含核酸发酵调味料及其制造方法与流程

本发明涉及以高浓度含有在制造工序中由核酸生产微生物生产的核酸的发酵调味料及其制造方法。

背景技术：

酱油根据“酱油品质表示基准”被区分为“特级”、“高级”、“标准”。这些等级是通过被称为“鲜味”的指标的“氮分”的含量、色度(颜色的深浅)等来规定的，通常认为，氮分的含量越多，酱油的鲜味越丰富。作为有助于酱油的鲜味的氮分，已知有以谷氨酸为代表的氨基酸类。

另一方面，作为氨基酸以外的鲜味成分，已知有5’-核苷酸类。5’-核苷酸类是以5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-肌苷酸和5’-黄苷酸等为代表的呈味性核苷酸类的总称，包含它们的调味料也有时被称为核酸类调味料。已知5’-核苷酸类单独即具有强呈味作用，当存在含有在酱油中的l-谷氨酸时，可通过协同效应显著地改善并强化风味。

但是，由于酱油中存在来自于各种微生物的大量磷酸酶，因此，即使在酱油中添加呈味性核苷酸类，核苷酸类也会因磷酸酶的作用被脱磷酸化而被分解为无呈味性的核苷。

例如，已知低温灭菌(火入れ)前的生酱油是该磷酸酶活性特别强的物质之一，所添加的呈味性核苷酸类在添加后1天时几乎都分解消失，这些核苷酸类的呈味性完全消失(专利文献1)。另外已知，生酱油中存在相当强的磷酸酶活性，但低温灭菌(达到80℃的温度)后的酱油中也残留有生酱油的约10％～约25％的磷酸酶活性。

因此认为，使磷酸酶活性失活是为了在酱油中添加5’-核苷酸类并使其稳定保持所需要的。现有已知的含5’-核苷酸类的酱油的制造法是在使通过常规方法制造的酱油的磷酸酶活性失活后另外添加5’-核苷酸类的方法(专利文献2、3)。但是，在向酱油中添加核酸的情况下，基于食品表示相关法规的规定，必须对原材料进行添加物的表示，因此必须表示为“调味料(核酸)”。这样的酱油样调味料不能宣称“化学调味料无添加”或“天然酿造”，对于天然意向、自然意向的消费者的诉求力弱。

作为发酵生产呈味性核苷酸类的公知的微生物，例如已知有高核酸型酵母提取物的制造中使用的产朊假丝酵母(candidautilis)、核酸调味料的制造中使用的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)等。即使想要使这些微生物在无磷酸酶活性的酱油或醪(諸味)中生长来发酵生产核酸，也会由于没有耐盐性而无法在酱油或酱油醪中增殖，无法高含有核酸。基于这样的背景，在以往的酱油制造业界中，认为不添加5’-核苷酸类而通过发酵使5’-核苷酸类在酱油醪或压榨后的生酱油、或者低温灭菌后的酱油中生成并蓄积是极其困难的，迄今为止尚未得到实用化。

另一方面，虽然并非酱油酿造工序中的直接发酵生产，但在若干文献中记载了含有核酸作为呈味成分的酱油的制造方法。例如，在专利文献4中公开了一种浓厚酱油的制造法，其特征在于，在天然酿造酱油的醪的制造工序中，作为投入到出曲(出麹)后的原料中的投料水，使用在清酒等的发酵糟中加水并在50～60℃下自消化1～2周而得到的液体、或者对其进行压榨而得到的呈味性高的液体。但是，需要使用特殊的原料(即酒糟或烧酒蒸馏废液)。因此，与通常的酿造酱油相比，具有风味也相差相当悬殊的缺点。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公昭53-33661号公报

