一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法与应用与流程

本发明涉及一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法与应用，特别涉及一种高活性、适用于恶性肿瘤医用食品原料的利用益生菌发酵提取海带中营养及抗肿瘤活性成分的方法，属于功能食品及植物提取技术领域。

背景技术：

海藻种类繁多，资源丰富，是重要的海洋资源。在我国，海藻主要以海带为主。海带又名昆布、纶布，常作为食品和中药原料，在《本草纲目》、《神农本草位》、《食用本草》及《中国中草药汇编》中均有记载。海带不仅含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，还含有如褐藻酸、褐藻糖胶、褐藻淀粉、褐藻纤维、甘露醇、海带氨酸、高不饱和脂舫酸、岩藻黄质和甾醇类化合物等丰富的生理活性物质。其中，褐藻糖胶被报道具有免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用、抗菌消炎作用、抗氧化作用、抗凝脂作用、降血糖作用等，其中因褐藻糖胶仅占4％含量就可以阻止癌细胞生长,并引起肿瘤细胞凋亡而引起人们广泛关注。研究表明，褐藻糖胶抑制了肝癌细胞qgy7703进入对数生长期，从而遏制了肿瘤的增长，褐藻糖胶对hepes的抑瘤率可超过50％，且不影响小鼠的正常生长，从而表现出比阳性药物的优越性。海藻多酚是一大类结构不同的化合物，具有多种生物活性，目前对海藻多酚抗肿瘤活性、抗菌抗病毒活性、抗氧化活性研究较多。其中，鼠尾藻中褐藻多酚对人肝癌细胞株bel-7402和人肺癌细胞株a-549具有较强的抗肿瘤作用，最佳抑制浓度在0.085～0.10mg·ml/l左右；小黏膜藻粗提物对kb癌细胞、ht-29癌细胞具有选择性细胞毒活性，对正常细胞nih-3t3基本上不具有毒性。

然而，目前我国海带的开发主要集中于海带食品、海藻(带)肥料和碘、海藻酸、甘露醇等化工原料的提取，均属于海藻的浅加工，技术含量低，产品附加值低，尚没有对海藻进行深度加工，高效综合利用海藻中的活性物质。因而必须不断拓展对海藻的研究范围，大力加强海藻在食用、药用、保健、饲料、肥料以及藻胶工业等方面的研究，以便更充分全面地利用海藻资源。

韩国专利文献kr1020140057838a(申请号kr1020120124100)公开了一种采用海带与糙米等其他原料采用混合乳酸菌发酵制备的发酵产物，该发酵产物具有促进体脂肪分解，促进排便等功能，有助于预防大肠癌及肥胖等疾病。

特殊医学用途配方食品(fsmp)是针对某些疾病或特殊健康状况人群提供营养支持而发展起来的特殊食品类别，在提高疾病的治疗效果和术后康复效果、改善患者的营养状况、增强机体自身抵抗力、提高患者的整体健康水平方面具有良好效果。在我国，fsmp产业处于起步阶段，针对性的研究较少，产业化程度较低，市场被外国食品长期占据，处于量少价高的局面。为提高我国特殊医学用途配方食品科技创新能力，推动医养健康产业新旧动能转换，亟需开展医用食品的工艺技术研究，尤其是研发医用食品原料制备技术。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法与应用。该方法提取的食品原料安全性高、针对性强、无污染，同时营养成分、活性物质种类和含量高，肿瘤抑制效果好，稳定性强。

本发明技术方案如下：

一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法，包括以下步骤：

(1)将海带粉碎，制得海带粉；

(2)将步骤(1)制得的海带粉加入一次发酵培养基，混合均匀，然后接入芽孢杆菌菌液后，一次发酵，去除芽孢杆菌菌体，制得海带第一次发酵液；

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌中的一种或两种以上的组合；

(3)向步骤(2)制得的海带第一次发酵液中接种乳酸菌或者乳酸菌与双歧杆菌的混合菌，二次发酵，制得海带第二次发酵液；

所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和蜷曲乳杆菌中的一种或两种以上的组合；

(4)将步骤(3)制得的第二次发酵液经固液分离，上清经喷雾干燥制得上清干粉，沉淀经低温烘干，粉碎后，制得沉淀干粉，混合上清干粉与沉淀干粉，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，海带为鲜海带或经泡发后的海带，经除盐后，干燥至含水量≤5％。

