本发明涉及一种利用微生物固态发酵技术以虾头为原料制备含有甲壳寡糖饲料的技术领域。
背景技术
甲壳寡糖是由2～10个乙酰氨基葡萄糖连接而成的线性低聚糖，通常是由甲壳素经降解处理后形成的水溶性寡糖。甲壳寡糖具有抗氧化、促生长、提高免疫力、调节肠道健康等生物学功能，且具有纯天然、可降解、生物安全性高等特点。因此，甲壳寡糖可以作为一种新型的绿色饲料添加剂，具有提高动物抗病能力、促进生长、改善肉质等作用，应用前景广阔，可部分替代传统化学药物及抗生素等的使用，推动养殖产业可持续、健康发展。
目前制备甲壳寡糖的方法主要有化学法、物理法、酶法。化学法主要利用盐酸、过氧化氢等化学试剂降解甲壳素，这种方法简便易行，但反应剧烈，能耗高，且对环境污染严重；物理法主要是通过超声波、微波、γ射线等使甲壳素内部化学键断裂而降解，其产物不可控，所得甲壳寡糖分子量分布范围过广，限制了其进一步应用；酶法制备甲壳寡糖反应温和、易于控制、无污染，但需要大量使用甲壳素酶，成本较高，难以商业化生产。发酵法制备甲壳寡糖是利用有益微生物自身的生长代谢活动，分解甲壳素原料，从而提高甲壳寡糖含量及原料的营养价值，这种方法反应过程容易控制、简便易行，且成本不高、对环境无污染，对大规模低成本生产甲壳寡糖具有重要意义。但目前发酵法制备甲壳寡糖还存在甲壳素结构致密不利于生物分解、液态发酵过程能耗太大等问题，需要提供一种更有效的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种固态发酵制备甲壳寡糖的方法，即利用微生物发酵降解虾头中的甲壳素从而得到甲壳寡糖的方法，从而弥补现有技术的不足。
一种含甲壳寡糖饲料的制备方法，包括如下的步骤：
1)将虾头干燥粉碎，加入去离子水，混合均匀制成匀浆液，置于钢制反应器中；
2)向钢制反应器中通入co2，密封，将钢制反应器置于油浴中加热；
3)将加热完毕的虾头匀浆液取出，放入真空浓缩仪中浓缩；
4)将经过浓缩的虾头原料121℃灭菌15-30min，接种微生物进行发酵；
5)发酵完毕加入0.5-5倍发酵产物质量的去离子水，置于搅拌器中保温搅拌，搅拌结束将样品烘干粉碎即为含有甲壳寡糖样品。
所述步骤1)中，去离子水的加量为虾头质量的5-10倍。
所述步骤2)中，钢制容器中通入co2使容器压力达到0.5-1.5mpa，油浴加热温度为180-230℃，加热时间为30-60min；
所述步骤3)中，真空浓缩仪加热温度为50-70℃，真空度为20-30mbar，浓缩至虾头原料水分含量为30％-50％。
所述步骤3)中，虾头匀浆液蒸发出的水分可以充分回收利用于步骤1)中。
所述步骤4)中，发酵过程测定发酵体系湿度，并添加无菌水，保持发酵体系湿度为50％-70％。
所述步骤5)中，去离子水的量为发酵产物质量的1-5倍，保温搅拌温度控制为35-50℃，保温时间为10-15h。
本发明的有益效果：本发明首先在高温、高压和co2条件下预处理虾头，再向虾头中接种微生物来发酵虾头，发酵过程无需任何酸碱或者酶类的加入，且属于固态发酵过程，大大节省用水量。得到的发酵产物富含甲壳寡糖、多肽、游离氨基酸等成分，可广泛应用于饲料领域，实现了虾头的绿色高值化利用。而且，本发明避免了传统化学法生产甲壳寡糖过程中大量使用酸碱，产生工业废水污染环境的缺点，同时与酶法相比因不用额外加入甲壳素酶，大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明利用先将虾头匀浆液在高温和高co2浓度环境下对虾头进行预处理，在利用微生物发酵技术降解虾头中的甲壳素得到甲壳寡糖，同时还可得到虾蛋白肽和游离氨基酸等营养成分。上述使用的虾头可使用新鲜虾头、冷冻虾头或干燥虾头。上述的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、地衣芽孢杆菌(baclicuslincheniformis)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)均可购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号分别是cgmcc1.3996、cgmcc1.7669和cgmcc1.7398，也可以是从其它途径获得，具有相同或类似代谢功能的菌株。
实施例1
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.0mpa，油浴加热温度为200℃，加热时间为60min。热处理完毕于60℃、20mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取枯草芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养15天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在60％。发酵结束将发酵样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提0.5h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为3.6g/l、多肽浓度为3.9g/l、游离氨基酸总浓度为2.7g/l。
