本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素及其制备方法。
背景技术：
：骨质疏松是以骨量减少、骨组织微观结构退化为特征致使骨骼脆性增加及骨折危险性增加的一种代谢性疾病，常见于中老年人。随着我国老龄化现象日益严重，骨质疏松症患者大幅度增加，给家庭、社会带来严重的经济负担。辣木是一种尚未充分开发的多功能树种，具有营养丰富、适应性广、栽培简便及抗逆性强等特点。辣木含有多种丰富的矿物质、维生素和人体必需氨基酸，其中，无论是国内引种栽培的还是原产地的辣木种子，其蛋白的含量均在26％～37％，与含蛋白最多的大豆(平均含蛋白质27％)相近，有很好的开发价值。有研究证明，在饲料中添加辣木叶粉对提高肉鸡胫骨完整性与胫骨骨无机成分有显著效果。葛根为豆科植物野葛或甘葛藤萝的块根，是中国南方一些省区的一种常食蔬菜，其味甘凉可口，常作煲汤之用，也可作药物。野生葛根内含12％的黄酮类化合物，如葛根素、大豆黄酮苷、花生素等营养成分，还有蛋白质、氨基酸、糖、和人体必需的铁、钙、铜、硒等矿物质，是老少皆宜的名贵滋补品，有“千年人参”之美誉。已公开专利cn107549817a披露了一种辣木天然有机钙及其制备方法公开的以辣木叶为主要原材料，通过混合微生物分阶段发酵，所述混合微生物为噬酸乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和酿酒酵母。分阶段梯度发酵包括36～38℃条件下厌氧发酵20～24h，ph值降至4.0～4.5，然后在26～30℃条件下有氧发酵24～36h，最后在36～38℃条件下厌氧发酵18～24h，最终ph值达到3.75～3.85时结束发酵。三步发酵操作的工艺较为复杂。以及已公开专利cn105614864a披露了一种辣木酵素片及其制备方法公开的以辣木叶为主要原材料，通过混合微生物发酵，所述混合微生物为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。综上所述，目前辣木的发酵原料以辣木叶为主，而蛋白含量更高的辣木籽的开发较少。技术实现要素：本发明的目的是以蛋白含量更高的辣木籽和葛根为原料，利用可用于食品的微生物菌种进行发酵，提供一种修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素，提高该人群的钙质和蛋白质的吸收率，修复成骨细胞，改善骨骼代谢，促进骨密度，改善骨骼强度，提高钙在骨骼中的沉积。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的第一个方面是提供一种修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素的制备方法，其步骤包括：步骤1，将清水洗净的辣木籽和葛根分别送入粉碎设备粉碎，过50～100目筛，然后按比例混合得到发酵原料；步骤2，将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌按比例混合后的菌种原液接入步骤1制得的辣木籽和葛根发酵原料，加入一定量的糖和无机盐后进行发酵；步骤3，将步骤2的产物直接烘干，粉碎过筛后可得发酵成品a；或将步骤2的产物，加适量水经过离心分离得到的液体灭菌后可得发酵成品b；或将成品b经过进一步浓缩、干燥，得发酵成品c。进一步地，步骤1中所述辣木籽粉和葛根粉的重量比例为(75-90)：(10-25)，按比例混合后得到发酵原料。进一步地，步骤2中所述糖选自单糖、低聚糖、糖蜜和蜂蜜中的任意一种或几种。进一步地，步骤2中所述单糖选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖中的任意一种或几种。进一步地，步骤2中所述低聚糖选自低聚果糖、大豆低聚糖、异麦芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖、低聚帕拉金糖、低聚木糖、异麦芽糖、乳酮糖、乳蔗糖、水苏糖、棉籽糖中的任意一种或几种。进一步优选地，所述糖至少含有甘蔗糖蜜。进一步地，步骤2中所述无机盐选自铵盐、硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐中的任意一种或几种。进一步优选地，所述无机盐至少含有硫酸铵。进一步地，步骤2中所述枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌在使用之前经过以下培养：将所述菌种接入固体或液体培养基，在25-45℃下培养。进一步优选地，所述的枯草芽孢杆菌的培养为将枯草芽孢杆菌转接入营养肉汤液体培养基中进行振荡培养，其振荡培养的温度范围优选为30-40℃，更优选为35-38℃，其振荡培养的转数范围优选为150-250rpm，更优选为180-220rpm，其振荡培养的时间优选为16-72h，更优选为30-48h，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。