根据本发明进一步优选的，所述除盐为采用纯净水冲洗2～5次。

根据本发明进一步优选的，所述泡发过程如下：将干海带浸入10～20倍质量的纯净水中，在20～40℃的条件下泡发2～7h。

根据本发明进一步优选的，所述干燥采用烘干方式，烘干温度45～90℃。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，粉碎粒径为10～1000μm。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，还包括粉碎后灭菌的步骤；进一步优选的，灭菌采用辐照灭菌，在1000～2500千拉德辐照灭菌1.5～5h；更优选的，辐照灭菌时间为3h。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，一次发酵条件为：在温度35～38℃、转速180～220rpm的条件下发酵24～48h。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，一次发酵培养基组份如下，均为重量百分比：

1.5～2.5％葡萄糖，1.0～2.0％蛋白胨，0.04～0.06％的氯化钠，0.04～0.06％的牛肉膏和余量的水。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，海带粉的加入量为一次发酵培养基质量的7～12％。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述的芽孢杆菌菌液的接入量为一次发酵培养基质量的1％～5％，芽孢杆菌菌液的菌体浓度为1.5～7.5×10¹⁰cfu/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，去除芽孢杆菌菌体采用离心分离，在7000～10000rpm的条件下离心8～12min。

上述海藻粉伴随芽孢杆菌生长产生的多种酶类进行降解，发酵料液的粘度逐渐增大，为了不影响后续发酵，因此需要进行固液分离。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述乳酸菌的接入量为海带第一次发酵液体积的4～6％，乳酸菌的菌体浓度为2.5～9.5×10¹⁰cfu/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，二次发酵为在温度28～33℃的条件下静置发酵36～72h。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，固液分离为7000～10000r/min条件下离心10～20分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，喷雾干燥条件为：入口温度90℃，出口温度65℃，喷雾空气压力0.1mpa，干燥空气量调至0.5m³/l；低温烘干温度为45～65℃。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，固液分离步骤前，还包括后熟步骤：

将海带第二次发酵液置于8～12℃条件下密闭静置，后熟15～30d，即得。后熟的作用为通过低温后熟转化使发酵液中的活性成分趋于稳定。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，粉碎为超微粉碎。

上述恶性肿瘤医用食品原料在制备恶性肿瘤保健食品或药物中的应用。

有益效果

1、本发明首次通过对海带进行益生菌二次发酵的方式制备获得恶性肿瘤医用食品原料，该方法可以释放海带中营养物质及活性成分，不仅制备过程安全可靠、绿色高效，还有效避免了化学试剂强酸、强碱的使用，减少排放污染，发酵液含有膳食纤维，达到无渣排放，符合绿色环保和新旧动能转换的策略及方针；

2、通过本发明所述方法制备的恶性肿瘤医用食品原料，含有较高的与抗肿瘤、抗病毒、抗菌消炎、抗氧化作用密切相关的褐藻糖胶、多酚、岩藻糖含量，且经过实施例制备的海带发酵液对神经胶质瘤细胞的生长都具有较好的抑制作用；同时本发明不仅完整保留和释放了海带中的活性成分，所述发酵益生菌可产生谷胱甘肽、伽马氨基丁酸、胞外纤维素酶、果胶酶等活性成分，增加了发酵产物中活性成分的种类和含量，进一步提高了肿瘤医用食品配方原料的营养和疗效。

附图说明

图1为实施例1与对比例1、对比例2中多酚提取率对比的柱状图；

图2为实施例1中海带第一次发酵液中多酚含量检测结果的标准曲线图；

图3为实施例2制备的恶性肿瘤医用食品原料的抑制神经胶质瘤细胞u87/lc3电镜照片；

其中：a、施用后0h时u87/lc3细胞的电镜结构，b、施用后4h时u87/lc3细胞的电镜结构，c、施用后8h时u87/lc3细胞的电镜结构，d、施用后12h时u87/lc3细胞的电镜结构，e、施用后16h时u87/lc3细胞的电镜结构；

