本发明属于动物饲料制备技术领域，具体涉及一种利用玉米酒精糟和废弃豆渣发酵生产动物饲料的方法。
背景技术：
在以玉米为原料发酵制取乙醇过程中，其中的淀粉被转化成乙醇和二氧化碳，其他营养成分如蛋白质、脂肪、纤维等均留在酒糟中。同时由于微生物的作用，酒糟中蛋白质、b族维生素及氨基酸含量均比玉米有所增加，并含有发酵中生成的未知促生长因子。市场上的玉米酒糟蛋白饲料产品有两种：一种为ddg，是将玉米酒精糟作简单过滤，滤渣干燥，滤清液排放掉，只对滤渣单独干燥而获得的饲料；另一种为ddgs，是将滤清液干燥浓缩后再与滤渣混合干燥而获得的饲料。
豆渣是豆奶或豆腐生产过程中产生的副产物，富含膳食纤维、蛋白质、脂肪、磷脂和甾醇类化合物、维生素及磷、铁、钙等多种营养物质，营养价值极高。豆渣具有抗氧化、预防糖尿病、肥胖症及结肠癌、改善便秘、提高免疫力等多种功能，越来越多地受到人们的关注。目前已有人使用豆渣作为食品辅料，制作了馒头、面包、豆渣蛋糕、豆渣饼干及豆渣饮料等食品。中国是豆腐生产大国，每年会产生大量的豆渣废弃物。据不完全统计，我国每年湿豆渣的产生量高于2千万吨，但其利用率却极低，大部分豆渣被当做废弃物直接扔掉，造成环境污染和资源浪费。玉米酒精糟和豆渣共同提供菌种发酵所需的氮源，利用加入的葡萄糖作为碳源，使得发酵效果更加有效。枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌可以降解玉米酒精糟和豆渣中的蛋白、淀粉、纤维素等组分，分解成小分子糖、小分子蛋白、小肽、游离氨基酸等易消化的成分，更利于畜禽肠道吸收。
在动物体内，枯草芽孢杆菌能够消耗肠道内氧气而为厌氧丁酸梭菌提供无氧环境并促使丁酸梭菌黏附在动物肠上皮细胞，丁酸梭菌会利用空间占位和产生有机酸、产生抑菌物质，抑制动物肠道病原菌的生长，从而来有效调节肠道菌群的生态平衡，保持机体健康，可以改善宿主肠道细菌生态系统的平衡。长期使用富含益生菌的饲料，能够改善畜禽的肠道环境，增强动物免疫力，促进动物生长的明显效果，有效地保障家畜产品的食用安全性。
饲料的生物合成大多采用单一菌种或组合菌种混合发酵，从目前的研究和应用来看，混合发酵的效果要优于单菌种发酵的效果。混合发酵利用了微生物种间协作、协同互生的特性，多个菌种之间可互相补偿其缺陷，共同生长，对发酵基质进行完全的分解利用。虽然玉米酒精糟和豆渣各自有其处理的方式，目前的报道中尚未出现将两者混合一起用益生菌进行发酵的先例。将二者共同发酵处理，能提高处理效率，改善处理效果，降低成本，进一步实现资源化利用的需求，具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用玉米酒精糟和废弃豆渣发酵生产动物饲料的方法，通过混合菌种发酵，可以极大的提升蛋白质和氨基酸含量。涉及的菌种包括枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，保藏号cgmccno.13932；丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)，保藏号cgmccno.1.5205。
为实现本发明的目的，具体包括如下步骤：
一种利用玉米酒精糟和废弃豆渣混菌发酵生产动物饲料的方法，包括如下步骤：
1)将玉米酒精糟和废弃豆渣进行粉碎处理，使其颗粒均匀，置于阳光下晾晒12～24h，使其含水量为15％～30％；
2)将处理后玉米酒精糟和废弃豆渣混合，处理后的玉米酒精糟和废弃豆渣的质量比为(1～3)：(1～3)，加入含有2％葡萄糖的水溶液混合均匀，制成固体发酵培养基；
3)将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌菌株单独液态发酵后按照体积比(1～3)：(1～3)进行混合配比，将混合配比后的液体菌种按照2％～10％(v/w)接入固体发酵培养基中，置于发酵罐中，发酵温度25℃～50℃，先好氧发酵12h-24h，通入空气量0.2～1(v/v·m)，然后再厌氧发酵24h～60h，通入氮气量0.2～1(v/v·m)，发酵结束后，低温烘干发酵产物即得到动物饲料。
所述制备得到的动物饲料中，总活菌数≥3.8×109cfu/g。
所使用的玉米酒精糟为以玉米为原料发酵生产乙醇后的废弃物，所使用的废弃豆渣为生产豆腐或豆奶的副产品。
所述固体发酵培养基中处理后的玉米酒精糟和废弃豆渣的质量比为(1～3)：(1～3)，更优选地，处理后的玉米酒精糟和废弃豆渣的质量比为2：3。
枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌菌株单独液态发酵后按照体积比(1～3)：(1～3)混合配比,更优选地，枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌菌株单独液态发酵后按照体积比1：2进行混合配比。
