本发明涉及一种强化辅助降血脂功能的蚕蛹油脂制备方法与应用。
背景技术：
：蚕蛹油脂具有辅助降血脂的功能，专利cn108094551a利用蚕蛹油脂开发了一种能够降低血脂的蚕蛹油奶片，通过在奶粉中添加2-10％的蚕蛹油制成奶片，该奶片能够降低血脂、胆固醇，改善肝功能。蚕蛹油脂中具有辅助降血脂功能的主要成分为α-亚麻酸(ala)的甘油酯、磷脂和脂溶性维生素及甾醇类物质。α-亚麻酸(ala)属n-3系列多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸之一，也是人体内合成epa、dha的前体。富含ala的甘油酯和磷脂对人体多种疾病尤其是对调节血脂、降低血压、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等有着特殊的疗效。近期研究发现，含有ala的甘油二酯具有更高效的降血脂、减肥功能。甘油二酯(diglyceride，简称dg)是天然存在的油脂成分，2000年底，美国食品与药品管理局(fda)经过安全审查将甘油二酯列入了公认安全性食品形式。以甘油二酯为主要成分的食用油脂，是目前广受关注的一种健康食用油，替代普通食用油脂后具有降低内脏脂肪、抑制体重增加、降低血液中中性脂肪含量的作用，可用于预防与治疗高脂血症及与高脂血症密切相关的心脑血管疾病，如动脉硬化、冠心病、中风、脑血栓、肥胖、脂肪肝等。富含α-亚麻酸的甘油二酯，可以将两者优点结合，作为膳食补充剂食用时，具有更高效的降血脂、减肥功效。天然动植物油脂一般以甘油三酯为主要成分，甘油二酯含量很低，一般不超过10％。蚕蛹油脂是一类特殊的昆虫油脂，其脂类物质中富含ala成分(25-50％)。蚕蛹油脂的主要成分也是甘油三酯(约为85-97％)，甘油二酯的含量一般不超过3％。研究表明，以天然动植物油脂为原料进行部分水解或醇解制备甘油二酯，是最具有经济性的工艺途径。专利zl200610035743.8公开了一种全酶法生产甘油二酯的方法，利用具有sn-1(3)位特异性脂肪酶对脂肪或油进行水解，水解度为20～55％，得到的水解产物经分子蒸馏或短程蒸馏，得到主要成份为甘油二酯和甘油三酯的高温馏分。专利zl200710030273.0公开了一种甘油二酯的制备方法，利用具有sn-1(3)位特异性的磷脂酶a1催化动植物油脂发生部分水解反应，产生甘油二酯。zl1208305c公开了一种甘油二酯的生产方法，是将乙醇或甲醇和甘油三酯混合后，在固定化脂肪酶作用下进行部分醇解反应，将反应产物分离得到甘油二酯。研究发现，与其他ala型动植物油脂相比，蚕蛹油脂中的ala更倾向于分布在甘油三酯的sn-2位。这一结构特征，使得其更适于利用sn-1(3)位特异性脂肪酶催化适度水解或醇解反应制备甘油二酯。但是，蚕蛹油脂中一般含有1.5％-2.5％的磷脂，脂肪酶催化的油脂水解反应是界面反应，脂肪酶分布于油水界面的水相，磷脂比甘油三酯更易于分布于界面上，优先于甘油三酯发生水解反应，并随水相的分离而大量损失。因此，脂肪酶催化的部分水解反应不适用于蚕蛹油脂的改性处理。醇解反应一般使用固定化脂肪酶在非水相体系中进行，避免了磷脂的水解，但是也存在着磷脂被脂肪酶催化醇解的风险。而且，提取得到的蚕蛹油脂中，一般含有2-8％的游离脂肪酸，严重影响了蚕蛹油脂的氧化稳定性，需在反应过程或分离过程中将游离脂肪酸含量降至安全水平。技术实现要素：针对现有的蚕蛹油脂产品氧化稳定性差，现有油脂酶法改性技术不适用于蚕蛹油脂改性的缺点，本发明提供一种改性蚕蛹油脂及其制备方法。在本发明中，通过疏水性材料固定的脂肪酶催化蚕蛹油脂中的甘油三酯进行醇解反应，游离脂肪酸进行酯化反应，制备氧化稳定性更好，降血脂功效更佳的改性蚕蛹油脂。本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种改性蚕蛹油脂的制备方法，包括如下步骤：(1)以干燥的蚕蛹为原料，粉碎后利用溶剂萃取，得到含蚕蛹油脂和溶剂的萃取液，且萃取液中水分含量不高于0.5％；(2)在萃取液中加入固定化脂肪酶，不断添加乙醇，控制反应体系水分含量不高于2％，在搅拌条件下，进行醇解反应；其中蚕蛹油脂中的甘油三酯和游离脂肪酸分别发生部分乙醇解反应和酯化反应，产生甘油二酯；(3)分离回收脂肪酶，回收溶剂，将得到的油相进行分子蒸馏，除去反应产生的脂肪酸乙酯，获得改性蚕蛹油脂。优选地，步骤(2)所述固定化脂肪酶为吸附固定在疏水性材料上的具有sn-1(3)位专一性的脂肪酶，所述固定化疏水性材料为聚苯乙烯基大孔吸附树脂。