一种海参胶原纤维的提取方法与流程

本发明涉及胶原纤维提取技术领域，更具体地说，涉及一种海参胶原纤维的提取方法。

背景技术：

海参，属于棘皮动物门、海参纲，具有高蛋白、低脂肪、不含胆固醇的特点，且近年来产量逐渐增多，营养和经济价值极高。海参体壁是海参的主要可食部位，属于可变胶原组织，含有胶原、蛋白聚糖和糖蛋白等基本结构单元，主要由胶原纤维和微纤维等超分子结构相互缠绕，形成网络状结构。海参胶原纤维呈网络状，提取困难，现有方法提取得到的胶原纤维结构不完整且含有其他杂质、不是单纯的胶原纤维。充分利用海参胶原纤维开发高附加值海参产品，是今后海参高值化利用的一个方向。

技术实现要素：

本发明旨在从新鲜海参体壁中提取胶原纤维，同时保证提取的胶原纤维具有完整的超分子层级结构。

为了达到上述目的，本发明提供一种海参胶原纤维的提取方法，包括如下步骤：

s1：海参预处理：将海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，所得海参体壁洗净，切块，置于0～4℃备用；

s2：一次水洗：将步骤s1所得体壁小块加入0～4℃的水，在0～4℃条件下制备成海参浆；将所得海参浆在0～4℃进行搅拌，取沉淀；

s3：二次水洗：将步骤s2所得沉淀加入0～4℃的水，在0～4℃条件下搅拌，取沉淀；

s4：缓冲液洗：将步骤s3所得沉淀加入0.2～0.5mol/l、ph7～8的磷酸盐缓冲液，0～4℃条件下搅拌，取沉淀；

s5：酸洗：将步骤s4所得沉淀加入0.2～0.8mol/l的冰乙酸溶液，0～4℃搅拌，取沉淀；

s6：三次水洗：在0～4℃条件下将步骤s5所得沉淀洗至中性，收集沉淀，即为海参胶原纤维。

优选方式下，所述海参胶原纤维的提取方法，包括如下步骤：

s1、海参预处理：将新鲜海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，所得海参体壁清洗干净，切成4～9cm³小块，置于0～4℃备用；

s2、一次水洗：取步骤s1得到的海参体壁小块，加入2～10倍重量0～4℃的水，18000～23000转/min、4～10s/次×3次打成浆；所得海参浆在0～4℃下搅拌1～3h，10000～15000×g离心5～20min，取沉淀；

s3、二次水洗：向步骤s2得到的沉淀中，加入2～10倍重量0～4℃的水，0～4℃下搅拌1～3h，10000～15000×g离心5～20min，收集沉淀；以上s2、s3两个步骤的目的是初步除去海参体壁中水可溶性杂质，如部分色素、蛋白、多糖等；

s4、缓冲液洗：向步骤s3得到的沉淀中，加入2～10倍重量的磷酸盐缓冲液，0～4℃下搅拌8～24h，10000～15000×g离心5～20min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是进一步除去不溶于水但溶于磷酸盐缓冲液的物质，如部分蛋白等；

所述磷酸盐缓冲液浓度为0.2～0.5mol/l,ph7～8；

s5、酸洗：向步骤s4收集得到的沉淀中加入2～10倍重量的冰乙酸溶液，0～4℃下搅拌48～96h，10000～15000×g离心5～20min，收集沉淀；本步的目的是使海参体壁中的内源酶失去活性，避免降解胶原纤维，破坏其结构的完整性；

所述冰乙酸溶液浓度为0.2～0.8mol/l；

s6、三次水洗：采用0～4℃水将步骤s6收集得到的沉淀洗涤至中性，再加入2～10倍重量0～4℃水，0～4℃下搅拌1～3h，10000～15000×g离心5～20min，收集沉淀，即为海参胶原纤维。

