一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法与流程

本发明涉及食品技术领域，特别是指一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法。

背景技术：

杜仲（eucommiaulmoidesoliver）是我国传统的中药材树种，在全国分布广泛。杜仲雄花于2014年被国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料，富含黄酮类化合物、绿原酸、多酚、车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸等活性物质。车叶草苷为环烯醚萜类化合物,具有抗菌、抗氧化、抗诱变,抗肿瘤、消炎镇痛等广泛的药理作用。但杜仲雄花中车叶草苷含量较低，仅为0.4%左右。随着消费者越来越注重功能性健康茶饮料，发酵茶饮料的出现恰好迎合了现代人的需求。茶水经过微生物发酵后，增加了许多微生物代谢活性物质及微生物菌体本身等多种有效成分，品质得到很大改善。但杜仲雄花通过常用的酵母菌，如酿酒酵母、产香酵母、德氏酵母等发酵后，其发酵液中车叶草苷的含量大幅降低，其它多种活性物质也有所降低。本发明试图通过发酵过程中技术和菌种的改良，提高车叶草苷等多种活性物质的含量。

高压微射流（high-pressuremicrofluidization，hpm）是一种新兴的加工技术。国内在这方面的研究处于起步阶段。与传统高压均质不同，hpm处理过程中，物料受压时间短，压力变化率大，能在相对较低的压力下达到高压均质的效果。hpm主要运用于蛋白质以及纤维素的改性、果蔬汁的加工、活性物质的提取以及杀菌作用。目前，将hpm技术应用在茶汁灭菌的上的报道较为罕见。

针对杜仲雄花的茶饮料，公开号cn102835529a的中国专利文献公开了一种杜仲雄花茶饮料的制作工艺及配方。其配方由杜仲雄花浸提液、茉莉花浸提液、蔗糖溶液、纯净水、羧甲基纤维素钠和黄原胶组成，杜仲雄花和茉莉花分别经过浸提、过滤，按照比例与蔗糖溶液、纯净水、羧甲基纤维素钠和黄原胶混合、均质、杀菌，得到杜仲雄花茶饮料。该过程未经发酵，直接调配罐装而成。公开号cn102919473a中国专利文献公开了一种杜仲雄花茶饮料及其加工方法。发明中杜仲雄花茶饮料中加入适量杜仲主要活性成分绿原酸，能够起到良好的保健作用；不加防腐剂，而加入液体vc。该方法同样是浸提后的杜仲雄花茶水调配而成，未经发酵过程。叶文峰等以杜仲叶为原料通过酵母菌、醋酸菌、乳酸菌发酵生产富含有机酸、维生素g、维生素k等的发酵液，保持提取液中原有的营养成分，产生出许多有益于人体健康的代谢产物，增强保健功能，提高人体免疫力，而且有效成分如绿原酸稍有提高[叶文峰，冷桂华，王宜军，等.杜仲叶发酵饮料的研制[j].食品工业科技，2006，27(5):128-130]。但目前以杜仲雄花为原料的发酵型饮料研究较少，市场上也没有类似产品的出现。

技术实现要素：

本发明提出了一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法。该方法中发酵菌种采用以酿酒酵母（ys04）和产香酵母（ys11）为融合亲本得到的新型酵母工程菌，促进了杜仲雄花中京尼平苷酸（车叶草苷前体物质）向车叶草苷的转化；同时，将高压微射流技术应用在发酵液的样品杀菌过程中，不仅实现了杀菌，还克服了传统热杀菌对发酵液中多种生物活性成分的破坏。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法，包括以下步骤：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，然后按一定的比例向杜仲雄花超微粉中加入蒸馏水，得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解，得花茶酶解液；