所述枯草芽孢杆菌单独液态发酵的方法，包括如下步骤，
(1)菌株固体、液体培养基枯草芽孢杆菌液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，定容至1000ml；
固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
灭菌方法：进行高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
(2)菌株固体平板培养从-80℃冰箱中取出枯草芽孢杆菌的甘油管，在超净台中用100ml移液枪吸取100ml菌液，在固体培养基平板上涂布，将枯草芽孢杆菌置于37℃培养箱过夜培养，在平板上刮取一环菌群，三区划线划到平板上，将枯草芽孢杆菌置于37℃培养箱过夜培养，刮取单菌落在平板上进行密集划线。
(3)菌株液体种子液培养刮取一整块密集划线的枯草芽孢杆菌菌群接入含100ml培养基的500ml摇瓶中，放入37℃摇床，200rpm，培养约8h。
所述丁酸梭菌菌株单独液态发酵的方法，包括如下步骤：
(1)菌株固体、液体培养基丁酸梭菌液体培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，氯化钠5g，葡萄糖4g，无水乙酸钠3g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，定容至1000ml，ph7.2-7.4；
固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
灭菌方法：进行高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
(2)菌株固体平板培养从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌的甘油管，在超净台中用100ml移液枪吸取100ml菌液，在固体培养基平板上涂布，将丁酸梭菌置于37℃厌氧培养箱培养24h，在平板上刮取一环菌群，三区划线划到平板上，将丁酸梭菌置于37℃厌氧培养箱培养24h，刮取单菌落在平板上进行密集划线。
(3)菌株液体种子液培养刮取一整块密集划线的丁酸梭菌菌群接入含300ml培养基的500ml摇瓶中，通入氮气，放入37℃厌氧培养箱，静置培养12h。
所述枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌菌株单独液态发酵后固体发酵的方法，将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌菌株单独液态发酵的种子液按照体积比(1～3)：(1～3)进行混合配比，将混合配比后的液体菌种按照2％～10％(v/w)接入固体发酵培养基中，置于发酵罐中，发酵温度25℃～50℃，先好氧发酵12h-24h，通入空气量0.2～1(v/v·m)，然后再厌氧发酵24h～60h，通入氮气量0.2～1(v/v·m)，发酵结束后，低温烘干发酵产物即得到动物饲料。
所述固体发酵制备得到的动物饲料中，总活菌数≥3.8×109cfu/g，最高可达3.8×1011cfu/g。
所述固体发酵制备得到的动物饲料中，粗蛋白含量为42％～70％，氨基酸含量有所增加，均高于国家标准(gb/t5916-2008)中动物营养需求的必须氨基酸。
本发明中检测菌剂中活菌数的方法为平板计数法。
有益效果：
本发明的产品中总活菌数可达3.8×109cfu/g，粗蛋白含量高达68％，显著提高氨基酸含量，超出国家饲料标准，更利于畜禽肠道吸收，改善畜禽的肠道环境，增强动物免疫力，有促进动物生长的明显效果，生产废弃物变废为宝，实现废弃资源的再利用，减少废弃材料对环境的污染，大大降低生产成本，经济可行，具有广阔的市场应用价值。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
以下实施例中所涉及的菌株为：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，保藏号cgmccno.13932；丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)，保藏号cgmccno.1.5205，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
以下实施例中所述玉米酒精糟和豆渣，由中粮生物化学(安徽)股份有限公司提供。