优选地，步骤(2)所述固定化疏水性材料为ab-8大孔非极性吸附树脂，脂肪酶为lipaset1。固定化脂肪酶优选为吸附固定在疏水性材料上的lipaset1。优选地，步骤(2)所述固定化脂肪酶的添加量为油脂质量的1％-8％；乙醇的添加量为油脂质量的5％-10％。优选地，步骤(2)所述乙醇在3-4h内均匀添加完成，醇解反应时间为5-8h。优选地，所述乙醇的添加量为油脂质量的7％-8％；醇解反应时间为5-6h。优选地，步骤(3)所述分子蒸馏的温度不高于140℃，操作压强不高于10pa。优选地，步骤(3)所述分子蒸馏的温度不高于130℃，操作压强不高于1pa。上述方法制备的改性蚕蛹油脂，其中甘油三酯的含量不高于55％，甘油二酯含量不低于45％，游离脂肪酸含量不高于0.5％，总脂肪酸组成中ala比例不低于35％。而且，改性前后原料中的磷脂、维生素e、甾醇等脂溶性活性物质，没有损失。本课题组研究发现，蚕蛹油脂含有大量的α-亚麻酸，是制备富含α-亚麻酸甘油二酯的理想原料。但是，由于α-亚麻酸的不稳定性，将蚕蛹油脂提取精炼后再进行部分水解时，由于精炼过程损失了大量原有的功能性成分，特别是磷脂、维生素e、甾醇等。以提取得到的蚕蛹油脂为原料，直接进行酶法改性，制备富含ala甘油二酯的改性蚕蛹油脂。将具有甘油酯位置专一性的脂肪酶吸附在疏水性材料上，用于石油醚、乙醇解体系中时，可以避免磷脂类物质的损失。在改性蚕蛹油脂的同时保留磷脂等其他生物活性物质，可以提高蚕蛹油脂的降血脂功能和产品的氧化稳定性。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明利用蚕蛹油脂为底物，通过固定化脂肪酶催化制备富含α-亚麻酸(ala)的甘油二酯的改性蚕蛹油脂，提高了蚕蛹油脂的降血脂功能和氧化稳定性。同时，改性蚕蛹油脂的游离脂肪酸含量降低，维生素e、甾醇及α-亚麻酸磷脂等其他活性物质含量比蚕蛹油原料高。(2)本发明方法制造改性蚕蛹油脂，不需要将蚕蛹油精炼，并且简化了工艺过程，具有更好的经济性和环保性。具体实施方式以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，所有百分比均以质量计。实施例1称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到蚕蛹油脂526g，其中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。在萃取液中添加30g以ab-8树脂吸附固定化的脂肪酶lipaset1，将萃取液置于5000ml的三口平底烧瓶中，在35℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行醇解反应。利用蠕动泵，将48g乙醇，在3h内均匀地添加到反应体系中。在乙醇添加完成后继续反应2h，然后分离回收脂肪酶，低温(40℃)真空蒸发回收石油醚，将得到的油相进行分子蒸馏纯化。分子蒸馏(德国vta公司/vkl70-5fdrr分子蒸馏装置)蒸发面温度为140℃，进料速度为30g/min，压强为16pa。获得改性后的蚕蛹油脂，经检测分析，其甘油三酯含量为49.07％，甘油二酯含量为48.67％，游离脂肪酸含量为0.11％，磷脂含量为1.93％，维生素e含量为0.034％，总甾醇含量为0.2％。按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，评估其氧化稳定性，得osi值为6.27h。该产品记为实施例1。实施例2称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到蚕蛹油脂520g，其中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。在萃取液中添加45g以ab-8树脂吸附固定化的脂肪酶lipaset1，将萃取液置于5000ml的三口平底烧瓶中，在35℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行醇解反应。利用蠕动泵，将50g乙醇，在3h内均匀地添加到反应体系中。在乙醇添加完成后继续反应2h，然后分离回收脂肪酶，低温(40℃)真空蒸发回收石油醚，将得到的油相进行分子蒸馏纯化。分子蒸馏(德国vta公司/vkl70-5fdrr分子蒸馏装置)蒸发面温度为130℃，进料速度为30g/min，压强为1.4pa。获得改性后的蚕蛹油脂，经检测分析，其甘油三酯含量为48.23％，甘油二酯含量为49.47％，游离脂肪酸含量为0.17％，磷脂含量为1.97％，维生素e含量为0.039％，总甾醇含量为0.21％。