（3）向花茶酶解液中加入碳源和氮源，高压微射流技术进行灭菌处理；

（4）灭菌结束后，接种以酿酒酵母及产香酵母为融合亲本得到的酵母工程菌进行发酵，得发酵液；

（5）发酵液经除渣、过滤后，滤液即为杜仲雄花发酵型饮料。

所述步骤（1）中杜仲雄花超微粉：蒸馏水的比例为质量比1：（40-80）。

所述步骤（2）中β-葡萄糖苷酶的加入量为1-2u/ml，酶解温度40-50℃，酶解时间2-4h。

所述步骤（3）中碳源为无水葡萄糖，碳源在花茶酶解液中的质量浓度为10-20%，氮源为蛋白胨，氮源在花茶酶解液中的质量浓度为4-8%。

所述步骤（3）中高压微射流处理在高压纳米均质机中进行，高压纳米均质机的压强梯度依次为60mpa-120mpa，流量3-5l/h，处理次数1-3次。

所述步骤（4）中酵母工程菌以酿酒酵母及产香酵母为融合亲本，通过原生质体融合技术构建，其产酒精率、产香率等指标最优，酵母工程菌的接种量以发酵液的重量为基准为3%-6%，发酵的温度为28-37℃，发酵时间3-5天。

本发明的有益效果在于：

1、本发明采用的菌种为酵母工程菌，该酵母以酿酒酵母及产香酵母为融合亲本，通过原生质体融合技术构建而成，该酵母工程菌的使用解决了普通酵母，如酿酒酵母、产香酵母、德氏酵母等单独发酵杜仲雄花造成车叶草苷含量降低的现象，同时，该菌种发酵后，发酵液中京尼平苷酸（车叶草苷前体物质）含量降低了58.5%，而车叶草苷未发酵含量仅为0.40%，发酵后达到0.68%，提高了70.0%，说明该酵母工程菌促进了京尼平苷酸向车叶草苷的转化。

2、本发明将高压微射流技术应用在茶汁的灭菌过程中，不仅实现了杀菌，还克服了传统热杀菌对发酵液中多种生物活性成分的破坏。以热杀菌处理的杜仲雄花发酵液为对照，在80mpa和100mpa压力时，杜仲雄花发酵液的营养指标达到最高，其中总酚含量提高34.1-36.9%，黄酮含量提高27.0-30.4%，绿原酸含量提高25.0-35.0%，桃叶珊瑚苷含量提高16.2-24.3%。

附图说明

图1为不同菌种发酵对京尼平苷酸和车叶草苷含量的影响。

图2为不同hpm压力对杜仲雄花发酵型饮料营养指标的影响（0为热处理灭菌的杜仲雄花发酵饮料）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：40混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入1u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间为3h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为10%无水葡萄糖和质量浓度为5%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力80mpa，流量4l/h，处理1次；

（4）灭菌结束后，分别加酿酒酵母ydj05、产香酵母ys03和酵母工程菌，接种量以发酵液的重量为基准均为3%，30℃进行发酵，发酵3天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

（6）对发酵液的营养成分进行分析，分析检测方法见“实施例1的检测实验”，结果如图1所示。

其中酵母工程菌的制备方法为：

（1）双亲原生质体的制备：本研究将前期筛选得到的发酵性能与产香较好的两株酵母ys04和ys11进行原生质体融合；制备菌体的悬浮液，接种，32℃摇床培养16h；培养结束后，35℃酶解100min去细胞壁；

（2）原生质体融合：亲本菌株原生质体灭活条件为80℃水浴20min；灭活后的俩亲本原生质体加入融合剂（30%peg，0.01mol/lcacl2，0.06mol/lnacl），30℃培养箱中静止35min，[操作步骤详见:亚当斯a,戈特施林de,凯泽ca,斯特恩斯t.酵母遗传学方法实验指南[m].北京:科学出版社,2000]；

（3）融合子的优选：将筛选出的融合子接种到完全培养基上活化后，分别接种到10ml的带有杜氏管的试管中，28℃培养，根据产气情况、产酒精及产香情况筛选得到最优的融合子，作为杜仲雄花的酵母工程菌。

实施例2

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：40混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入1u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间为3h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为10%无水葡萄糖和质量浓度为5%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力依次为60mpa、80mpa、100mpa和120mpa，流量4l/h，处理1次，同时以热处理灭菌为对照，热处理为121℃灭菌10min；

（4）灭菌结束后，以发酵液的重量为基准接种3%酵母工程菌，30℃进行发酵，发酵3天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

