一种鸡肉增味肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及食品添加剂技术领域，尤其涉及一种鸡肉增味肽及其制备方法和应用。

背景技术：

目前研究发现一些小分子的肽类不仅具有非常多的生理功能，而且具有丰富的呈味功能，已知的有甜味肽(如阿斯巴甜、阿粒甜等)，苦味肽、酸味肽、咸味肽、美味肽，其中著名的美味肽最初是由yamasaki从牛肉的木瓜蛋白酶消化液中分离出来的八肽(lys-gly-asp-glu-ser-leu-leu-ala)，该牛肉风味肽具有很强的鲜味，与食盐和谷氨酸钠具有很好的协同作用。

呈味肽能体现最基本的呈味特性，由于肽段的氨基酸组成、结构、空间构象、排列顺序和长度都不同，因而表现出不同的呈味特点。目前缺乏能够提供自然纯正、相似度高的鸡肉味的呈味肽。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的结构单一的鸡肉增味肽，有助于模拟鸡肉原有滋味，可应用于鸡肉味调料中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鸡肉增味肽，氨基酸序列为：

lys-asp-leu-phe-asp-pro-val-ile-gln-asp。

优选的，所述鸡肉增味肽从鸡肉中提取得到。

本发明提供了上述技术方案所述鸡肉增味肽的方法，包括以下步骤：

(1)将鸡肉糜与水混合，所得鸡肉糜混合液以复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf双酶解，得到鸡肉酶解液；

(2)将鸡肉酶解液固液分离，取上清液超滤，取小于1kda的超滤液干燥，得到鸡肉蛋白肽；

(3)以水复溶鸡肉蛋白肽，所得鸡肉蛋白肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到鸡肉增味肽。

优选的，所述步骤(1)中，所述复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf的酶活力之比为1:0.8～1.2，所述双酶解温度为48～52℃，所述双酶解时间为3.5～4.5h。

优选的，所述鸡肉糜与水的质量比为1:0.8～1.2。

优选的，所述步骤(2)中的超滤包括依次进行的中空纤维超滤和高速超滤，所述中空纤维超滤得到分子量低于6kda的过滤液。

优选的，所述步骤(3)中，鸡肉蛋白肽溶液的浓度为35～45mg/ml。

优选的，所述步骤(3)中，凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1ml/min。

本发明还提供了前述技术方案所述的鸡肉增味肽或上述技术方案所述方法制备的鸡肉增味肽在食品中的应用。

优选的，所述鸡肉增味肽作为肉味调料在食品中应用。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种新的、结构单一的鸡肉增味肽，氨基酸序列为lys-asp-leu-phe-asp-pro-val-ile-gln-asp。本发明所述增味肽来源于鸡肉中，增香增鲜，有助于模拟鸡肉的原有滋味，单独或与其他鸡肉香精、鸡肉呈味肽的物质综合利用，丰富鸡肉风味的调料市场。本发明的实施例显示，将本发明所述鸡肉增味肽与鸡粉混合后，其滋味复杂，肉味、鲜味和醇厚感相对于l-谷胱甘肽有显著提升。

附图说明

图1为实施例1中凝胶层析柱分离结果；其中，i～vii表示依次收集的洗脱组分；

图2为实施例1中液质联用分析的总离子流图。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡肉增味肽，氨基酸序列为lys-asp-leu-phe-asp-pro-val-ile-gln-asp(seqidno.1)。本发明所述鸡肉增味肽的相对分子量为1188.6027(m/z)。本发明所述鸡肉增味肽来源于鸡肉，可以通过人工合成或从鸡肉中提取得到。

在本发明中，从鸡肉中分离上述鸡肉增味肽的方法包括以下步骤：

(1)将鸡肉糜与水混合，所得鸡肉糜混合液以复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf双酶解，得到鸡肉酶解液；

(2)将鸡肉酶解液固液分离，取上清液超滤，取小于1kda的超滤液干燥，得到鸡肉蛋白肽；

(3)以水复溶鸡肉蛋白肽，所得鸡肉蛋白肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到鸡肉增味肽。

本发明以鸡肉作为提取原料，将其粉碎为肉糜后与水混合，所得鸡肉糜混合液以复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf双酶解，得到鸡肉酶解液。

在本发明中，所述鸡肉优选为鸡胸肉；在本发明中，所述鸡肉糜优选的通过斩拌机的方式粉碎为肉糜。本发明将鸡肉制成鸡肉糜的目的是为了方便酶解。

在本发明中，所述鸡肉糜与水的质量比优选为为1:0.8～1.2，更优选为1:1。在本发明中，所述复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf的酶活力之比优选为1:0.8～1.2，更优选为1:1。本发明利用双酶解将鸡肉中的大分子物质分解为小分子多肽，以便寻找其中的呈味多肽。在本发明中，所述双酶解温度优选为48～52℃，更优选为50℃；所述双酶解时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。本发明所述双酶解为同步酶解。本发明对所述复合蛋白酶fh-g-na-xii和胰蛋白酶ydb-cf的来源无特殊限定，采用市售商品即可。