按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，评估其氧化稳定性，得osi值为7.03h。该产品记为实施例2。实施例3称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到蚕蛹油脂531g，其中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。在萃取液中添加50g以ab-8树脂吸附固定化的脂肪酶lipozymetl100l(诺维信公司提供)，将萃取液置于5000ml的三口平底烧瓶中，在35℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行醇解反应。利用蠕动泵，将50g乙醇，在3h内均匀地添加到反应体系中。在乙醇添加完成后继续反应3h，然后分离回收脂肪酶，低温(40℃)真空蒸发回收石油醚，将得到的油相进行分子蒸馏纯化。分子蒸馏(德国vta公司/vkl70-5fdrr分子蒸馏装置)蒸发面温度为130℃，进料速度为30g/min，压强为1.0pa。获得改性后的蚕蛹油脂，经检测分析，其甘油三酯含量为49.02％，甘油二酯含量为48.74％，游离脂肪酸含量为0.15％，磷脂含量为1.99％，维生素e含量为0.037％，总甾醇含量为0.20％。按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，评估其氧化稳定性，得osi值为6.32h。该产品记为实施例3。对比实施例1称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后利用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到的蚕蛹油脂中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。将萃取液在低温真空下分离回收石油醚即得到未改性的蚕蛹油脂。按照按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，其氧化诱导时间(osi)为2.78h。该产品记为对比实施例1。对比实施例2称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后利用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到蚕蛹油脂522g，萃取得到的蚕蛹油脂中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。在萃取液中添加30g以环氧树脂8285吸附固定化的脂肪酶lipaset1(专利cn106906194a中所述方法)，将萃取液置于5000ml的三口平底烧瓶中，在35℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行醇解反应。利用蠕动泵，将50g乙醇，在3h内均匀地添加到反应体系中。在乙醇添加完成后继续反应2h，然后分离回收脂肪酶，低温(40℃)真空蒸发回收石油醚，将得到的油相进行分子蒸馏纯化。分子蒸馏(德国vta公司/vkl70-5fdrr分子蒸馏装置)蒸发面温度为130℃，进料速度为30g/min，压强为1.5pa。获得改性后的蚕蛹油脂，经检测分析，其甘油三酯含量为52.6％，甘油二酯含量为45.3％，游离脂肪酸含量为0.21％，磷脂含量为0.43％，维生素e含量为0.038％，总甾醇含量为0.21％。按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，评估其氧化稳定性，得osi值为4.61h。该产品记为对比实施例2。对比实施例3称取2000g的干蚕蛹(水分含量低于5％)，经粉碎后利用2000ml石油醚分两次萃取其中的油脂。分离回收萃取液(溶剂和油脂)及蚕蛹渣，经检测分析，萃取得到蚕蛹油脂529g，萃取得到的蚕蛹油脂中甘油三酯含量为88.3％，甘油二酯含量为1.92％，游离脂肪酸含量为7.84％，磷脂含量为1.5％，维生素e含量为0.029％，总甾醇含量为0.15％。在萃取液中添加10g的磷脂酶a1的酶液，将萃取液置于5000ml的三口平底烧瓶中，在35℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行醇解反应。