最优方式下，所述海参胶原纤维的提取方法，包括如下步骤：

s1、新鲜海参预处理：将新鲜海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，清洗干净，切成约6cm³小块，置于3℃备用；

s2、一次水洗：取步骤s1得到的海参体壁小块，加入6倍重量3℃水，20000转/min、8s/次×3次、每次间隔30s制备成海参浆3℃下将所得海参浆搅拌2h，12800×g离心12min，收集沉淀；

s3、二次水洗：向步骤s2得到的沉淀中，加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，收集沉淀；以上s2、s3两个步骤的目的是初步除去海参体壁中水可溶性杂质；

s4、缓冲液洗：向步骤s3得到的沉淀中，加入6倍重量0.3mol/l、ph7.5的磷酸盐缓冲液，3℃下搅拌16h，12800×g离心12min，收集沉淀；本步的目的是进一步除去不溶于水但溶于磷酸盐缓冲液的物质；

s5、酸洗：向步骤s4收集得到的沉淀中加入6倍重量的0.5mol/l的冰乙酸溶液，3℃下搅拌72h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是使海参体壁中的内源酶失去活性，避免降解胶原纤维，破坏其结构的完整性；

s6、三次水洗：采用3℃水将步骤s5收集得到的沉淀洗涤至中性，具体操作为：向步骤s5收集到的沉淀中加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，保留沉淀；重复进行，直至所述沉淀洗涤至中性；再加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀，即为海参胶原纤维。

本发明的有益效果是：

1、本发明提取原料为新鲜海参体壁，保证了海参体壁中各结构的原状；经一系列除杂、提取后，得到了超分子结构完整的海参胶原纤维；而目前的现有技术提取得到的胶原纤维超分子结构不完整且含有其他结构的混合物。本发明提取的胶原纤维结构如图1～4所示，绳状纤维结构排列整齐，直径均匀，约2.27μm(n＝20)，表面较光洁，具有明显的周期性横纹结构。

2、本发明全程操作控制在低温条件下，各操作步骤均采用0～4℃去离子水或溶液，尽可能避免海参胶原纤维的降解破坏，最大程度上保持海参胶原纤维结构的完整性。

3、本发明涉及的操作步骤简单，不需要繁琐的过程及复杂的仪器设备，获得的海参胶原纤维在扫描电镜下具有清晰、完整的超分子层级结构。

4、本发明中，海参浆的提取方法、水洗次数及时间、缓冲液的选取、酸洗时使用的有机酸种类及时间、各步骤的组合顺序均会影响所得胶原纤维的完整性及纯度。经过多次反复实验证实，使用本发明的方法将海参制备成浆，水洗2次，再进行磷酸盐缓冲液洗、冰乙酸洗、再水洗至中性这一步骤顺序效果最好，得到的海参胶原纤维结构完整性好，杂质少，且用时较短。

5、通过本发明方法对海参体壁的主要结构单元--胶原纤维进行提取，可以实现加工过程中对海参品质变化进行监控；还可以利用海参胶原纤维开发高附加值海参产品。

附图说明

图1为本发明提取的海参胶原纤维扫描电镜图，放大2000倍；

图2为本发明实施例1提取的海参胶原纤维扫描电镜图，放大10000倍；

图3为本发明实施例2提取的海参胶原纤维扫描电镜图，放大10000倍；

图4为本发明实施例3提取的海参胶原纤维扫描电镜图，放大10000倍；

具体实施方式

下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所使用的材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例，如无特殊说明，均在0～4℃条件下进行。

实施例1：

s1、新鲜海参预处理：将新鲜海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，清洗干净，将所得体壁切成约4cm³小块，置于0℃备用；

s2、一次水洗：取步骤s1得到的海参体壁小块，加入2倍重量0℃水，使用打浆机18000转/min、4s/次×3次、每次间隔30s制备成海参浆；将所得海参浆在0℃下搅拌1h，10000×g离心5min，取沉淀；

s3、二次水洗：向步骤s2得到的沉淀中，加入2倍重量0℃水，0℃下搅拌1h，10000×g离心5min，弃取沉淀；以上s2、s3两个步骤的目的是初步除去海参体壁中水可溶性杂质；

s4、缓冲液洗：向步骤s3得到的沉淀中，加入2倍重量磷酸盐缓冲液，0℃下搅拌8h，10000×g离心5min，取沉淀；本步的目的是进一步除去不溶于水但溶于磷酸盐缓冲液的物质；

所述磷酸盐缓冲液浓度为0.2mol/l,ph7；

s5、酸洗：向步骤s4收集得到的沉淀中加入2倍重量的冰乙酸溶液，0℃下搅拌48h，10000×g离心5min，取沉淀；本步的目的是使海参体壁中的内源酶失去活性，避免降解胶原纤维，破坏其结构的完整性；