专利文献2：日本特公昭39-27496号公报

专利文献3：日本专利第4781365号公报

专利文献4：日本特开昭54-84097号公报

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供不从外部添加5’-核苷酸类而高浓度地含有来自发酵的5’-核苷酸类的发酵调味料及其制造方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，向在以大豆或小麦等作为主要原料的谷物原料中接种曲菌而制备的固体曲中添加无盐或低盐的投料水来制备醪，对该醪进行加热灭菌(磷酸酶失活)后，在能够抑制有害微生物混入的容器中在防止污染的同时进行核酸发酵，由此能够利用不具有耐盐性的核酸发酵生产微生物进行核酸发酵，能够在不另外添加核酸的情况下得到以高浓度含有来自发酵的核酸的发酵调味料，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种发酵调味料，其含有10ppm(w/v)以上的核酸(其中不包括来自添加的核酸)和2ppm(w/v)以上的hdmf。

另外，本发明提供一种发酵调味料的制造方法，其具有：在以大豆或小麦等作为主要原料的谷物原料中接种曲菌而制备固体曲，添加水或食盐水，对食盐浓度为4％(w/v)以下的醪进行加温分解的工序；通过对上述醪进行加热处理使磷酸酶失活而制备灭菌醪的工序；在上述灭菌醪中接种核酸生产微生物并在能够抑制有害微生物混入的容器中进行核酸发酵的工序；通过使上述核酸生产微生物进行自消化，使菌体内的rna游离到醪中而制备rna提取物的工序；以及使核酸酶和腺苷酸脱氨酶作用于上述rna提取物而将其转变为具有呈味性的5’-核苷酸类的工序。

发明效果

根据本发明，能够提供不从外部添加5’-核苷酸类(核酸)而仅利用核酸生产微生物在发酵中生产的5’-核苷酸类来高浓度地含有核酸的发酵调味料及其制造方法。

附图说明

图1是本实施方式的含核酸发酵调味料的制造方法的工序图。

图2是示出对无盐醪进行加热后添加呈味性核酸(5’-鸟苷酸和5’-肌苷酸)、并经时地对核酸浓度进行定量的结果的图。

具体实施方式

以下，详细地对本发明的发酵调味料及其制造方法进行说明。图1是本实施方式的含核酸发酵调味料的制造方法的工序图。

本发明中，核酸是指以5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-肌苷酸和5’-黄苷酸等为代表的呈味性核苷酸类。

本发明的实施方式中，首先在由谷物原料制备的固体曲中混合水或食盐水，制备食盐浓度为4％(w/v)以下、优选食盐浓度小于4％(w/v)、更优选食盐浓度为0％(w/v)的酱油醪，在25～57℃下进行0～48小时加温分解。优选如日本专利第3827300号所记载的那样，将70～80℃的热水或食盐水与固体曲混合，在将醪温度保持于50～57℃的状态下，在槽内间歇地或连续地进行搅拌，进行15～30小时酶分解。

在此，谷物原料是指例如以完整大豆、脱脂大豆、大豆蛋白、小麦谷蛋白、豌豆、蚕豆、小豆等为代表的蛋白质原料和以小麦、大麦、黑麦、麦糠、大米、米糠、玉米、淀粉糟等为代表的淀粉质原料。这些谷物原料可以单独或组合使用。

在此使用的曲(固体曲)通过在利用常规方法进行原料处理而得到的蛋白质原料或者在其中混合淀粉质原料而得到的原料中接种以酱油曲霉(aspergillussojae)、米曲霉(aspergillusoryzae)为代表的曲菌、并进行2～3天固体培养(制曲)而得到。在蛋白质原料中混合淀粉质原料的情况下，配合比例没有特别限定，例如在想要得到接近通常的酱油的调味料的情况下，优选以重量比计设定为1:0.25～4。

投料所用的水或食盐水只要是充分浸泡曲的程度即可，通常相对于曲重量优选为1～10容量倍(v/w)。另外，在加温分解时，为了提高防霉性和分解效率、提高风味，可以添加后述的食用酸或酶剂、活性炭。

在加温分解时，为了促进醪的分解，可以以终浓度为0.001～1％(w/v)的方式添加酶剂。作为酶剂，可以列举例如蛋白酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶等。