利用蠕动泵，将45g乙醇，在3h内均匀地添加到反应体系中。在乙醇添加完成后继续反应2h，然后分离脂肪酶，低温(40℃)真空蒸发回收石油醚，将得到的油相进行分子蒸馏纯化。分子蒸馏(德国vta公司/vkl70-5fdrr分子蒸馏装置)蒸发面温度为130℃，进料速度为30g/min，压强为1.5pa。获得改性后的蚕蛹油脂，经检测分析，其甘油三酯含量为63.2％，甘油二酯含量为43.7％，游离脂肪酸含量为0.37％，磷脂含量为0.02％，维生素e含量为0.024％，总甾醇含量为0.12％。按照《gb/t21121-2007动植物油脂氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》方法，在100℃，其氧化诱导时间(osi)为3.54h。该产品记为对比实施例3。参照现行的《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中的“降血脂保健食品的功能评价”中辅助降血脂功能评方法，利用动物实验开展油脂组合物的辅助降血脂效果。通过大鼠试验评价制备得到实施例1-3及对比例1-3的蚕蛹油脂降血脂功能的差异。(1)试验分组将80只spf级wistar大鼠(200g左右)在23℃湿度为55％的环境下适应7天，适应期间全部喂养基础饲料和饮用水，自由取食。适应期后将80只大鼠随机分为8组(空白对照组、模型对照组、实施例1-3及对比例1-3)，每组10只，淘汰体重较平均值低以及病态的大鼠。其中空白组在实验期间喂养基础饲料，剩余组均喂养高脂饲料(78.8％基础饲料，1％胆固醇,0.2％胆盐3号，10％蛋黄粉，10％猪油)。每天对大鼠进行灌胃处理，其中空白对照组、模型对照组灌胃2.5mmol/l的吐温-80溶液(10ml/(kg·bw)、实施例1-3及对比例1-3灌胃用2.5mmol/l的吐温-80溶液溶解的蚕蛹油，剂量为2ml/(kg·bw)，每组10只大鼠。(2)模型建立以高脂饲料(78.8％的基础饲料，1％的胆固醇，10％的猪油，10％的蛋黄粉以及0.2％的胆盐3号连续饲养大鼠4-6周，使其血清胆固醇达到3.77士0.41mmol/l即建模成功。(3)建模成功后，按照(1)所示各组处理方法喂养动物6周即42天后，对大鼠采取摘除眼球法取血，随后引颈处死。采集的血液立即离心，取上层血清测定其总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)。表1改性蚕蛹油脂降血脂功能评价组别tc(mmol/l)ldl-c(mmol/l)ldl-c/hdl-c(mmol/l)空白组2.48±0.33d0.74±0.31c0.51±0.25d模型组3.77±0.41a2.08±0.37a1.58±0.47a实施例12.01±0.35c0.27±0.64b0.19±0.12bc实施例22.04±0.44d0.36±0.22c0.23±0.21d实施例32.03±0.58d0.45±0.31c0.29±0.27d对比例12.34±0.58d0.51±0.36c0.34±0.37d对比例22.04±0.38d0.43±0.21c0.29±0.28d对比例32.14±0.52d0.53±0.37c0.35±0.32d通过动物试验观察发现，与模型组相比，实施例1-3及对比例1-3灌胃蚕蛹油脂组大鼠的低密度脂蛋白含量、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白含量之比降低明显，差异显著(p<0.05)；与模型组相比，实施例1-3及对比例1-3蚕蛹油脂组大鼠血清中总胆固醇降低明显(p<0.05)；说明蚕蛹油脂可以显著降低高脂大鼠血清中的总胆固醇含量和低密度脂蛋白含量。与空白组相比，实施例2,3血清中总胆固醇含量和低密度脂蛋白含量差异不显著(p>0.05)且实施例1血清中总胆固醇含量和低密度脂蛋白含量差异显著(p<0.05)，说明通过灌胃实施例1-3制备的蚕蛹油脂可以使高脂大鼠血脂恢复到正常水平。同时，相比于对比例1，实施例1-3灌胃大鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白含量及低密度脂蛋白与高密度脂蛋白含量之比差异显著(p<0.05)，说明实施例1-3降血脂效果显著好于对比例1(未改性蚕蛹油脂)。实验结果表明，通过本发明所述方法制备得到的蚕蛹油脂具有降血脂功效，且实施例1-3制备得到的蚕蛹油脂降血脂效果好于对比例1-3。当前第1页12