本发明属于微生物领域，具体涉及一种拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂的应用。
背景技术：
对虾养殖业已经形成完整的产业体系，随着养殖密度和规模不断扩大，各种疾病频繁发生，由弧菌属引起的细菌性疾病，传播快、传染率高，给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，目前已严重制约了我国乃至全世界对虾养殖的发展。养殖者通常大量使用抗生素药物，虽然短期内取得了成效，但随之导致病原微生物耐药性增强、微生物群落多样性下降、药物残留、养殖环境恶化等问题。研究开发安全高效对虾病害生态防治及养殖技术显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂的应用。本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂能拮抗致病弧菌，提高对虾养殖成活率和效益，解决当前对虾养殖所面临的病害高发、成活率低等问题，满足对虾养殖可持续发展的迫切需要，促进对虾养殖业的健康可持续发展。
本发明通过实验发现，添加拮抗弧菌的微生物制剂(凝结芽孢杆菌液体菌剂、植物乳杆菌液体菌剂、酿酒酵母液体菌剂、本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂)可提高对虾成活率和非特异性免疫性，有效抑制对虾肠道内弧菌数量，且本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂其效果优于单一菌剂效果。
因此，本发明提供拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂作为饲料添加剂的应用，所述的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂是通过以下方法制备的：将凝结芽孢杆菌液体菌剂、植物乳杆菌液体菌剂和酿酒酵母液体菌剂按体积比为4-6:2-3:1-3混合，得到拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂；所述的凝结芽孢杆菌液体菌剂的活菌数≥1.0×109cfu/ml，所述的植物乳杆菌液体菌剂的活菌数≥1.0×109cfu/ml，所述的酿酒酵母液体菌剂的活菌数≥5.0×109cfu/ml。
所述的饲料添加剂优选为提高对虾成活率和非特异性免疫性、有效抑制对虾肠道内弧菌数量的饲料添加剂。
优选，所述的凝结芽孢杆菌液体菌剂是通过以下方法制备的：
(1)将凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)gim1.646活化后转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃培养16-20h，形成摇瓶液体菌种；
(2)将摇瓶液体菌种以3％-5％的接种量转接到含有一级发酵培养基的种子罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率200-300rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度不低于40％，发酵时间为16-20h，制成一级种子液；
(3)将一级种子液以2％-4％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率150-200rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度不低于40％，发酵时间36-48h，当芽孢率大于80％时结束发酵，由此制备得到凝结芽孢杆菌液体菌剂；
所述的一级发酵培养基为：每升含有葡萄糖5g、酵母粉3g、蛋白胨5g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.3g、牛肉膏3g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；
所述的二级发酵培养基为：每升含有玉米淀粉10g、葡萄糖5g、豆粕粉15g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁2g、硫酸锰0.5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2。
优选，所述的植物乳杆菌液体菌剂是通过以下方法制备的：
(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)gim1.140活化后转接到mrs液体培养基中，37℃静置培养20-30h，形成三角瓶液体菌种；
(2)将三角瓶液体菌种以3％-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的种子罐中，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为16-20h，制成一级种子液；
(3)将一级种子液以8％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，结束发酵，由此制备得到植物乳杆菌液体菌剂；
所述的一级发酵培养基为：每升含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；
所述的二级发酵培养基为：每升含有糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g和氯化钠5g，余量为水，ph6.8。
优选，所述的酿酒酵母液体菌剂是通过以下方法制备的：
(1)将酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gim2.198活化后转接到yepd液体培养基中，28℃培养16-24h，形成摇瓶液体菌种；
(2)将摇瓶液体菌种以3％-5％的接种量转接到含有一级发酵培养基的种子罐中，发酵温度28±1℃，搅拌速率200-240rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度不低于40％，发酵时间为16-20h，制成一级种子液；
(3)将一级种子液以3％-5％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度28±1℃，搅拌速率180-240rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度不低于40％，发酵时间24-28h，得到酿酒酵母液体菌剂；
所述的一级发酵培养基为：每升含有葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨15g、尿素5g、磷酸氢二钾5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；
所述的二级发酵培养基为：每升含有糖蜜20g、蔗糖10g、豆粕粉20g、酵母粉5g、磷酸氢二钾5g、氯化铵5g、半胱氨酸盐酸盐1g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然。
所述的饲料优选为对虾基础饲料。
本发明提出的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂，其包含植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母，在对虾肠道内定植，有利于调控微生物的生物种类和数量，拮抗致病弧菌，还能提高饲料消化利用率，提高对虾非特性免疫力，解决当前对虾养殖所面临的对虾弧菌病频发、养殖成活率低、养殖效益低等问题，满足对虾养殖可持续发展的迫切需要。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明发现，将植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母复合使用，比单一菌剂效果要好，因植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母发挥不同功效，起到了协同增效作用；
(2)相比使用抗生素等传统方法，使用拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂可降低对虾弧菌发病率、减少对虾及水体药物残留，改善对虾肠道微生物群落结构及水体养殖环境，从而提高对虾免疫力、减少病害发生，还能提高饲料转化效率和生长速度；
(3)本发明拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂属于绿色环保动物饲料添加剂。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。