接着，对于进行了加温分解的食盐浓度为4％(w/v)以下的固液分离前的酱油醪进行加热处理，制备灭菌醪。通过该加热处理，使在上述制曲工序中曲菌所生产的磷酸酶等核酸分解酶失活，并且进行醪的灭菌。在此，为了减轻灭菌机的负荷、提高核酸生产微生物的生长速度，可以在灭菌前适当进行加水来稀释醪。

在此，加热处理的方法没有特别限定，可以使用uht、htst、蒸馏罐、加压罐、蒸汽喷射、蒸汽注入、高压釜、板式加热器、刮面式、焦耳式热交换、管式热交换等加热处理方法中的任意一种，优选使用加压罐、管式热交换机。例如，可以通过将醪装入加压罐中，一边均匀地搅拌一边加压加温等来进行核酸分解酶的失活和灭菌。加热温度过低或加热时间过短时，核酸分解酶的失活和杂菌的灭菌变得不充分，因此不优选。相反，加热温度过高或加热时间过长时，调味料的风味劣化，因此不优选。最佳条件根据所选择的加热方法而有所不同，例如优选在80℃下为2分钟以上且180分钟以下、在121℃下为5秒以上且15分钟以下、在130℃下为1秒以上且30秒以下。

为了提高防霉性、调整味道，制备的醪可以进行ph调节。从防霉性和酵母的发酵性的观点出发，调节后的ph期望为3.0～7.0、优选为4.0～5.5。作为ph调节的时机，可以是加温分解时、醪的加热处理前、醪的加热处理后的任一时机。作为ph调节剂的食用酸可以列举例如乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、己二酸等，从风味的观点出发，优选乳酸。

为了顺利地利用核酸生产微生物进行核酸发酵，可以在醪中添加0～20％(w/v)的糖质。可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、甘油等核酸生产微生物能够同化的糖质，若考虑同化效率，则优选使用葡萄糖。另外，也可以使用包含这些糖的食品原材料、例如砂糖、葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、三温糖、糖蜜等。

另外，在核酸发酵之前，为了促进醪的分解、提高压榨性，也可以以终浓度为0.001～1％(w/v)的方式添加酶剂。作为酶剂，可以列举例如蛋白酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶等。

另外，在核酸发酵之前，为了除去苦味而提高风味，可以在醪中添加活性炭。活性炭优选为粉末，更优选使用平均粒径为10～100μm的活性炭。活性炭的添加量相对于醪原料优选为0.1～5％(w/w)。活性炭的种类可以根据用途而适当选择，例如可以将具有苦味除去、恶臭除去、味道的调整、颜色的调整或这些功能的活性炭组合使用。

另外，在核酸发酵之前，可以对上述灭菌醪进行固液分离。固液分离的方法没有特别限定，例如可以通过压榨、离心分离、过滤等方法来实施。

本发明中使用的核酸生产微生物只要是能够生产核酸的微生物则没有特别限制，可以使用例如产朊假丝酵母(candidautilis)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)等酵母、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、产氨短杆菌(corynebacteriumammoniagenes)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等细菌、或者它们的营养需求/类似物抗性突变株。本发明的醪由于为无盐或低盐，因此可以使用原本耐盐性弱的酵母或细菌。

关于这些核酸生产微生物的添加浓度，若为酵母，则优选以每1g醪中达到1×10⁴个以上、优选1×10⁵～1×10⁷个的方式添加，若为细菌，则优选以每1g醪中达到1×10⁴个以上、优选1×10⁵～1×10⁷个的方式添加。

将醪投入到能够抑制有害微生物混入的容器中，在该容器内进行核酸发酵。在此，能够抑制有害微生物混入的容器只要是具有能够将容器内部与外部空气阻断的结构的容器即可，在实验中可以使用聚丙烯制的灭菌完毕的广口瓶或玻璃制的培养瓶等，在工业上可以使用具有能够向容器内供给除菌后的空气的功能的缸式发酵槽、加压式发酵罐等。另外，空气的除菌可以使用能够将0.3μm以上的灰尘进行99.97％以上的集尘的过滤器、例如hepa过滤器等。