实施例2
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.0mpa，油浴加热温度为200℃，加热时间为60min。热处理完毕于60℃、20mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取枯草芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养15天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在60％。发酵结束加入500ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中50℃保温10h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提0.5h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为8.6g/l、多肽浓度为5.9g/l、游离氨基酸总浓度为5.7g/l。
实施例3
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.5mpa，油浴加热温度为180℃，加热时间为60min。热处理完毕于60℃、20mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取地衣芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养20天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在70％。发酵结束加入1000ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中45℃保温15h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提10h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为8.3g/l、多肽浓度为6.5g/l、游离氨基酸总浓度为6.3g/l。
实施例4
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.0mpa，油浴加热温度为230℃，加热时间为30min。热处理完毕于70℃、30mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为40％，将虾头原料121℃灭菌20min待用。
取嗜热链球菌菌种，接种于种子培养基(20g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，0.08mol/l的ph6.8na2hpo4/nah2po4缓冲溶液，0.58g/lmgso4·7h2o，0.25g/lmnso4·h2o,1ml/l吐温80)中，置于37℃、静置培养24h，得到种子培养液。按5％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头原料中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养20天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在60％。发酵结束加入300ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中40℃保温15h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提10h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为5.2g/l、多肽浓度为3.9g/l、游离氨基酸总浓度为2.3g/l。
实施例5
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，干燥至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取枯草芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养20天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在50％。发酵结束加入600ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中50℃保温12h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提10h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为3.2g/l、多肽浓度为3.9g/l、游离氨基酸总浓度为2.3g/l。
实施例6
