入到放置平稳的每个牛津杯内(小心加入，切勿滴洒在牛津杯之外的lb固体平板培养基上)。再用灭菌陶瓷盖换掉lb固体平板培养基上的玻璃平皿盖，其中，灭菌陶瓷盖用于吸收lb固体平板培养基在后面实验过程中所蒸腾出的水分。将上述加有枯草芽孢杆菌tm02的lb固体平板培养基放置于4℃的冰箱进行扩散，8h后再将lb固体平板培养基放入37℃的恒温培养箱内，培养16h～24h后，进行拍照记录，结果如图2至图7所示。测量抑菌圈的大小，每组做3个重复试验并取平均值并记录在表6中。表6为枯草芽孢杆菌tm02的抑菌性能致病菌名称抑菌圈大小(mm)大肠杆菌k8820大肠杆菌k9922大肠杆菌o15732大肠杆菌o13920金葡萄球菌32沙门氏菌18.5抑菌圈直径≥15mm时，表示样品对指示菌的抑制效果明显；抑菌圈直径＜15mm时，表示样品对指示菌有抑制效果，但效果不明显；抑菌圈直径＝0mm时，表示样品对于指示菌无抑制效果。由表6可知，枯草芽孢杆菌tm02对以上6种致病菌的抑菌圈直径均大于15mm，说明枯草芽孢杆菌tm02对以上6种致病菌有很强的抑制效果，由此可判断含有枯草芽孢杆菌tm02的脱霉剂也具有良好的抑菌性能。脱霉剂的脱毒性能将呕吐毒素标准品粉剂和纯水(蒸馏水)配置出3管装有20ml呕吐毒素标准品溶液(1000ng/ml)备用。试验分组：对照组和脱霉剂组。对照组为1000ng/ml呕吐毒素标准品溶液，不加脱霉剂；脱霉剂组为1000ng/ml呕吐毒素标准品溶液中加入0.01g本发明实施例三提供的脱霉剂(按1吨饲料添加500g脱霉剂)；样品处理：将对照组和脱霉剂组分别置于台式振荡器中振荡2h，各取5ml溶液加入装有25ml浓度为70％的甲醇溶液的50ml离心管中，涡旋仪高速涡旋3min，静置10min，取静置后的上清液200μl，加入装有3.8ml蒸馏水的离心管中，充分混匀后待检。样品检测：提前15min打开免疫定量速测系统，使孵化器温度达到37℃，取呕吐毒素快速检测卡，取上述两个混匀后待检样品溶液各50μl分别加入到呕吐毒素快速检测卡的点样孔处，孵化检测10min后得出结果。试验结果如表7：表7为脱霉剂的脱毒结果实验组别对照组脱霉剂检测值(单位：ppb)997.7257.44脱毒率—74.2％由表7可知，脱霉剂组的呕吐毒素含量明显降低，可见，本实施例提供的脱霉剂具有良好的脱霉效果。脱霉剂的抗氧化性能称取0.03g固体高锰酸钾加入100ml水中，搅拌混匀后得到浓度为0.03％的高锰酸钾溶液，将高锰酸钾溶液分装到2个玻璃试管中，分别作为对照组和脱霉剂组。将本发明实施例三获得的脱霉剂加入浓度为0.03％的高锰酸钾溶液中，混合均匀后静置30min，观察各组分的颜色变化，结果如图1所示，右边的脱霉剂组颜色明显浅于左边的对照组。由此可知，脱霉剂组能够使高锰酸钾溶液褪色，证明本实施例提供的脱霉剂具有很强的抗氧化性能。(1)本发明实施例提供的枯草芽胞杆菌针对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中具有良好的吸附性能，对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素中的脱霉能力强。特别地，该枯草芽孢杆菌的生物代谢的胞外产物能够高效降解呕吐毒素，在生物体内的消化道中能够将呕吐毒素降解为无毒的分子片段，且降解过程不产生毒副作用。(2)本发明实施例提供的脱霉剂具有良好的吸附性能、抑菌和杀菌的功能，可提高动物的繁殖性能，提高仔猪的生长性能，并具有对抗体效价的保护作用。其中，该脱霉剂通过物理吸附和生物吸附相结合使得该脱霉剂具有良好的脱霉效果。具体而言，该脱霉剂通过蒙脱石进行物理吸附，蒙脱石层间距离较大，这使得蒙脱石具有最佳的阳离子交换平衡性，从而使脱霉剂既能够对体积较大的霉菌毒素具有良好的吸附性能，如玉米赤霉烯酮，又能够对极性较弱的霉菌毒素的能力具有较强的吸附性能，如呕吐毒素和玉米赤霉烯酮，脱霉剂利用枯草芽胞杆菌实现生物吸附，同时酵母细胞壁能够结合霉菌毒素实现生物吸附，从而有效脱去饲料中的霉菌毒素。(3)本发明实施例提供的脱霉剂具有解毒护肝的益生功能，该脱霉剂能够促进超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽等抗氧化物质的产生，从而减少肝脏因霉菌毒素中毒而受到氧化损伤，进而减少脂肪肝的发生，保护肝脏细胞免受自由基损伤。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>湖北华大瑞尔科技有限公司<120>一种枯草芽孢杆菌、脱霉剂及脱霉剂的应用<160>1<170>patentinversion3.4<210>1<211>1598<212>dna<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）<400>1cttgcttacgaatacgagctcggtaccctagggacctctagagattggttaccttgttac60gacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctcctaaaaggttacctcacc120gacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacg180tattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagtt240gcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgc300tgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgat360ttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaact420gaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcac480gacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtccta540tctccaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaatta600aaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcg660accgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccc720cctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgc780tccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggt840gttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgc900actcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcaga960cttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccaccta1020cgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaag1080gtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaa1140accttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccct1200actgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctc1260tcaggtcggc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