核酸发酵在核酸生产微生物能够生长的温度下、具体而言在15～45℃、优选20～35℃下进行1～90天、优选2～28天。

本实施方式的发酵调味料中含有的醇可以通过核酸发酵工序中添加的糖浓度、所使用的微生物的种类、温度条件将产生量调节为0～20％(w/v)，另外，也可以在核酸发酵结束时添加醇，但为了使其作为发酵调味料具有良好风味，优选使醇小于8％(w/v)、更优选为2～7％(w/v)。

核酸发酵结束后，使醪中的核酸生产微生物进行自消化，或者使用包含蛋白酶或β-葡聚糖酶的酶剂使酵母细胞壁溶解，使菌体内的rna游离到醪中。自消化可以通过对醪进行一定时间的加温来进行。自消化例如更优选在足以使核酸生产微生物的rna的溶出达到最大的条件下进行、例如在品温40～60℃下进行1分钟～24小时。品温低于40℃时，自消化需要时间，并且来自核酸生产微生物的rna在醪液汁中的溶出不充分，相反，在超过60℃的温度下，会导致由醪的加热劣化引起的褐变或风味的劣化，因此不优选。时间少于1分钟时，来自核酸生产微生物的rna的溶出不充分，相反，超过24小时时，因加热劣化而导致醪的褐变或风味的劣化，因此不优选。另外，自消化时为了提高核酸的游离效率，也可以将在消化之前使内源性核酸分解酶加热失活的方法、进行冷冻融解的方法、添加乙醇等有机溶剂的方法、进行超声波处理的方法、调节至ph约4～约6的酸性或ph约8～约12的碱性的方法等公知的方法组合使用。另外，作为溶解酵母细胞壁的酶剂，可以根据常规方法使用ツニカーゼ(商标、天野酶公司制造)、デナチームgel(商标、长濑chemtex公司制造)、フィルトラーゼbrx(商标、dsm公司制造)等。

在进行核酸生产微生物的自消化或酶消化后，对无呈味性的rna提取物进行酶处理，将其转变为具有呈味性的5’-核苷酸类(核酸)。酶可以使用核酸酶，优选在核酸酶的基础上使用脱氨酶。作为核酸酶，可以列举核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶等，优选为核糖核酸酶。此外，核糖核酸酶中，根据切割方式可以列举p1核酸酶、s1核酸酶等，可以使用任意一种酶。另外，作为脱氨酶，优选为腺苷酸脱氨酶。这些酶均可以使用市售的各种酶。或者，也可以添加麦芽或发芽米等包含这些酶的食品。酶处理中的温度、ph、添加量、处理时间等可以考虑所使用的酶的种类、活性的强度、所期望的核酸浓度等而适当确定。另外，实施酶处理的顺序只要能够对核酸酶处理物进行脱氨酶处理即可，可以在实施核酸酶处理后的rna提取物中添加脱氨酶来进行脱氨酶处理，在所使用的核酸酶和脱氨酶都在相同的温度下显示酶活性的情况下，可以将核酸酶和脱氨酶一起添加到rna提取物中来同时进行酶处理。

例如，将除去不溶物后的rna提取物调节至ph4.0以上且低于ph7、优选ph4.5～6.0后，添加核酸酶，在60～80℃下进行30分钟～12小时核酸酶处理，然后添加脱氨酶，在40～60℃下进行30分钟～6小时脱氨酶处理，由此能够充分地生成肌苷酸和鸟苷酸。

酶处理工序结束后的醪如直接在不进行压榨的情况下制成醪(味噌、糊料)样调味料，则能够制成高浓度地包含来自发酵的核酸的醪样调味料。另外，通过利用压榨、低温灭菌、澄清、过滤等常规方法对醪进行处理，能够得到高浓度地包含来自发酵的核酸的发酵调味料(例如酱油样调味料)。

酶处理工序结束后，也可以通过在醪中添加食盐而制备含有食盐的发酵调味料。即，通过在无盐或低盐条件下进行醪的核酸发酵而促进核酸发酵，在由此得到的发酵醪中添加任意浓度的食盐，由此能够制造具有酱油那样的风味的发酵调味料。食盐的添加量可以适当设定，根据食盐浓度，能够容易地制备减盐酱油样调味料或浓口酱油样调味料。