进一步优选地，所述的酿酒酵母菌的培养为将酿酒酵母菌转接入马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养，其振荡培养的温度范围优选为26-35℃，更优选为28-32℃，其振荡培养的转数范围优选为150-250rpm，更优选为180-220rpm，其振荡培养的时间优选为36-84h，更优选为48-72h，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。进一步优选地，所述的植物乳杆菌和发酵乳杆菌的培养为将植物乳杆菌和发酵乳杆菌分别转接入mrs液体培养基中进行培养，其培养的温度范围优选为28-40℃，更优选为32-35℃，其培养时间范围优选为24-72h，更优选为30-48h，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。进一步优选地，所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)优选为保藏编号为acccno：10619的菌种。进一步优选地，所述酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)优选为保藏编号为acccno：20065的菌种。进一步优选地，所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)优选为保藏编号为cgmccno：1.557的菌种。进一步优选地，所述发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)优选为保藏编号为cgmccno：1.1880的菌种。进一步地，步骤2中所述枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的重量比例为(25-40)：(25-40)：(10-25)：(10-25)，按比例混合后得到菌种原液。进一步地，步骤2中所述发酵原料、糖、无机盐和菌液的重量比例为(75-90)：(1-5)：(0.1-0.5)：(5-30)。进一步地，步骤2中所述发酵过程中，发酵温度范围为25-45℃，优选为28-35℃。进一步地，步骤2中所述发酵过程中，发酵时间为48-240小时，优选为120-168小时。进一步地，步骤3中所述所述的烘干温度范围为50-90℃，优选为60-80℃。进一步地，步骤3中所述浓缩、干燥为真空冷冻干燥。本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本发明方法制备的修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素，利用可用于食品的微生物菌种对辣木籽本身含有的引起身体不适的生物碱、辣木黄酮，以及不易吸收的植酸钙等物质进行发酵分解和转化，提高了钙质和蛋白质的吸收率，从而改善中老年人群的骨骼代谢，促进骨密度，改善骨骼强度；同时本发明的葛根粉中的葛根素、大豆黄酮苷、花生素等抗氧化物质经过发酵转化后还可以对因年老退化的成骨细胞进行修复，恢复其利用血液中钙元素的能力，有效修复中老年骨质疏松人群的骨骼机能。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。实施例1本实施例提供一种修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素的制备方法，其步骤包括：步骤1，将清水洗净的辣木籽和葛根分别送入粉碎设备粉碎，过100目筛，然后将辣木籽粉和葛根粉按照重量比例85：15混合后得到发酵原料；步骤2，首先培养枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌用作种子液：将上述的枯草芽孢杆菌转接入营养肉汤液体培养基中进行振荡培养，在37℃，转数为220rpm下振荡培养36小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。将上述的酿酒酵母菌转接入马铃薯葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，在28℃，转数为220rpm下振荡培养48小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。将上述的植物乳杆菌和发酵乳杆菌分别转接入mrs液体培养基的锥形瓶中，在37℃培养28小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用；将上述培养的种子液混合制得菌种原液，其中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的重量比例为40：30：15：15。将以上称取的菌种原液、糖蜜、硫酸铵和混合好的发酵原料按照10：5：0.1：85。混合后在32℃发酵144小时；步骤3，将发酵后的产物80℃直接烘干，粉碎过筛后可得发酵成品a。实施例2本实施例一种提供修复骨质疏松人群骨骼机能的天然营养素的制备方法，其步骤包括：步骤1，将清水洗净的辣木籽和葛根分别送入粉碎设备粉碎，过100目筛，将辣木籽粉和葛根粉按照重量比例90：10混合后得到发酵原料；步骤2，首先培养枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌用作种子液：将上述的枯草芽孢杆菌转接入营养肉汤液体培养基中进行振荡培养，在35℃，转数为220rpm下振荡培养48小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。