得到鸡肉酶解液后，本发明将鸡肉酶解液固液分离，取上清液超滤，取小于1kda的超滤液干燥，得到鸡肉蛋白肽。

在本发明中，所述鸡肉酶解液的固液分离方式优选为离心分离；进一步优选的，所述离心分离时离心转速优选为3000～5000rpm/min，更优选为4000rpm/min；所述离心分离时的离心时间优选为15～30min，更优选为20min。本发明对鸡肉酶解液进行固液分离是为了去除残渣，以便进行后续的超滤步骤。

在本发明中，所述超滤优选的包括依次进行的中空纤维超滤和高速超滤，所述中空纤维超滤得到分子量低于6kda的过滤液，将中空纤维超滤所得分子量低于6kda的过滤液进行高速超滤，即可得到分子量小于1kda的超滤液。本发明所述超滤是为了初步去除酶解液中分子量较大的物质，降低后续分离难度。在本发明中，所述干燥小于1kda的超滤液方法包括但不限于冷冻干燥。

得到鸡肉蛋白肽后，本发明将水复溶鸡肉蛋白肽，所得鸡肉蛋白肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到鸡肉增味肽。

在本发明中，复溶后的鸡肉蛋白肽溶液的浓度优选为35～45mg/ml，更优选为40mg/ml。本发明所述鸡肉蛋白肽溶液浓度适宜凝胶层析柱分离上样，可提高分离纯化效率。

在本发明中，所述凝胶层析柱优选为sephadexg-15；在本发明的具体实施例中，所述凝胶层析柱的规格为1.6×36cm。

本发明先以超纯水洗脱凝胶层析柱再进行上样，所述超纯水洗脱流速优选为1ml/min。在本发明中，所述凝胶层析柱的上样量优选为2ml，并有自动分步收集器收集洗脱液，并对分步收集的个分组分进行吸光度检测，所述吸光度检测波长优选为220nm。

本发明收集洗脱组分的第二峰并进行液质联用色谱分离鉴定，其中即含有本发明上述技术方案所述的鸡肉增味肽。

本发明还提供了前述技术方案所述的鸡肉增味肽或上述技术方案所述方法分离得到的鸡肉增味肽在食品中的应用。具体的，所述鸡肉增味肽可作为肉味调料使用，优选的应用于鸡肉风味调料。

在本发明中，所述鸡肉增味肽可单独或与其他已知的调料组合使用，提升食品的鲜味和醇厚感。本发明所述鸡肉增味肽在食物中经过美拉德反应，可呈现近似天然鸡肉的风味，可应用于热反应香精中。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1获得鸡肉增味肽

步骤(1)：获得鸡肉的蛋白质酶解液

将鸡胸肉经斩拌机进行粉碎成肉糜，按肉水的质量比1:1加水，复合蛋白酶fh-g-na-ⅻ和胰蛋白酶ydb-cf按1:1配比总添加量3000u/g，50℃条件下双酶同步酶解4h，获得鸡肉酶解液。然后在4000rpm/min离心20min取上清液，取过滤后的上清液利用中空纤维超滤装置和搅拌式超高速超滤装置进行超滤得到小于1kda的超滤液，收集小于1kda的超滤液，冻干成粉，得到鸡肉蛋白肽。

步骤(2)：鸡肉蛋白酶解液的凝胶色谱分离

将分子量小于1kda的鸡肉蛋白肽溶于去离子水，使其浓度为40mg/ml，利用sephadexg-15凝胶层析柱(1.6×36cm)进一步分离纯化，凝胶层析柱用超纯水以1ml/min流速洗脱，样品流速1ml/min，进样量为2ml，并用自动分步收集器收集洗脱液，每管收集3ml，在220nm下检测吸光度值，最后收集各峰组分(如图2所示)，记为gpc-i～gpc-vii，浓缩冻干成粉末。gpc-v之后的洗脱组分无吸收峰，不进行分析。

步骤(3)：将凝胶色谱分离后收集的各组分以0.05％的比例与去离子水、4％的还原糖(木糖：葡萄糖＝1:1)混合后进行美拉德反应，得到美拉德反应液，记为mrp-gpc-i～mrp-gpc-v。

将各组美拉德反应液分别稀释到质量体积浓度为1％后进行感官评价，由感官评价小组对各样品进行评分，采用的是0～9分的打分制度，评分的标准包括鲜味、醇厚感、和谐性。

感官评定由天津春发食品配料有限公司感官评定室协助完成。选取7名经过培训的评价员(4女/3男，年龄26～48岁)对热反应鸡肉香精进行感官评价。评价时将maillard反应产物(maillardreactionproducts,mrps)样品用60℃鲜味溶液稀释至1.0％，盛入大小相同的品评杯中，每次入口量大约10～15ml。不同的样品中间使用温开水漱口。

