本发明涉及一种蝇蛆体外分泌物的提取方法及应用。
背景技术：
：现代社会对于肉类食品消费剧增，畜牧业发展迅猛，但是对于农牧业而言，动物疾病盛行是一个难以控制的因素，为了预防或治疗细菌引起的疾病，在饲料中大量使用抗生素的现象十分普遍，每年有750～1000吨的金霉素和5000～7000吨的土霉素用于动物饲料，在动物饲料中使用的抗生素已经囊括了人类自身使用的全部抗生物的种类。抗生素的发展在预防治疗畜禽疾病起到了不可磨灭的作用，但大面积地试用抗生素使得超级菌株不断出现，并且导致各种肉类及奶制品中的抗生素含量严重超标，人们不得不去寻求一种安全、高效的饲用抗生素替代品，这已成为本世纪畜牧工作者及医务人员面临的迫切问题。研究发现，溶菌酶制剂能有效防止球虫病，还能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌，使肠道内的胺、甲酚等有害物减少，增加机体抗病力，提高动物的生产性能。提供一种能高效提取蝇蛆体外分泌物的方法，以便充分利用蝇蛆资源是非常有必要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种蝇蛆体外分泌物的提取方法及其用途。本发明所采取的技术方案是：一种蝇蛆体外分泌物的提取方法，包括以下步骤：1)在蝇蛆培养基中加入菌悬液，蝇蛆培养至三龄后将蝇蛆与培养基分离；2)将蝇蛆饥饿处理后进行表面消毒，干燥处理后置于干燥的容器中，断水断食处理，定时加入缓冲液，将分泌物溶解，吸出提取物于4℃保存，并在液体吸出后对蝇蛆及容器进行干燥处理，使蝇蛆虫体表面及容器内保持干燥，将多次得到的分泌物合并后离心取上清，将上清液冷冻干燥即可得到蝇蛆分泌物；3)向培养基中加入缓冲液进行搅拌浸提，将浸提液离心取上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后离心取沉淀，将沉淀复溶，透析后得到分泌物提取液，将提取液冷冻干燥即可得到蝇蛆分泌物。进一步地，蝇蛆断水断食处理的时间为5～7h，加入缓冲液的频率为20～40min/次。进一步地，蝇蛆断水断食处理的时间为6h，加入缓冲液的频率为30min/次。进一步地，步骤2)中使用的缓冲液为50mm、ph为4～7的磷酸盐缓冲液，加入缓冲液的比例为每1kg蝇蛆加入25～150ml缓冲液。进一步地，步骤(2)中所述的每次加入的缓冲液为50mm、ph6.8的k2hpo4-kh2po4盐溶液，加入缓冲液的比例为每1kg蝇蛆加入50ml缓冲液。进一步地，步骤2)中离心温度为0～8℃，转速为10000～13000rpm，时间为10～30min。进一步地，步骤2)中离心温度为3～5℃，转速为11000～12000rpm，离心时间为10～15min。进一步地，步骤3)中使用的缓冲液为50mm、ph为4～7的磷酸盐缓冲液，加入缓冲液的比例为每1g培养基加入1～5ml缓冲液。进一步地，步骤3)中使用的缓冲液为50mm、ph为6.8的k2hpo4-kh2po4盐溶液，加入缓冲液的比例为每1g培养基加入3ml缓冲液。进一步地，步骤3)中浸提液离心温度为0～8℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为10～30min。进一步地，步骤3)中浸提液离心温度为3～5℃，离心转速为4000～4500rpm，离心时间为10～15min。进一步地，步骤3)中加入硫酸铵的终浓度为60％～80％，沉淀时间为8～15h，沉淀蛋白后离心温度为0～8℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为10～30min。进一步地，透析袋的截留分子量为3000～5000kd，透析温度为0～8℃。