实施例1：
一拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，取筛选的有拮抗弧菌功能的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)gim1.646(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.646，该菌种对外销售)菌种，划线接种到牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面，37℃培养24小时；然后转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃振荡培养16h，形成摇瓶液体菌种。牛肉膏蛋白胨液体培养基为：在1l的体系里面含有牛肉膏3g、蛋白胨10g和氯化钠5g，余量为水，ph7.0±0.2；若为固体培养基每升培养基再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，121℃灭菌20min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以3％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度70％～80％，发酵时间为16个小时，制成一级种子液。一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖5g、酵母粉3g、蛋白胨5g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.3g、牛肉膏3g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以2％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度70％～80％，发酵时间36h，使用显微镜观察芽孢生成情况，芽孢率大于80％时即可以结束发酵。由此制备得到拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂(活菌数6.8×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有玉米淀粉10g、葡萄糖5g、豆粕粉15g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁2g、硫酸锰0.5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
二拮抗弧菌的植物乳杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)gim1.140(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.140，该菌种对外销售)，划线接种到mrs琼脂试管斜面，37℃培养24小时；然后转接到mrs液体培养基中，37℃静置培养20h，形成三角瓶液体菌种。mrs液体培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；若为固体培养基每升培养基中再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将三角瓶液体菌种以3％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为16个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以8％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间24h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到植物乳杆菌液体菌剂(活菌数3.2×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g和氯化钠5g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
三拮抗弧菌的酿酒酵母液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gim2.198(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim2.198，该菌种对外销售)，划线接种到麦芽汁琼脂试管斜面，28℃培养20小时；然后转接到yepd液体培养基中，28℃振荡培养16h，形成摇瓶液体菌种；麦芽汁琼脂培养基为：在1l的体系里面含有麦芽膏粉130g、琼脂15g和氯霉素0.1g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。yepd液体培养基为：在1l的体系里面含有酵母粉10g、蛋白胨20g和葡萄糖20g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以3％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为70％，发酵温度28±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度70％～80％，发酵时间为16个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨15g、尿素5g、磷酸氢二钾5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以3％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70％，发酵温度28±1℃，搅拌速率180rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度70％-80％，发酵时间24h，即可以结束发酵，得到酿酒酵母液体菌剂(活菌数9.7×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、蔗糖10g、豆粕粉20g、酵母粉5g、磷酸氢二钾5g、氯化铵5g、半胱氨酸盐酸盐1g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
实施例2：
一拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，取筛选的有拮抗弧菌功能的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)gim1.646(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.646，该菌种对外销售)菌种，划线接种到牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面，37℃培养24小时；然后转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃振荡培养18h，形成摇瓶液体菌种。牛肉膏蛋白胨液体培养基为：在1l的体系里面含有牛肉膏3g、蛋白胨10g和氯化钠5g，余量为水，ph7.0±0.2；若为固体培养基每升培养基再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，121℃灭菌20min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以4％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为75％，发酵温度37±1℃，搅拌速率280rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度40％～50％，发酵时间为18个小时，制成一级种子液。一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖5g、酵母粉3g、蛋白胨5g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.3g、牛肉膏3g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以3％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为75％，发酵温度37±1℃，搅拌速率180rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度40％～50％，发酵时间40h，使用显微镜观察芽孢生成情况，芽孢率大于80％时即可以结束发酵。由此制备得到拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂(活菌数7.2×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有玉米淀粉10g、葡萄糖5g、豆粕粉15g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁2g、硫酸锰0.5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