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

生物材料来源

本发明中所述乳酸菌的来源没有限定，采用本领域食品来源的乳酸菌即可；实施例及对比例中涉及的植物乳杆菌保藏号cicc20261、干酪乳杆菌保藏号cicc20277、嗜酸乳杆菌保藏号cicc22150、嗜热链球菌保藏号cicc20370，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)；格氏乳杆菌保藏号jcm11657、蜷曲乳杆菌保藏号jcm2009，均购自日本微生物保藏中心(japancollectionofmicroorganisms)；

本发明中所述芽孢杆菌均为益生菌，本发明对所述芽孢杆菌的来源没有限定，采用本领域食品来源的芽孢杆菌即可；实施例及对比例中涉及的枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，保藏号cicc24434；短小芽孢杆菌保藏号cgmcc1.7925、地衣芽孢杆菌保藏号cgmcc1.15832、凝结芽孢杆菌保藏号cgmcc1.10832均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；

实施例中所用的试验材料均为本领域常规的市售材料，均可通过商业渠道购买得到。

粉碎采用江苏省明丰机械制造有限公司的微粉碎机，普通市售产品；

喷雾干燥设备为欧盟牌om-1500/om-1500a实验室喷雾干燥机，喷雾干燥的条件设置为：入口温度90℃，出口温度65℃，喷雾空气压力0.1mpa，干燥空气量调至0.5m³/l；普通市售产品；

干燥采用上海博讯实验有限公司医疗设备厂gzx-9240mbe数显鼓风干燥箱，低温烘干的温度为45～65℃，烘干至含水量低于3％；普通市售产品；

超微粉碎采用北京开创同和科技发展有限公司的kc-701植物超微粉碎机，普通市售产品；

混合采用常州市钱江干燥设备厂生产的v型混匀机进行混匀，普通市售产品。

检测方法

褐藻糖胶：依据(刘海光，海带多糖的分离纯化及活性研究[d].山东大学，2004)中记载的方法进行检测；

岩藻糖：依据gb/5009.168-2016中华人民共和国农业行业标准ny/t2279-2202中方法进行检测；

褐藻多酚：依据(杨会成，海带(laminariajaponicaaresch)多酚的提取分离及其抗肿瘤抗菌活性研究[d].中国海洋大学，2008)中记载的方法进行检测；

多糖：依据sn/t4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定记载的苯酚-硫酸法进行检测；

肿瘤细胞抑制实验：依据(杨会成，海带(laminariajaponicaaresch)多酚的提取分离及其抗肿瘤抗菌活性研究[d].中国海洋大学，2008)中记载的方法进行检测；

实施例1

一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法，包括以下步骤：

(1)将含水量≤5％的海带粉碎至粒径为500μm，灭菌，制得海带粉；

所述海带为鲜海带，经纯净水冲洗3次后，在温度70℃条件下烘干，制得；

灭菌的步骤如下：在1500千拉德辐照灭菌3h；

(2)将步骤(1)制得的海带粉加入一次发酵培养基，海带粉的加入量为一次发酵培养基质量的10％，混合均匀，然后接入芽孢杆菌菌液后，在温度36℃、转速200rpm的条件下进行一次发酵36h，在8500rpm的条件下离心10min去除芽孢杆菌菌体，制得海带第一次发酵液；

所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌；

所述一次发酵培养基组份如下，均为重量百分比：

1.5％葡萄糖，1.0％蛋白胨，0.04％的氯化钠，0.04％的牛肉膏和余量的水；

所述的芽孢杆菌菌液的接入量为一次发酵培养基质量的3％，芽孢杆菌菌液的菌体浓度为5×10¹⁰cfu/ml；

(3)向步骤(2)制得的海带第一次发酵液中接种乳酸菌或者乳酸菌与双歧杆菌的混合菌，所述乳酸菌的接入量为海带第一次发酵液体积的5％，乳酸菌的菌体浓度为3.0×10¹⁰cfu/ml，在温度30℃的条件下静置发酵36h，制得海带第二次发酵液；