进一步地，冷冻干燥前先将上清于-80℃进行预冻30min以上，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的真空度为10～100pa，温度为-30℃～-70℃。一种动物饲料添加剂，其中本发明所述的提取方法提取的蝇蛆体外分泌物。本发明的有益效果是：(1)本发明的含有蝇蛆溶菌酶的体外分泌物的提取方法，提取工艺简单，价格低廉，提取得到的体外分泌物具有抗菌抗炎作用。利用活蛆进行体外分泌物的提取，不损耗蝇蛆，提取完成后的蝇蛆幼虫还可以继续进行后续培养或者利用到其它方面，利用蝇蛆养殖剩下的培养基进行含有溶菌酶体外活性物质的提取，其中含有的活性成分包括蝇蛆溶菌酶、抗菌肽及其它活性蛋白，同时还含有培养基中的其他营养成分，在具有抗菌消炎作用的同时还具有营养作用，很适合作为动物饲料添加剂。(2)本发明的含有蝇蛆溶菌酶的体外分泌物的提取方法，所用的提取液含有一定浓度的盐，能更好地溶解蝇蛆体外蛋白，同时具有弱酸性，能使蝇蛆活性蛋白稳定存在，采用缓冲盐配比，从而提取液的ph能控制在所需要的范围，使得提取物保持活性。附图说明图1为蝇蛆体外分泌物westernblot检测结果；图2为蝇蛆体外分泌物抑菌实验结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不局限于此。以下实施例中所述蝇蛆幼虫为环裂亚目各科下的蝇的幼虫,包括但不限于家蝇、大头金蝇、麻蝇、丝光绿蝇。向蝇蛆培养基中加入的菌悬液为含有细菌、真菌和霉菌中的至少一种，包括但不限于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的的混合菌悬液。实施例1(1)在蝇蛆养殖过程中向培养基中加入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液，加入量为3ml/kg，待蝇蛆养殖至三龄，将蝇蛆幼虫与培养基分离；(2)收集幼虫饥饿处理30min，待排出内容物后用75％酒精进行表面消毒，再用吹风机吹干表面残留酒精和水分后放置在洁净干燥的敞口容器中，让蝇蛆断水断食自由活动6h，每隔30min将分泌物用pbs缓冲液溶解吸出并用吹风机吹干虫体表面及容器内部，所使用的pbs缓冲液为50mm、ph6.8的pbs缓冲液，加入缓冲液的比例为每1kg蝇蛆加入50ml缓冲液，将多次得到的蝇蛆体外分泌物合并后在4℃中以12000rpm离心15min后取上清，上清液放入-80℃进行预冻30min，在真空度10pa下，-50℃冷冻干燥约12h，得到的固体粉末于-20℃保存；(3)收集培养基，向培养基中加入50mm、ph6.8的pbs缓冲溶进行搅拌浸提，加入缓冲液的比例为每1g培养基加入3ml缓冲液，将培养基浸提液在4℃中以4500rpm离心15min后取上清，加入硫酸铵使其质量分数达到80％，静置12h进行蛋白沉淀，后在4℃中以4500rpm离心15min，取沉淀，使用pbs缓冲液将沉淀复溶，然后装入截留分子量为3500kd的透析袋中透析5h，得到培养基提取液，提取液放入-80℃进行预冻30min，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的真空度为10pa，温度为-50℃，时间为12h，得到的固体粉末于-20℃保存。