二拮抗弧菌的植物乳杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)gim1.140(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.140，该菌种对外销售)，划线接种到mrs琼脂试管斜面，37℃培养26小时；然后转接到mrs液体培养基中，37℃静置培养25h，形成三角瓶液体菌种。mrs液体培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；若为固体培养基每升培养基中再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将三角瓶液体菌种以5％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为75％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为18个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以8％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为75％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间24h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到植物乳杆菌液体菌剂(活菌数3.8×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g和氯化钠5g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
三拮抗弧菌的酿酒酵母液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gim2.198(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim2.198，该菌种对外销售)，划线接种到麦芽汁琼脂试管斜面，28℃培养23小时；然后转接到yepd液体培养基中，28℃振荡培养20h，形成摇瓶液体菌种；麦芽汁琼脂培养基为：在1l的体系里面含有麦芽膏粉130g、琼脂15g和氯霉素0.1g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。yepd液体培养基为：在1l的体系里面含有酵母粉10g、蛋白胨20g和葡萄糖20g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以4％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为75％，发酵温度28±1℃，搅拌速率220rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度40％～50％，发酵时间为18个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨15g、尿素5g、磷酸氢二钾5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以4％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为75％，发酵温度28±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度40％-50％，发酵时间25h，即可以结束发酵，得到酿酒酵母液体菌剂(活菌数9.2×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、蔗糖10g、豆粕粉20g、酵母粉5g、磷酸氢二钾5g、氯化铵5g、半胱氨酸盐酸盐1g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
实施例3：
一拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，取筛选的有拮抗弧菌功能的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)gim1.646(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.646，该菌种对外销售)菌种，划线接种到牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面，37℃培养24小时；然后转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃振荡培养20h，形成摇瓶液体菌种。牛肉膏蛋白胨液体培养基为：在1l的体系里面含有牛肉膏3g、蛋白胨10g和氯化钠5g，余量为水，ph7.0±0.2；若为固体培养基每升培养基再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，121℃灭菌20min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以5％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，搅拌速率300rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度60％～70％，发酵时间为20个小时，制成一级种子液。一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖5g、酵母粉3g、蛋白胨5g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.3g、牛肉膏3g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以4％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，搅拌速率150rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度60％-70％，发酵时间48h，使用显微镜观察芽孢生成情况，芽孢率大于80％时即可以结束发酵。由此制备得到拮抗弧菌的凝结芽孢杆菌液体菌剂(活菌数7.5×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有玉米淀粉10g、葡萄糖5g、豆粕粉15g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁2g、硫酸锰0.5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph7.0±0.2；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