所述乳酸菌为植物乳杆菌；

(4)将步骤(3)制得的第二次发酵液经8500r/min条件下离心15分钟，上清经喷雾干燥制得上清干粉，沉淀经低温烘干，超微粉碎后，制得沉淀干粉，混合上清干粉与沉淀干粉，即得。

所述喷雾干燥条件为：入口温度90℃，出口温度65℃，喷雾空气压力0.1mpa，干燥空气量调至0.5m³/l；低温烘干温度为55℃。

依据(樊文乐，海带的综合利用研究[d].天津科技大学，2006)中记载的方法对步骤(2)制得的海带第一次发酵液进行检测，结果如表1所示：

表1海带第一次发酵液中褐藻糖胶含量及组成

实施例2

一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法，包括以下步骤：

(1)将含水量≤5％的海带粉碎至粒径为10μm，灭菌，制得海带粉；

所述海带为经泡发后的海带，经纯净水冲洗5次后，在温度45℃条件下烘干，制得；

所述泡发过程如下：将干海带浸入20倍质量的纯净水中，在20℃的条件下泡发7h；

灭菌的步骤如下：在1000千拉德辐照灭菌5h；

(2)将步骤(1)制得的海带粉加入一次发酵培养基，海带粉的加入量为一次发酵培养基质量的7％，混合均匀，然后接入芽孢杆菌菌液后，在温度38℃、转速180rpm的条件下进行一次发酵48h，在7000rpm的条件下离心12min去除芽孢杆菌菌体，制得海带第一次发酵液；

所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的组合；

所述一次发酵培养基组份如下，均为重量百分比：

2.5％葡萄糖，2.0％蛋白胨，0.06％的氯化钠，0.06％的牛肉膏和余量的水。

所述的芽孢杆菌菌液的接入量为一次发酵培养基质量的1％，芽孢杆菌菌液的菌体浓度为7.5×10¹⁰cfu/ml。

(3)向步骤(2)制得的海带第一次发酵液中接种乳酸菌或者乳酸菌与双歧杆菌的混合菌，所述乳酸菌的接入量为海带第一次发酵液体积的4％，乳酸菌的菌体浓度为4.5×10¹⁰cfu/ml，在温度33℃的条件下静置发酵48h，制得海带第二次发酵液；

所述乳酸菌为植物乳杆菌、蜷曲乳杆菌中的组合；

(4)将步骤(3)制得的第二次发酵液经后熟，然后在10000r/min条件下离心10分钟，上清经喷雾干燥制得上清干粉，沉淀经低温烘干，超微粉碎后，制得沉淀干粉，混合上清干粉与沉淀干粉，即得。

所述喷雾干燥条件为：入口温度90℃，出口温度65℃，喷雾空气压力0.1mpa，干燥空气量调至0.5m³/l；低温烘干温度为65℃。

所述后熟步骤如下：

将海带第二次发酵液置于8℃条件下密闭静置，后熟30d，即得。后熟的作用为通过低温后熟转化使发酵液中的活性成分趋于稳定。

实施例3

一种利用益生菌发酵海带制备恶性肿瘤医用食品原料的方法，包括以下步骤：

(1)将含水量≤5％的海带粉碎至粒径为1000μm，灭菌，制得海带粉；

所述海带为经泡发后的海带，经纯净水冲洗2次后，在温度90℃条件下烘干，制得；

所述泡发过程如下：将干海带浸入10倍质量的纯净水中，在40℃的条件下泡发2h；

灭菌的步骤如下：在2500千拉德辐照灭菌1.5h；

(2)将步骤(1)制得的海带粉加入一次发酵培养基，海带粉的加入量为一次发酵培养基质量的12％，混合均匀，然后接入芽孢杆菌菌液后，在温度35℃、转速220rpm的条件下进行一次发酵24h，在10000rpm的条件下离心8min去除芽孢杆菌菌体，制得海带第一次发酵液；

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的组合；

所述一次发酵培养基组份如下，均为重量百分比：

2.0％葡萄糖，1.5％蛋白胨，0.046％的氯化钠，0.05％的牛肉膏和余量的水。

所述的芽孢杆菌菌液的接入量为一次发酵培养基质量的5％，芽孢杆菌菌液的菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml。