实施例2(1)在蝇蛆养殖过程中向培养基中加入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液，加入量为3ml/kg，待蝇蛆养殖至三龄，将蝇蛆幼虫与培养基分离；(2)收集幼虫饥饿处理30min，待排出内容物后用75％酒精进行表面消毒，再用吹风机吹干表面残留酒精和水分后放置在洁净干燥的敞口容器中，让蝇蛆断水断食自由活动5h，每隔40min将分泌物用pbs缓冲液溶解吸出并用吹风机吹干虫体表面及容器内部，所使用的pbs缓冲液为50mm、ph4的pbs缓冲液，加入缓冲液的比例为每1kg蝇蛆加入25ml缓冲液，将多次得到的蝇蛆体外分泌物合并后在0℃中以10000rpm离心30min后取上清，上清液放入-80℃进行预冻1min，在真空度50pa下，-30℃冷冻干燥约12h，得到的固体粉末于-20℃保存；(3)收集培养基，向培养基中加入50mm、ph4的pbs缓冲溶进行搅拌浸提，加入缓冲液的比例为每1g培养基加入1ml缓冲液，将培养基浸提液在0℃中以3000rpm离心30min后取上清，加入硫酸铵使其质量分数达到60％，静置8h进行蛋白沉淀，后在0℃中以3000rpm离心30min，取沉淀，使用pbs缓冲液将沉淀复溶，然后装入截留分子量为3000kd的透析袋中透析4h，得到培养基提取液，提取液放入-80℃进行预冻1h，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的真空度为50pa，温度为-30℃，时间为12h，得到的固体粉末于-20℃保存。实施例3(1)在蝇蛆养殖过程中向培养基中加入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液，加入量为3ml/kg，待蝇蛆养殖至三龄，将蝇蛆幼虫与培养基分离；(2)收集幼虫饥饿处理30min，待排出内容物后用75％酒精进行表面消毒，再用吹风机吹干表面残留酒精和水分后放置在洁净干燥的敞口容器中，让蝇蛆断水断食自由活动7h，每隔20min将分泌物用pbs缓冲液溶解吸出并用吹风机吹干虫体表面及容器内部，所使用的pbs缓冲液为50mm、ph7的pbs缓冲液，加入缓冲液的比例为每1kg蝇蛆加入150ml缓冲液，将多次得到的蝇蛆体外分泌物合并后在8℃中以13000rpm离心10min后取上清，上清液放入-80℃进行预冻1h，在真空度100pa下，-70℃冷冻干燥约12h，得到的固体粉末于-20℃保存；(3)收集培养基，向培养基中加入50mm、ph7的pbs缓冲溶进行搅拌浸提，加入缓冲液的比例为每1g培养基加入5ml缓冲液，将培养基浸提液在8℃中以5000rpm离心10min后取上清，加入硫酸铵使其质量分数达到80％，静置15h进行蛋白沉淀，后在8℃中以5000rpm离心10min，取沉淀，使用pbs缓冲液将沉淀复溶，然后装入截留分子量为5000kd的透析袋中透析6h，得到培养基提取液，提取液放入-80℃进行预冻2h，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的真空度为100pa，温度为-70℃，时间为12h，得到的固体粉末于-20℃保存。对比例(1)在蝇蛆养殖过程中向培养基中加入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液，加入量为3ml/kg，待蝇蛆养殖至三龄，将蝇蛆幼虫与培养基分离；(2)取三龄蝇蛆幼虫用蒸馏水清洁体表后，浸泡于适量无菌水中，放置6h，不时振荡，将浸液在4℃中以11000rpm离心10min后取上清，上清液放入-80℃进行预冻3h，在真空度100pa下，-70℃冷冻干燥约12h，得到的固体粉末于-20℃保存。溶菌酶定性检测采用westernblot技术对体外分泌物中的溶菌酶进行定性检测，将提取得到的蛋白进行sds-page电泳后转到0.45μmpvdf膜上，用5％脱脂奶粉封闭1.5h后用一抗(rabbits,anti-lysozyme,1：10000)4℃孵育过夜，取出膜用tbst洗，10min×3次，再用二抗(goat-anti-rabbit,1：5000)孵育1h后用tbst洗10min×3次；最后用ecl显影液进行显影观察，检测结果见图1。溶菌酶定量检测采用比浊法对体外分泌物中的溶菌酶含量进行测定，比浊法的具体实施步骤如下：1.