（6）对杜仲雄花发酵型饮料的营养成分进行分析，分析检测方法见“实施例1的检测实验”，结果如图2所示。

其中酵母工程菌的制备方法参照实施例1。

实施例3

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：50混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入1u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间为2h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为20%无水葡萄糖和质量浓度为8%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力60mpa，流量4l/h，处理1次；

（4）灭菌结束后，以发酵液的重量为基准接种4%酵母工程菌，30℃进行发酵，发酵5天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

其中酵母工程菌的制备方法参照实施例1。

实施例4

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：70混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入2u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度50℃，酶解时间为3h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为20%无水葡萄糖和质量浓度为7%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力80mpa，流量4l/h，处理3次；

（4）灭菌结束后，以发酵液的重量为基准接种4%酵母工程菌，35℃进行发酵，发酵4天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

其中酵母工程菌的制备方法参照实施例1。

实施例5

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：80混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入2u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度50℃，酶解时间为4h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为20%无水葡萄糖和质量浓度为8%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力100mpa，流量5l/h，处理2次；

（4）灭菌结束后，以发酵液的重量为基准接种5%酵母工程菌，35℃进行发酵，发酵3天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

其中酵母工程菌的制备方法参照实施例1。

实施例6

本实施例提供一种杜仲雄花发酵型饮料制备的方法：

（1）取干燥的杜仲雄花进行超微粉碎得杜仲雄花超微粉，按杜仲雄花超微粉与蒸馏水的质量比1：70混合得杜仲雄花超微粉与水的混合物；

（2）向混合物中加入1.5u/ml的β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间为2h，得花茶酶解液；

（3）酶解结束后，向花茶酶解液中加入质量浓度为10%无水葡萄糖和质量浓度为4%的蛋白胨，经高压微射流处理进行灭菌，压力120mpa，流量3l/h，处理3次；

（4）灭菌结束后，以发酵液的重量为基准接种6%酵母工程菌，28℃进行发酵，发酵5天得花茶发酵液，花茶发酵液的酒精度≤0.5%（v/v）；

（5）发酵结束后，经除渣，过滤，获得杜仲雄花发酵型饮料。

其中酵母工程菌的制备方法参照实施例1。

实施例1的检测实验

一、杜仲雄花发酵型饮料营养指标的测定

（1）总酚含量的测定

采用福林酚比色法测定。绘制没食子酸标准曲线，得到：y=1.168x-0.0211，r²=0.999。

具体方法：取待测样品2ml，加1.0ml福林酚，摇匀。1min后加入20%na2co3溶液1.5ml于各试管中，混匀定容，75℃下，反应10min。室温条件下，在760nm下测定吸光度。并根据回归方程y=1.168x-0.0211，计算出杜仲叶发酵液样品中总酚含量（以没食子酸计），单位为mg/ml。

（2）黄酮含量的测定

绘制芦丁标准曲线，得到：y=0.1108x+0.0029，r²=0.9987。

取待测样品1ml，用50%乙醇溶液稀释至5.00ml，再加入0.3ml5%(g/l)nano2溶液，摇匀，放置6min之后再加入0.3ml的5%(g/l)al(no3)3溶液，摇匀，再静置6min之后加入4ml的4%naoh溶液，用50%乙醇水溶液定容至10ml，摇匀，静置12min。在504nm处测量吸光值，根据回归方程y=0.1108x+0.0029，计算出杜仲叶发酵液样品中总黄酮含量，单位为mg/ml。

（3）绿原酸含量的测定

参照gbt22250-2008保健食品中绿原酸的测定方法（适用于杜仲）。

（4）桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和车叶草苷含量的测定

利用高效液相色谱仪测定（以下方法可同时检测桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和车叶草苷含量）。供试品溶液的制备：杜仲雄花发酵液以3000r/min离心10min后，再经0.22μm微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。同时以桃叶珊瑚苷标品、京尼平苷酸标品和车叶草苷标品为参照。

色谱条件：ods-diamonsil-c18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，以甲醇为流动相b，以0.5%磷酸水溶液为流动相c，进行梯度洗脱(0-30min，5%-15%b;30-70min，15%-30%b);检测波长为206nm(0-15min)，236nm(15-55min);体积流量1.0ml/min;柱温25℃;进样量8μl。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。