本实施方式的发酵调味料中，除来自添加的核酸以外的核酸浓度为10ppm以上。核酸浓度可以通过核酸发酵工序中添加的糖浓度、所使用的微生物的种类、温度条件进行适当调节，但由于核酸浓度取决于核酸生产微生物的核酸生产能力，因此，上限值自然由核酸生产微生物的种类决定。例如，在利用上述的核酸生产酵母进行核酸发酵的情况下，上限值为约5000ppm。需要说明的是，也可以在核酸发酵后利用加热减压浓缩、喷雾干燥、冷冻干燥等公知的方法进行浓缩加工，将发酵调味料中的核酸浓度提高至上述上限值以上。

通常的浓口酱油的核酸含量为检测限以下，与此相对，本实施方式的发酵调味料如上所述含有显著量的核酸。因此，通过与酱油中原本含有的谷氨酸(约0.2(w/v)～约2.0％(w/v))的协同效应，本实施方式的发酵调味料和使用该发酵调味料的饮食品的鲜味、浓郁感(コク)显著提高。假设从外部添加核酸，则必须对原材料进行添加物的表示，因此无法宣称化学调味料无添加或天然酿造，但若为本实施方式的发酵调味料，则不需要对原材料名进行添加物的表示，对自然意向、天然意向的消费者能够满足附加价值的诉求。

另外，本实施方式的发酵调味料中，作为香气成分之一的4-羟基-2,5-二甲基-3(2h)-呋喃酮(也称为羟基二甲基呋喃酮、hdmf)浓度为2ppm(w/v)以上，具有更理想的风味。hdmf是代表性的呋喃酮化合物，兼具砂糖样的甘甜和果香，作为酱油等有助于呈味强化的调味料的代表性香气成分而已知。本发明的发酵调味料的特征在于，含有与通常的浓口酱油同等以上的hdmf，酱油那样的清香风味优良。hdmf浓度低于2ppm时，酱油那样的清香风味变得不充分。本实施方式的发酵调味料中含有的hdmf是从作为原料的曲经过发酵而产生的，与上述核酸同样不需要对原材料名进行添加物的表示，因此对于自然意向、天然意向的消费者能够满足附加价值的诉求。

作为本实施方式的其他实施方式，可以将利用通常的方法制备的生酱油或低温灭菌酱油利用电透析等进行脱盐而降低食盐浓度，由此制成食盐浓度为4％(w/v)以下的脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油，然后如上所述实施加热灭菌(磷酸酶失活)、无菌的核酸发酵、向呈味性核酸的转变。

即，将利用通常的方法制备的生酱油或低温灭菌酱油利用电透析等进行脱盐而降低食盐浓度，由此制备食盐浓度为4％(w/v)以下的脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油。接着，将脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油在带夹套的罐中进行加热、或者利用板式加热器或管式加热器等热交换器进行加热处理，由此使脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油中的磷酸酶失活，并且对脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油进行灭菌。然后，将灭菌后的脱盐生酱油或脱盐低温灭菌酱油无菌地移至能够抑制有害微生物混入的容器中，接种核酸生产微生物，在先前说明的发酵条件下进行核酸发酵。然后，使核酸生产微生物进行自消化，使菌体内的rna游离到醪中，由此制备rna提取物，若使核糖核酸酶等核酸酶和腺苷酸脱氨酶等脱氨酶作用于rna提取物，则使其转变为具有呈味性的5’-核苷酸类，能够制造所期望的发酵调味液。