二拮抗弧菌的植物乳杆菌液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)gim1.140(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim1.140，该菌种对外销售)，划线接种到mrs琼脂试管斜面，37℃培养28小时；然后转接到mrs液体培养基中，37℃静置培养30h，形成三角瓶液体菌种。mrs液体培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；若为固体培养基每升培养基中再加入15-20g琼脂；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将三角瓶液体菌种以6％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为20个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以8％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间24h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到植物乳杆菌液体菌剂(活菌数3.5×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g和氯化钠5g，余量为水，ph6.8；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，再调ph值，115℃灭菌30min。
三拮抗弧菌的酿酒酵母液体菌剂的制备方法
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gim2.198(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：gim2.198，该菌种对外销售)，划线接种到麦芽汁琼脂试管斜面，28℃培养24小时；然后转接到yepd液体培养基中，28℃振荡培养24h，形成摇瓶液体菌种；麦芽汁琼脂培养基为：在1l的体系里面含有麦芽膏粉130g、琼脂15g和氯霉素0.1g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。yepd液体培养基为：在1l的体系里面含有酵母粉10g、蛋白胨20g和葡萄糖20g，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2扩大培养
2.1一级扩大培养
将摇瓶液体菌种以5％(体积比)的接种量转接到装有一级发酵培养基的30l种子罐中，种子罐装液量为80％，发酵温度28±1℃，搅拌速率240rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度60％-70％，发酵时间为20个小时，制成一级种子液；一级发酵培养基为：在1l的体系里面含有葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨15g、尿素5g、磷酸氢二钾5g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
2.2二级扩大培养
将一级种子液以5％(体积比)的接种量转接到装有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为80％，发酵温度28±1℃，搅拌速率240rpm，通气量0.8-0.9v/v·min，溶氧浓度60％-70％，发酵时间28h，即可以结束发酵，得到酿酒酵母液体菌剂(活菌数9.6×109cfu/ml)。二级发酵培养基为：在1l的体系里面含有糖蜜20g、蔗糖10g、豆粕粉20g、酵母粉5g、磷酸氢二钾5g、氯化铵5g、半胱氨酸盐酸盐1g和泡敌0.3ml，余量为水，ph自然；配制方法是将所有成分按其含量混合均匀，115℃灭菌30min。
实施例4：
拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂制备方法如下：
将实施例1制备的凝结芽孢杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、1.8×109cfu/ml两个活菌数的凝结芽孢杆菌液体菌剂；将实施例1制备的植物乳杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、1.8×109cfu/ml两个活菌数的植物乳杆菌液体菌剂；将实施例1制备的酿酒酵母液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.8×109cfu/ml、5.0×109cfu/ml两个活菌数的酿酒酵母液体菌剂。
将600ml活菌数为1.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、200ml活菌数为1.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和200ml活菌数为5.0×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂混合均匀，即制得拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂，其总活菌数为1.8×109cfu/ml。
分别以1.8×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、1.8×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和1.8×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂作为对照。
养殖试验：
分别将上述制备的1.8×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂(ⅰ)、1.8×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂(ⅱ)和1.8×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂(ⅲ)及本实施例制备的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂按对虾基础饲料重量的0.1％均匀喷涂在对虾基础饲料(对虾基础饲料购自：江门市新会区大华饲料有限公司，产品名称：对虾配合饲料)上风干投喂，实验在容积为1m3的封闭养殖系统内进行，各组实验条件一致。
经56d养殖试验，结果显示：与ctr0相比，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ投喂添加微生物制剂的试验组对虾的成活率分别比ctr0提高了21.23％、23.34％、19.73％和32.81％，特定生长率分别比ctr0提高了12.33％、13.46％、9.92％和22.75％，血清溶菌酶活力分别比ctr0提高了13.48％、12.66％、8.76％和29.87％，血清超氧化物歧化酶活力分别比ctr0提高了7.33％、9.49％、8.92％和21.33％，肠道可培养弧菌数ctr0、试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分别为：3.9×106cfu/g、2.8×104cfu/g、3.4×104cfu/g、5.2×105cfu/g、1.1×103cfu/g。结果表明：添加拮抗弧菌的微生物制剂可提高对虾成活率和非特异性免疫性，有效抑制对虾肠道内弧菌数量，且本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂其效果优于单一菌剂效果。
实施例5：
拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂制备方法如下：
将实施例1制备的凝结芽孢杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、2.2×109cfu/ml两个活菌数的凝结芽孢杆菌液体菌剂；将实施例1制备的植物乳杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、2.2×109cfu/ml两个活菌数的植物乳杆菌液体菌剂；将实施例1制备的酿酒酵母液体菌剂用无菌生理盐水稀释成2.2×109cfu/ml、5.0×109cfu/ml两个活菌数的酿酒酵母液体菌剂。
将400ml活菌数为1.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、300ml活菌数为1.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和300ml活菌数为5.0×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂混合均匀，即制得拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂，其总活菌数为2.2×109cfu/ml。
分别以2.2×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、2.2×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和2.2×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂作为对照。