将100g冻存对虾虾头，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，加入ca9coli(po4)70.3g，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.0mpa，油浴加热温度为200℃，加热时间为60min。热处理完毕于60℃、20mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取枯草芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养15天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在60％。发酵结束加入500ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中50℃保温10h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提0.5h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为13.6g/l、多肽浓度为6.7g/l、游离氨基酸总浓度为7.8g/l。
实施例7
将100g冻存对虾虾头，10g燕尾蕨叶片，室温解冻，加入500ml去离子水，高速匀浆机匀浆，收集虾头匀浆液，装入钢制反应容器，并通入co2至容器压力达到1.0mpa，油浴加热温度为200℃，加热时间为60min。热处理完毕于60℃、20mbar条件下浓缩至虾头原料水分含量为30％，加100g麸皮，将虾头麸皮混合物121℃灭菌20min待用。
取枯草芽孢杆菌菌种，接种于种子培养基(25g/l葡萄糖，25g/l酵母粉，1g/lkh2po4，0.5g/lnacl，0.5g/lmgso4·7h2o)中，置于37℃、200rpm摇床培养24h，得到种子培养液。按10％(v/w)接种量接种至灭好菌的虾头麸皮混合物中，并加适量无菌水，将体系含水量调节至60％。接种完毕置于37℃培养箱培养15天，期间每天翻动发酵培养基，并调整湿度在60％。发酵结束加入500ml去离子水混合均匀，置于搅拌器中50℃保温10h，保温结束将样品烘干粉碎得到含有甲壳寡糖样品粉末。
向含甲壳寡糖样品中加入500ml无菌水，浸提0.5h。浸提液测得甲壳寡糖浓度为13.1g/l、多肽浓度为6.9g/l、游离氨基酸总浓度为7.9g/l。
试验例1
利用上述实施例2制备的甲壳寡糖发酵样品作为饲料添加剂进行白来航鸡喂养实验。实验组(实施例2组)以0.03％(w/w)的比例将甲壳寡糖发酵样品添加至饲料中，空白对照组饲料未添加甲壳寡糖发酵样品，两组分别喂养500尾30周龄白来航鸡，饲喂30天，喂养期间自由采食。喂养周期内统计产蛋率、料蛋比、平均蛋重等指标，结果如表1所示。
表1本发明甲壳寡糖发酵样品添加剂对白来航鸡产蛋影响
由表1数据可以看出，饲料中添加本发明甲壳寡糖发酵样品对白来航鸡产蛋情况具有明显的促进作用，其中产蛋率提高8.5％，料蛋比降低12.3％，平均蛋重提高4.5％。
利用上述实施例6制备的甲壳寡糖发酵样品作为饲料添加剂重复上述白来航鸡喂养实验。喂养周期内统计产蛋率、料蛋比、平均蛋重等指标，结果如表2所示。
表2实施例6甲壳寡糖发酵样品添加剂对白来航鸡产蛋影响
由表2数据可以看出，饲料中添加实施例6甲壳寡糖发酵样品对白来航鸡产蛋情况具比实施例2组有明显的促进作用，其中产蛋率提高8.6％，料蛋比降低10.9％，平均蛋重提高5.8％。
试验例2
利用上述实施例2制备的甲壳寡糖发酵样品作为饲料添加剂进行克氏原螯虾饲养实验。实验组(实施例2组)以0.05％(w/w)的比例将甲壳寡糖发酵样品添加至饲料中，空白对照组饲料未添加甲壳寡糖发酵样品。选择平均体重为8.5g的克氏原螯虾200尾，随机分成2组，每组100尾，分别为实验组与空白对照组。每天投喂3次，投饵量约为虾体重的3％，饲养时间为60天。饲养结束统计成活率、相对增重率、饲料系数、相对增长率等指标，结果如表3所示。
表3本发明甲壳寡糖发酵样品添加剂对克氏原螯虾生长影响
由表3数据可以看出，饲料中添加本发明甲壳寡糖发酵样品对克氏原螯虾生长情况具有明显的促进作用，其中成活率提高9.5％，相对增重率提高7.3％，饲料系数降低9.0％，相对增长率提高28.0％。
利用上述实施例7制备的甲壳寡糖发酵样品作为饲料添加剂重复上述克氏原螯虾饲养实验。饲养结束统计成活率、相对增重率、饲料系数、相对增长率等指标，结果如表4所示。
表4实施例7甲壳寡糖发酵样品添加剂对克氏原螯虾生长影响
由表4数据可以看出，饲料中添加实施例7甲壳寡糖发酵样品与添加实施例2的甲壳寡糖发酵样品相比，克氏原螯虾生长情况具有明显的促进作用，其中成活率提高12.6％，相对增重率提高6.0％，饲料系数降低5.7％，相对增长率提高17.8％。
上述结果表明，利用高温、高压和co2条件下预处理虾头，再向虾头中接种微生物来发酵虾头的方法，可有效得到含有较高浓度甲壳寡糖的发酵产物，同时产物中还含有一定量的多肽、游离氨基酸和动物饲料益生菌，可广泛应用于畜牧和水产养殖行业。本发明处理工艺简单，过程绿色环保，产品安全性高，具有很好的推广应用价值。