将上述的酿酒酵母菌转接入马铃薯葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，在30℃，转数为220rpm下振荡培养40小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。将上述的植物乳杆菌和发酵乳杆菌分别转接入mrs液体培养基的锥形瓶中，在35℃培养36小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用；将上述培养的种子液混合制得菌种原液，其中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的重量比例为30：30：20：20。将以上称取的菌种原液、糖蜜、硫酸铵和混合好的发酵原料按照5：5：0.5：90。混合后在30℃发酵168小时；步骤3，将发酵后的产物加入适量水，通过螺旋沉降离心机和碟式离心机离心，同样步骤再重复一次。离心所得的液体灭菌后可得发酵成品b，将发酵成品b经过真空冷冻干燥，得发酵成品c。性能测试1选用24只体重(74.38±0.63)g、生长状况良好的清洁级雄性sd大鼠，随机分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复4只。对照组饲喂基础日粮，实验组在基础日粮中添加0.5％实施例一制得的发酵成品a，试验期10周。测量股骨湿重、干重和股骨长，以及腰椎骨骨密度(bmd)。实验方法骨骼的采集与测定：(1)股骨长度和重量：将大鼠处死，分离左侧后肢股骨，剔除表面肌肉与结缔组织后，以游标卡尺测量股骨长度，称取股骨重(湿重)后，105℃烘干，称重(干重)。(2)腰椎骨密度:剥离并取下第2～第5腰椎骨(l2～l5)，剔干净骨周边肌肉，将纱布用生理盐水沾湿，包裹住骨样品，外面再包裹一层锡箔纸，防止水分蒸发，存放在-20℃冰箱备用，用于测定骨密度。从-20℃冰箱中取出腰椎骨(l2～l5)，室温自然解冻，用hologicdiscoverya密度仪测定骨密度(bmd)。统计学处理：所有数据均以“平均值±标准差”表示，采用spss17.0软件进行分析。组间差异显著性采用t检验，以p＜0.05为显著性差异标准，以p＜0.01为极显著性差异标准。结果如下：表1不同处理大鼠股骨生长和腰椎骨密度(n＝12)项目股骨湿重(g)股骨干重(g)侧股骨长(cm)腰椎骨密度(g/cm2)对照组0.99±0.120.68±0.073.55±0.090.249±0.18实验组1.10±0.19*0.75±0.053.67±0.05**0.269±0.15**注：与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01由表1可知，与对照组相比，实验组大鼠股骨湿重提高了10％(p＜0.05)，股骨干重提高了9.3％(p＝0.05388)，股骨长度增长了3.3％(p＜0.01)，实验组大鼠的l2～l5腰椎骨密度提高了8.03％(p＜0.01)。由上述实验结果可知，大鼠日粮中添加辣木籽和葛根发酵物可显著促进大鼠骨骼生长，提高骨骼强度。性能测试2选用24只体重(73.58±0.54)g、生长状况良好的清洁级雄性sd大鼠，随机分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复4只。对照组饲喂基础日粮，实验组在基础日粮中添加0.1％实施例二制得的发酵成品c，试验期10周。测定血清中钙、磷含量和碱性磷酸酶活性。实验方法血样的采集与测定：试验第10周，禁食24h，按0.3ml/100g腹腔注射10％水合氯醛麻醉后心脏取血，3000r/min离心15min，取血清分装于eppendorf管中，-80℃冷冻保存待测。血清中钙、磷含量分别采用钙测定试剂盒(比色法)和磷测定试剂盒(磷钼酸法)测定，碱性磷酸酶活性采用碱性磷酸酶测定试剂盒(微板法)测定。以上试剂盒均由南京建成生物研究所生产，操作严格按相应试剂盒说明书进行。统计学处理：所有数据均以“平均值±标准差”表示，采用spss17.0软件进行分析。组间差异显著性采用t检验，以p＜0.05为显著性差异标准，以p＜0.01为极显著性差异标准。结果如下：表2辣木发酵物对大鼠血中钙、磷含量与碱性磷酸酶活性的影响(n＝12)注：与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01由表2可知，与对照组相比，实验组大鼠血清中ca含量降低了18.4％，差异极显著(p＜0.01)，血清p含量显著提高(p＜0.05)，而且实验组的[ca]×[p]也有显著提高(p＜0.01)。实验组与对照组血清中碱性磷酸酶活性并无显著差异(p＞0.05)。由上述实验结果可知，大鼠日粮中添加辣木籽和葛根发酵物可显著促进大鼠血钙沉积于骨骼中，可以改善骨质疏松人群的骨骼机能。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页12