本发明的发酵调味料可以直接采用与天然调味料或日本农林标准中定义的酱油同样的使用方法，另外也可以配合到任意的饮食品中。因此，能够提供含有本发明的发酵调味料的鲜味和浓郁感得到改善的饮食品。作为饮食品的具体例，可以列举例如酱油加工品、汤汁、作料汁、柑橘醋(ぽん酢)、日式高汤、西式高汤、中式高汤、调味汁(dressing)、汤、沙司、家常菜的原料(惣菜のもと)等调味料原料；包含蔬菜、果实、谷物等的加工品的农产加工食品；包含鱼贝类、海藻等的加工品的水产加工食品；包含鸡蛋、乳制品等的加工品的畜产加工食品；等等。含有本发明的发酵调味料的饮食品的最终产品的核酸含量提高，因此能够提高鲜味和美味性。而且，具有如下优点：在最终产品的原材料表示中，能够作为发酵调味料来表示，不需要进行核酸的添加物表示。

以下，利用实施例进一步具体地对本发明进行说明。但是，本发明的技术范围不受这些示例的任何限定。

实施例

(实施例1)高核酸发酵调味料的制备

1.酱油曲的制作

按照脱脂加工大豆50％(w/w)与烘焙破碎小麦50％(w/w)的配合比例，根据常规方法制作酱油曲。需要说明的是，脱脂加工大豆使用洒水130％(w/w)并蒸煮后的脱脂加工大豆。在该原料中接种酱油曲霉(aspergillussojae)的种曲，在25℃～40℃、湿度95％的环境下进行42小时制曲，得到酱油曲。

2.醪的制备

相对于上述酱油曲100重量份，混合200重量份的加温至70℃的热水(不含食盐)，在旋转轴上配置有搅拌叶片的带保温夹套的分解槽内连续地以100rpm进行搅拌，在55℃进行24小时加温分解，得到无盐的醪。

3.醪的灭菌和磷酸酶失活处理

将上述无盐醪600g放入2.5l容积的缸式发酵槽(バイオット公司制造)中，添加磷酸二氢钾(和光纯药工业公司制)12g、消泡剂(信越有机硅公司制造)0.6ml、自来水360ml，并添加氢氧化钾(和光纯药工业公司制造)而调节至ph5.5，在高压釜中进行121℃、5分钟的灭菌。

4.核酸发酵

将上述无盐醪冷却至30℃，接种产朊假丝酵母(candidautilis)作为核酸生产酵母，根据常规方法在30℃下进行48小时的培养。以1.7g/小时流加另行灭菌的50％葡萄糖水溶液，以1l/分钟、内压0.04mpa通入无菌空气。搅拌速度设定为600rpm。

5.酶处理

培养结束后，添加ツニカーゼ(商标、天野酶公司制造)300mg，在50℃下搅拌2小时。接着，添加核酸酶アマノg(商标、天野酶公司制造)300mg，在65℃下搅拌1小时。进一步添加デアミザイム(商标、天野酶公司制造)300mg，在45℃下搅拌1小时。最后在80℃下搅拌20分钟使酶失活，根据常规方法用滤纸(アドバンテック公司制造)进行过滤，得到高含有核酸的发酵(酱油样)调味液(样品1)。

6.发酵调味料的成分分析

(1)呈味性核酸的定量

呈味性核酸的定量利用对现有报道(东京都立卫生研究所研究年报、p172-175、2001年)进行改变后的方法，使用高效液相色谱(hplc)来进行。即，使用固相提取柱sep-paklightqma(沃特世公司制造)，按照下述要点进行预处理。

↓甲醇2ml(活化)

↓超纯水4ml(平衡化)

↓样品300ul

(与氨50ul混合，加样350ul)

↓超纯水3ml(非吸附级分)

↓1％甲酸5ml(吸附级分)

↓利用离心浓缩装置进行蒸发干固

↓再溶解于hplc的洗脱液a中

接着，利用hplc(岛津制作所公司制造)对该预处理完毕的样品进行分析。条件如下所述。

柱：shiseidocapcellpakc18mgiii4.6x250mm(资生堂公司制造)

洗脱液a：0.1％三乙胺+1％甲醇/超纯水、ph5.0(用磷酸进行调节)

洗脱液b：80％乙腈/超纯水

流速：1.0ml/分钟、检测：uv254nm

根据作为标准品使用的5’-imp和5’-gmp的标准曲线进行定量。其结果，核酸浓度如表1所示。其中，浓度为5.酶处理中得到的发酵调味液的单位液量的浓度(w/v)。