所述冰乙酸溶液浓度为0.2mol/l；

s6、三次水洗：采用0℃水将步骤s5收集得到的沉淀洗涤至中性，具体操作为：向步骤s5收集到的沉淀中加入2倍重量0℃水，0℃下搅拌1h，10000×g离心5min，取沉淀；重复进行，直至所述沉淀洗涤至中性。再加入2倍重量0℃水，0℃下搅拌1h，10000×g离心5min，弃去上清液，取沉淀，即为海参胶原纤维。

海参胶原纤维提取率达34.79±1.52％，采用扫描电镜对其结构进行观察，如图2所示，其超分子结构完整。提取率计算方法为：得到的海参胶原纤维重量(g)/用于打浆的海参体壁小块总重量(g)*100％，n＝3。

实施例2：

s1、新鲜海参预处理：将新鲜海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，清洗干净，所得海参体壁切成约9cm³小块，置于4℃备用；

s2、一次水洗：取步骤s1得到的海参体壁小块，加入10倍重量4℃水，使用匀浆机23000转/min、10s/次×3次、每次间隔30s制备成海参浆；将所得海参浆在4℃下搅拌3h，15000×g离心20min，弃去上清液，得到沉淀；

s3、二次水洗：向步骤s2得到的沉淀中，加入10倍重量4℃水，4℃下搅拌3h，15000×g离心20min，弃去上清液，收集沉淀；以上s2、s3两个步骤的目的是初步除去海参体壁中水可溶性杂质；

s4、缓冲液洗：向步骤s3得到的沉淀中，加入10倍重量的磷酸盐缓冲液，4℃下搅拌24h，15000×g离心20min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是进一步除去不溶于水但溶于磷酸盐缓冲液的物质；

所述磷酸盐缓冲液浓度为0.8mol/l,ph8；

s5、向步骤s4收集得到的沉淀中加入10倍重量的冰乙酸溶液，4℃下搅拌96h，15000×g离心20min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是使海参体壁中的内源酶失去活性，避免降解胶原纤维，破坏其结构的完整性；

所述冰乙酸溶液浓度为0.8mol/l；

s6、采用4℃水将步骤s5收集得到的沉淀洗涤至中性，具体操作为：向步骤s5收集到的沉淀中加入10倍重量4℃水，4℃下搅拌3h，15000×g离心20min，弃去上清液，保留沉淀；重复进行，直至所述沉淀洗涤至中性；再加入10倍重量4℃水，4℃下搅拌3h，15000×g离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即为海参胶原纤维。

海参胶原纤维提取率达32.64±1.13％，采用扫描电镜对其结构进行观察，如图3所示，其超分子结构完整。

实施例3：

s1、新鲜海参预处理：将新鲜海参去除肛门、口、触手、内脏和收缩肌，清洗干净，切成约6cm³小块，置于3℃备用；

s2、一次水洗：取步骤s1得到的海参体壁小块，加入6倍重量3℃水，20000转/min，8s/次×3次，每次间隔30s制备成海参浆；所得海参浆在3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，得到沉淀；

s3、二次水洗：向步骤s2得到的沉淀中，加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀；以上s2、s3两个步骤的目的是初步除去海参体壁中水可溶性杂质；

s4、缓冲液洗：向步骤s3得到的沉淀中，加入6倍重量磷酸盐缓冲液，3℃下搅拌16h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是进一步除去不溶于水但溶于磷酸盐缓冲液的物质；

所述磷酸盐缓冲液浓度为0.3mol/l，ph7.5；

s5、酸洗：向步骤s4收集得到的沉淀中加入6倍重量的冰乙酸溶液，3℃下搅拌72h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀；本步的目的是使海参体壁中的内源酶失去活性，避免降解胶原纤维，破坏其结构的完整性；

所述冰乙酸溶液浓度为0.5mol/l；

s6、采用3℃水将步骤s5收集得到的沉淀洗涤至中性，具体操作为：向步骤s5收集到的沉淀中加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，保留沉淀；重复进行，直至所述沉淀洗涤至中性。再加入6倍重量3℃水，3℃下搅拌2h，12800×g离心12min，弃去上清液，收集沉淀，即为海参胶原纤维。

海参胶原纤维提取率达36.73±0.94％，采用扫描电镜对其结构进行观察，如图4所示，其超分子结构完整。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。