养殖试验：
分别将上述制备的2.2×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、2.2×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和2.2×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂及本实施例制备的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂按对虾基础饲料重量的0.1％均匀喷涂在对虾基础饲料(对虾基础饲料购自：江门市新会区大华饲料有限公司，产品名称：对虾配合饲料)上风干投喂，实验在容积为1m3的封闭养殖系统内进行，各组实验条件一致。
经56d养殖试验，结果显示：与ctr0相比，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ投喂添加微生物制剂的试验组对虾的成活率分别比ctr0提高了24.32％、19.56％、21.89％和42.66％，特定生长率分别比ctr0提高了10.98％、9.85％、11.33％和28.22％，血清溶菌酶活力分别比ctr0提高了9.78％、11.77％、13.67％和32.44％，血清超氧化物歧化酶活力分别比ctr0提高了8.45％、10.99％、13.69％和19.98％，肠道可培养弧菌数ctr0、试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分别为：4.5×106cfu/g、3.2×104cfu/g、2.1×104cfu/g、2.7×105cfu/g、4.1×103cfu/g。结果表明：添加拮抗弧菌的微生物制剂可提高对虾成活率和非特异性免疫性，有效抑制对虾肠道内弧菌数量，且本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂其效果优于单一菌剂效果。
实施例6：
拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂制备方法如下：
将实施例1制备的凝结芽孢杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、1.4×109cfu/ml两个活菌数的凝结芽孢杆菌液体菌剂；将实施例1制备的植物乳杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.0×109cfu/ml、1.4×109cfu/ml两个活菌数的植物乳杆菌液体菌剂；将实施例1制备的酿酒酵母液体菌剂用无菌生理盐水稀释成1.4×109cfu/ml、5.0×109cfu/ml两个活菌数的酿酒酵母液体菌剂。
将600ml活菌数为1.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、300ml活菌数为1.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和100ml活菌数为5.0×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂混合均匀，即制得拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂，其总活菌数为1.4×109cfu/ml。
分别以1.4×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、1.4×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和1.4×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂作为对照。
养殖试验：
分别将上述制备的1.4×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、1.4×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和1.4×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂及本实施例制备的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂按对虾基础饲料重量的0.1％均匀喷涂在对虾基础饲料(对虾基础饲料购自：江门市新会区大华饲料有限公司，产品名称：对虾配合饲料)上风干投喂，实验在容积为1m3的封闭养殖系统内进行，各组实验条件一致。
经56d养殖试验，结果显示：与ctr0相比，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ投喂添加微生物制剂的试验组对虾的成活率分别比ctr0提高了19.91％、17.34％、19.55％和30.98％，特定生长率分别比ctr0提高了12.78％、10.87％、8.98％和19.15％，血清溶菌酶活力分别比ctr0提高了14.22％、15.32％、9.89％和23.66％，血清超氧化物歧化酶活力分别比ctr0提高了12.67％、13.98％、11.22％和22.56％，肠道可培养弧菌数ctr0、试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分别为：6.8×106cfu/g、3.9×104cfu/g、4.8×104cfu/g、7.2×105cfu/g、2.3×103cfu/g。结果表明：添加拮抗弧菌的微生物制剂可提高对虾成活率和非特异性免疫性，有效抑制对虾肠道内弧菌数量，且本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂其效果优于单一菌剂效果。
实施例7：
拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂制备方法如下：
将实施例1制备的凝结芽孢杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成活菌数为3.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂；将实施例1制备的植物乳杆菌液体菌剂用无菌生理盐水稀释成2.0×109cfu/ml、3.0×109cfu/ml两个活菌数的植物乳杆菌液体菌剂；将实施例1制备的酿酒酵母液体菌剂用无菌生理盐水稀释成3.0×109cfu/ml、6.0×109cfu/ml两个活菌数的酿酒酵母液体菌剂。
将600ml活菌数为3.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、300ml活菌数为2.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和100ml活菌数为6.0×109cfu/ml的酿酒酵母液体菌剂混合均匀，即制得拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂，其总活菌数为3.0×109cfu/ml。
分别以3.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、3.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和3.0×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂作为对照。
分别将上述制备的3.0×109cfu/ml的凝结芽孢杆菌液体菌剂、3.0×109cfu/ml的植物乳杆菌液体菌剂和3.0×109cfu/ml酿酒酵母液体菌剂及本实施例制备的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂按对虾基础饲料重量的0.1％均匀喷涂在对虾基础饲料(对虾基础饲料购自：江门市新会区大华饲料有限公司，产品名称：对虾配合饲料)上风干投喂，实验在容积为1m3的封闭养殖系统内进行，各组实验条件一致。
结果表明：添加拮抗弧菌的微生物制剂(凝结芽孢杆菌液体菌剂、植物乳杆菌液体菌剂和酿酒酵母液体菌剂及本实施例制备的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂)可提高对虾成活率和非特异性免疫性，有效抑制对虾肠道内弧菌数量，且本发明的拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂其效果优于单一菌剂效果。