(2)hdmf的定量

hdmf的浓度利用j.agric.foodchem.vol.39,934,1991中记载的定量分析法来实施。更具体而言，利用气相色谱(安捷伦科技公司制造的6890n)进行分析，利用使用标准物质得到的标准曲线法确定各种香气成分含量。

[表1]

*1龟甲万株式会社制造的“龟甲万酱油”

*2检测限＝1ppm

(实施例2)在酱油样调味液中添加核酸的效果

在利用日本专利第5836466号公报的实施例2-1记载的方法制备的无盐酱油样调味料中，以使食盐浓度小于4％(w/v)的方式添加食盐，进一步以各浓度添加含有5’-imp和5’-gmp作为主要成分的调味料(商品名：リボタイド，mcフードスペシャリティーズ公司制造，5’-imp:5’-gmp含量比＝1:1)，制备期望的酱油样调味液(样品2～7)。对于这些各样品，按照以下的要点进行感官评价。需要说明的是，通过分析确认到对照的减盐酱油中原来含有的核酸量为检测限以下。关于感官评价，具有辨别能力的7位评审员用玻璃吸管将样品的原液直接含于口中来评价与未添加核酸的对照的酱油样调味液是否有味道差异，以能够辨别出差异的人数来表示。进一步，通过全部评审员的讨论，用符号表示出综合味道的理想程度(表2)。需要说明的是，符号表示以下的评价。◎：与对照相比非常理想、○：与对照相比理想、×：与对照同等。

[表2]

根据表2，在核酸浓度为10ppm以上的样品(样品3～7)的情况下，全部评审员都辨别出味道的差异，特别是在100ppm以上时，有鲜味和味道的持续性提高的评价。由该结果显示，通过在利用与本发明类似的制造法得到的酱油样调味料中含有10ppm以上的核酸，能够改善酱油样调味料的味道。但是，核酸浓度为10000ppm时，评审员有核酸的味道过强、作为酱油样调味料的味道的平衡被破坏的评价，因此综合评价与对照为同等程度。

(实施例3)在酱油中添加含核酸发酵调味料的效果

在减盐酱油(龟甲万株式会社制造、市售品)中改变配合量地添加本发明的实施例1中制备的含核酸酱油样调味料(样品1)，制备核酸浓度为1～1000ppm的酱油样调味液。对于这些各样品，按照以下的要点添加食盐以使食盐浓度为9％(w/v)，制备期望的酱油样调味料(样品8～12)。对于这些各样品，通过与实施例2同样的方法进行感官评价。

[表3]

由表3确认到，在以使核酸浓度为10ppm以上的方式添加本发明的含核酸发酵调味料时，减盐酱油的味道显著改善。需要说明的是，核酸浓度为1000ppm时，由于含核酸发酵调味料的配合量比较多，因此感觉到与对照的减盐酱油略有不同的味道，但整体上品质得到改善。另外确认到，由于本发明中含有显著量的hdmf，因此具有酱油那样的清香的香气，作为发酵调味料具有优良的品质。

(实施例4)核酸分解酶的失活条件

在实施例1的无盐醪4g中添加自来水6ml，将其在50℃、60℃、70℃、80℃下10分钟、或者121℃下2分钟的条件下进行加热。接着，在各醪中添加5’-鸟苷酸900ppm、5’-肌苷酸900ppm，在30℃下振荡46小时。然后，通过离心分离除去固体成分，使上清液从0.45μm过滤器(アドバンテック公司制造)中通过。

呈味性核酸的定量使用高效液相色谱质谱分析仪(lc-ms)来进行。条件如下所述。

柱：poroshell120pfp3.0x150mm(安捷伦公司制造)

洗脱液a：0.1％甲酸/超纯水

洗脱液b：0.1％甲酸/乙腈

流速：0.4ml/分钟

离子化：esi(+)