鲜味溶液：100ml含1％msg和0.5％nacl的水溶液，在60℃下保温备用；样品溶液：100ml鲜味对照溶液中加入1g样品反应液，配制成1％的样品溶液，两种溶液均在60℃下保温备用。

感官评价结果如表1所示，其中mrp-1表示分子量小于1000da的鸡肉蛋白肽进行相同的美拉德反应后取作对照的组分。由表1可以看出，mrp-gpc-ii的感官评价最优，因而确认gpc-ii组分的呈味效果最好。

表1分离组分美拉德反应液感官评价结果

注：表内数值为平均值±标准差(n＝7,重复两次)，本章后面表格与此相同，同一列不同字母表示相互间有显著差异(p<0.05)。

步骤(4)：将gpc-ii收集组分进行液质联用分析并进行肽段序列的鉴定。

①对收集后的层析组分gpc-ii进一步采用液质联用分析。将0.02ggpc-ii组分冻干粉溶解在2ml洗脱液，采用反向c18萃取小柱除去杂质，将洗脱液洗脱下来的肽段置于真空浓缩，冷冻干燥成粉。

所述洗脱液为0.1％三氟乙酸中以含0.1％三氟乙酸的60％的乙腈溶液。

②对步骤①获得的gpc-ii冻干粉样品采用液质联用分析，液质联用分析结果表明，共鉴定出其含有500个多肽，分子量集中在1000-1500d(354个肽)，肽的长度为6-47个氨基酸，长度大都集中在10肽左右。在液质联用分析结果中，十肽(kdlfdpviqd)肽段含量较高而且肽段中呈味氨基酸较多，将这肽段采用固相合成，即得鸡肉增味肽。

实施例2对鸡肉增味肽的感官评价

在针对合成的鸡肉增味肽的感官评价实验中，引入l-谷胱甘肽作为参照，将合成的多肽：kdlfdpviqd和l-谷胱甘肽以0.1％的比例分别与去离子水配制成的样品溶液，与0.1％的l-谷胱甘肽样品溶液、去离子水进行感官评价，由感官评价小组针对样品的风味强度、和谐性进行评分，采用0～9分的打分制度。

表2合成多肽水溶液的感官特性

②对鸡肉增味肽的多肽滋味复杂感进行感官评价

将合成肽与氯化钠和鸡粉溶液混合均匀后进行感官评价，样品准备如表3所示。采用0～9分的打分制，由评价小组针对样品进行感官评分，评分的指标包括肉味、鲜味、醇厚感、酸涩感、和谐性。

表3kokumi滋味复杂感的样品准备

表4合成多肽的醇厚味复杂感

验证鸡肉增味肽滋味复杂感，经感官评价，合成多肽和l-谷胱甘肽都使得原始的鸡粉溶液的肉味、鲜味、醇厚感显著提高(如表4)。从单一的感官评价指标上来看，合成的十肽肉味提高最多；醇厚感评分中，合成十肽的提升作用相较l-谷胱甘肽更明显；在这一鸡粉溶液体系中，合成十肽并未产生酸涩感，l-谷胱甘肽后味酸涩感明显，可能与其中的半胱氨酸有关系；酸涩感影响了和谐性的评分，使得l-谷胱甘肽的和谐性偏低。

实施例3

合成十肽在热反应香精中的应用：

(1)美拉德反应香精的制备：按照质量百分比，将1.01％半胱氨酸、0.97％硫胺素、3.89％还原糖、1.23％谷氨酸、0.54％亮氨酸、0.47％甘氨酸、3.49％鸡脂混合后进行美拉德反应，美拉德反应是在油浴锅中进行的，利用二甲基硅油进行加热，初始反应ph6.5，反应时间是100min，

反应温度是100℃。美拉德反应液稀释到浓度为1％后进行感官评价，由感官评价小组对各样品进行评分，采用的是0～9分的打分制度，评分的标准包括鲜味、醇厚感、和谐性。

(2)利用步骤(1)得到的反应产物，向其中添加质量百分比0.4％～1.6％的十肽，随添加量的增加，美拉德反应香精的肉味、鲜味、醇厚感都是增强的趋势(如表5)，但是和谐性却在0.4％添加量以后评分变低，这可能与十肽的酸涩感有关，添加量增多影响了香精风味的整体协调性，同时肉味在添加量为0.4％时评分最高，添加量增加肉味评分与空白组不添加十肽的评分基本持平，原因可能也是与十肽自身的风味有关。因此，通过调整十肽的添加量可改善其对美拉德反应香精的呈味效果，从而证明合成十肽可以作为厚味调味剂用于食品领域。

表5合成十肽添加量对香精风味的影响

由以上实施例可知，本发明提供的鸡肉增味肽能够提升鲜味、醇厚感，结构简单、单一，适宜作为鸡肉调味料使用，能够提供天然的、香味近似的鸡肉风味。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种鸡肉增味肽及其制备方法和应用

<130>gw2018i3024

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10

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<213>gallusgallusdomesticus

<400>1

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