标准曲线的制备配制系列浓度溶菌酶标准品溶液，0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml；配制溶壁微小球菌悬浮液，浓度为250μg/ml；取溶菌酶标准液20μl与200μl溶壁微小球菌悬浮液混匀，37℃孵育5min后测定吸光度，作出标准曲线；2.样品溶液的配制将实施例1、实施例2、实施例3中的虫体分泌物冻干粉和培养基提取物冻干粉分别配制成浓度为20mg/ml和25mg/ml的溶液，对比例中得到的冻干粉配制成浓度为20mg/ml的溶液；3.样品溶液的溶菌酶浓度测定测定时取20μl各样品溶液分别与200μl菌液混合，37℃孵育5min后测定吸光度，得到吸光值后代入标准曲线进行计算样品的溶菌酶浓度。经检测，实施例1～3以及对比例制得的样品中溶菌酶的浓度如下表：实施例1实施例2实施例3对比例体外分泌物8.64±0.25μg/ml8.31±0.13μg/ml7.92±0.37μg/ml5.57±0.42μg/ml培养基提取物15.54±0.19μg/ml14.96±0.28μg/ml15.22±0.21ug/ml根据结果可知，本发明范围中各制备条件下得到的样品，溶菌酶含量差异不明显，但是相对于传统的将蝇蛆放于无菌水中浸泡条件下制备得到的样品的溶菌酶而言有明显那提高。抗炎活性实验抗炎活性实验使用的是实施例1中的体外分泌物和培养基提取物。实验方法mtt毒性实验：复苏冻存的raw264.7细胞，隔天进行传代，当传至第五代的时候按照5000个细胞/孔种板，放入培养箱中培养24h后进行给药，给药完成后放入培养箱中培养24h，避光加入浓度为5mg/ml的mtt试剂(amresco,usa)，20μl/孔，继续培养4h，然后用注射器吸干各孔中的液体后按照100μl/孔加入dmso溶剂，将96孔板放于摇床上5min使沉积于底部的紫色晶体完全溶解，最后用酶标仪测定540nm处的od值。抗炎实验：将raw264.7细胞按照5.5万个/孔种板，放入培养箱中培养24h后进行分组，分为空白组、模型组和给药组，进行相对应的给药操作后继续培养24h后用一氧化氮试剂盒检测，即取出细胞培养上清液50μl放于另一块新的96孔板中，依次加入griess试剂i和试剂ii，排除气泡后用酶标仪测定在490nm处的od值。实验结果当体外分泌物的浓度为20mg/ml时，细胞水平的炎症抑制率为27.9±2.9％；当培养基提取物的浓度为25mg/ml时，细胞水平的炎症抑制率为22.4±3.1％。抑菌实验实验方法培养基配制肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水到1000ml，调ph在7.2-7.5，分装于三角瓶中，100ml/瓶，灭菌处理后冷却密封保存待用。营养琼脂固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉33g，加蒸馏水到1000ml，调ph在7.2～7.5，分装于三角瓶中，121℃高压灭菌30min,待液体冷却至60℃左右时将液体分装到灭菌处理过的15×60mm的平皿中，自然冷却凝固后密封保存待用。菌种活化取出冻存于甘油中的菌种(大肠杆菌)10μl加入到肉汤培养基中，37℃恒温摇床上以160rpm速度震荡培养，溶液逐渐呈现混浊状态，约24h后，停止培养，此时的菌悬液作为活化好的菌种液。纸片法抑菌实验将活化好的菌种稀释至相当于0.5麦氏比浊管浓度，取稀释后的菌悬液200μl接种到营养琼脂固体培养基中并涂布均匀，后将浸没在药液中的灭菌纸片取出贴于固体培养基中，放入37℃智能霉菌培养箱中培养24h以上。实验结果实验结果见图2，培养基提取物和体外分泌物在培养48h出现明显的抑菌圈，说明体外分泌物和培养基提取物对于大肠杆菌有明显的抑菌效果。当前第1页12