(3)向步骤(2)制得的海带第一次发酵液中接种乳酸菌或者乳酸菌与双歧杆菌的混合菌，所述乳酸菌的接入量为海带第一次发酵液体积的6％，乳酸菌的菌体浓度为5.0×10¹⁰cfu/ml，在温度28～33℃的条件下静置发酵52h，制得海带第二次发酵液；

所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和蜷曲乳杆菌的组合；

(4)将步骤(3)制得的第二次发酵液经后熟，然后在10000r/min条件下离心10分钟，上清经喷雾干燥制得上清干粉，沉淀经低温烘干，超微粉碎后，制得沉淀干粉，混合上清干粉与沉淀干粉，即得。

所述喷雾干燥条件为：入口温度90℃，出口温度65℃，喷雾空气压力0.1mpa，干燥空气量调至0.5m³/l；低温烘干温度为65℃。

所述后熟步骤如下：

将海带第二次发酵液置于8℃条件下密闭静置，后熟30d，即得。后熟的作用为通过低温后熟转化使发酵液中的活性成分趋于稳定。

对比例1

分别采用水提、酸提及酶解提取的方法对褐藻糖胶进行提取；依据(樊文乐，海带的综合利用研究[d].天津科技大学，2006)中记载的方法进行提取。

对比例2

如实施例2所述的方法，不同之处在于，一次发酵采用乳酸菌发酵，二次发酵采用芽孢杆菌。

实验例1

依据(樊文乐，海带的综合利用研究[d].天津科技大学，2006)中记载的方法对实施例1及对比例1中制得的不同产物的杂多糖及褐藻糖胶含量进行检测，结果如表1所示：

表2实施例1及对比例1中杂多糖及褐藻糖胶含量对比结果

由表2可以看出，实施例1的多糖和褐藻糖胶含量与对比例1中的热水水提、酸提及酶解提取显著增高，其中被报道具有免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用、抗菌消炎作用、抗氧化作用、抗凝脂作用、降血糖作用的褐藻糖胶含量是酸解提取的1.93倍，是热水浸提的1.75倍；

依据(樊文乐，海带的综合利用研究[d].天津科技大学，2006)中记载的方法对实施例1及对比例1中制得的不同产物的海藻多酚的含量进行检测，结果如图1所示；

由图1可以看出，实施例2中的具有明确抗肿瘤活性的海藻多酚含量是对比例1中热水水提的2.36倍，酸解提取的2.18倍，对比例2的1.65倍。通过以上数据可以看出，不同益生菌的酶解顺序也对海藻多酚含量具有显著的影响。

实验例2

lc3蛋白是一种微管相关蛋白，在细胞自噬中它会发生特异性的变化，周围出现点聚状的结构。而神经胶质瘤细胞u87/lc3瘤株的lc3蛋白被gfp绿色荧光标记，可以通过荧光显微镜观察。

采用如下方法检验实施例3中的产物对神经胶质瘤细胞u87/lc3的影响，步骤如下：

(1)神经胶质瘤细胞u87/lc3细胞铺板于5cm直径的小玻璃培养皿中进行贴壁培养，每个培养皿中的细胞液保持2ml，孵箱培养18h。

(2)添加2.5‰(质量比)实施例3发酵液，分别平行做5组，其中一组为不添加实施例3空白对照，培养4h，8h，12h，16h后，用荧光显微镜进行观察变化。

由图3可以看出，当神经胶质瘤细胞u87/lc3加入实施例3制得的产物后，通过荧光显微镜观察，可以清楚地看出细胞周围出现了点聚状结构。具体来说，gfp-lc3蛋白在实施例3制得的产物作用后明显发生了变化，其中，作用4h后u87/lc3周围出现点聚状的结构如图3b所示，并且在随后的8h到12h中，这种点聚状的结构一直存在，并逐渐增多，一直到最后第16h，可以发现细胞结构已经破裂，肿瘤细胞死亡。这种变化过程清楚的说明了实施例3制得的产物会诱导细胞发生自噬现象，既实施例3制备的海带发酵液对神经胶质瘤细胞的生长具有较好的抑制作用。