检测：sim模式

按照标准添加法，使用5’-imp和5’-gmp的标准品进行定量。将其结果示于图1。图1是示出将无盐醪加热后添加呈味性核酸(5’-鸟苷酸和5’-肌苷酸)、并经时地对核酸浓度进行定量的结果的图。

如图1所示，在加热温度为70℃以下的情况下，在处理了18小时的时刻呈味性核酸完全被分解，但在加热温度为80℃以上的情况下，直到处理开始后46小时呈味性核酸也未被分解。因此判断出，为了使核酸分解酶失活，需要进行80℃、10分钟的灭菌。

(实施例5)利用各种酵母进行的核酸发酵

在实施例1的无盐醪40g中添加磷酸二氢钾1g、消泡剂0.1g、自来水60ml，用氢氧化钾调节为ph5.5，在高压釜中进行121℃、2分钟的灭菌。

在上述培养基中添加另行灭菌的50％葡萄糖溶液5ml，接种产朊假丝酵母(candidautilis)(样品13)或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(样品14)或鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)(样品15)或马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)(样品16)，根据常规方法在30℃下进行24小时的培养。

培养结束后，通过离心分离从培养液20ml中除去上清液，将所得到的沉淀悬浮于水中，制备酵母悬浮液20ml。在该酵母悬浮液中添加乙醇0.5ml后，调节ph至8，在50℃下振荡2小时。接着，调节ph至5，添加核酸酶アマノg(商标、天野酶公司制造)7.5mg，在65℃下反应1小时。进一步添加デアミザイム(商标、天野酶公司制造)7.5mg，在55℃下反应1小时。最后在85℃下加温20分钟使酶失活，通过离心分离去除固体成分，得到核酸发酵调味液(样品13～16)。

在与实施例4同样的条件下对核酸发酵调味液进行分析，结果，核酸浓度如表4所示。由表4显示，产朊假丝酵母以外的酵母也能够用于核酸发酵调味液的制造。

[表4]

(实施例6)hdmf浓度的比较

为了将本发明品与市售的高核酸酵母提取物中含有的hdmf浓度进行比较，制作核酸发酵调味液。

在实施例1的无盐醪520g中添加磷酸二氢钾13g、消泡剂0.6g、自来水380ml，用氢氧化钾调节为ph5.5，在高压釜中进行115℃、15分钟的灭菌。在该培养基中接种产朊假丝酵母，根据常规方法在30℃下进行22小时的培养。以8.4g/小时流加另行灭菌的50％葡萄糖水溶液，以1l/分钟、内压0.04mpa通入无菌空气。搅拌速度设定为600rpm。

培养结束后，在培养液30ml中添加乙醇1ml，然后将ph调节至6.5，在50℃下振荡2小时。接着，调节ph至5，添加核酸酶アマノg(天野酶公司制造)15mg，在70℃下反应1小时。反应后，调节ph至6.5，添加デアミザイム(天野酶公司制造)15mg，在55℃下反应1小时。最后在85℃下加温20分钟使酶失活，通过离心分离去除固体成分，得到核酸发酵调味液(样品17)。

将アロマイルド(商标、兴人生命科学公司制造)0.25g添加到50ml的纯净水中，将其用含有0.1％甲酸的水溶液稀释50倍，将所得物用于呈味性核酸的分析。hdmf的定量使用在50ml的纯净水中添加有50mgアロマイルド的液体。hdmf的定量和呈味性核酸的定量条件如实施例1中记载的条件所述。

将结果示于表5。如表5中所记载的那样，市售浓口酱油的呈味性核酸为检测限以下，而本发明的发酵调味液(样品17)含有显著量的呈味性核酸。另外，本发明的发酵调味液(样品17)含有与市售浓口酱油同等的hdmf，但从市售高核酸酵母提取物中检测不到hdmf。

因此判断出，本发酵调味液在无添加的情况下高含有核酸，能够提供酱油那样的清香风味优良的调味液。

[表5]

*1龟甲万株式会社制造的“龟甲万酱油”

*2检测限＝1ppm

*3兴人生命科学公司制造的“アロマイルド”(商标)