以下实施例中所述处理后的玉米酒精糟和豆渣，其处理方法为：粉碎处理，使其颗粒均匀，置于阳光下晾晒12～24h，使其含水量为15％～30％。将处理后玉米酒精糟和废弃豆渣混合，处理后的玉米酒精糟和废弃豆渣的质量比为(1～3)：(1～3)，加入含有2％葡萄糖的水溶液混合均匀，lkg的固体培养基中含有100ml的葡萄糖水溶液，制成固体发酵培养基。
枯草芽孢杆菌单独液态发酵：
液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，定容至1000ml；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
从-80℃冰箱中取出枯草芽孢杆菌的甘油管，在超净台中用100ml移液枪吸取100ml菌液，在固体培养基平板上涂布，将枯草芽孢杆菌置于37℃培养箱过夜培养，在平板上刮取一环菌群，三区划线划到平板上，将枯草芽孢杆菌置于37℃培养箱过夜培养，刮取单菌落在平板上进行密集划线。
刮取一整块密集划线的枯草芽孢杆菌菌群接入含100ml培养基的500ml摇瓶中，放入37℃摇床，200rpm，培养8h。
丁酸梭菌菌株单独液态发酵：
液体培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，氯化钠5g，葡萄糖4g，无水乙酸钠3g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，定容至1000ml，ph7.2-7.4；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌的甘油管，在超净台中用100ml移液枪吸取100ml菌液，在固体培养基平板上涂布，将丁酸梭菌置于37℃厌氧培养箱培养24h，在平板上刮取一环菌群，三区划线划到平板上，将丁酸梭菌置于37℃厌氧培养箱培养24h，刮取单菌落在平板上进行密集划线。
刮取一整块密集划线的丁酸梭菌菌群接入含300ml培养基的500ml摇瓶中，通入氮气，放入37℃厌氧培养箱，静置培养12h。
实施例1
本实施例对枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌的接种比例进行了考察，分别按照5％(v/w)接种量将不同比例的枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌的种子液接入玉米酒精糟和豆渣比例为2:3的固体发酵培养基中，置于发酵罐中，发酵温度35℃，先好氧发酵24h，通入空气量0.5(v/v·m)，然后再厌氧发酵48h，通入氮气量0.5(v/v·m)。枯草芽孢杆菌：丁酸梭菌比例分别为1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、2:3、3:2，测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、粗脂肪(干基计)、粗纤维(干基计)，结果见表1。由表1所知，枯草芽孢杆菌在总菌落数中起到关键作用，有枯草芽孢杆菌比没有枯草芽孢杆菌的菌落数更高，但枯草芽孢杆菌过多时，会过多的分解粗蛋白，反而饲料效果会有所下降，所以最佳种子液比例为1:2。
表1不同菌种比例对发酵产物各理化指标的影响
实施例2
本发明对固体发酵培养基中玉米酒精糟和豆渣的比例进行了考察，将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌比例为1:2的液体种子液，按照5％(v/w)接种量加入不同比例的固体发酵培养基中，置于发酵罐中，发酵温度35℃，先好氧发酵24h，通入空气量0.5(v/v·m)，然后再厌氧发酵48h，通入氮气量0.5(v/v·m)。玉米酒精糟：豆渣比例分别为0:1、1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、2：3，测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、粗脂肪(干基计)、粗纤维(干基计)，结果见表2。由表2所知，单独玉米酒精糟或者单独豆渣实验，发酵产物的各理化指标很低，当比例为2:3时，总菌落数和粗蛋白含量达到最高，所以最佳玉米酒精糟和豆渣的比例为2:3。
表2不同固体培养基对发酵产物各理化指标的影响
实施例3
本发明对固态发酵时间进行了考察，将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌比例为1:2的液体种子液，按照5％(v/w)接种量加入玉米酒精糟和豆渣的比例为2:3的固体培养基中，发酵温度35℃，好氧发酵时通入空气量0.5(v/v·m)，厌氧发酵时通入氮气量0.5(v/v·m)，发酵时间分别为a：前期好氧0h，后期厌氧72h；b：前期好氧12h，后期厌氧60h；c：前期好氧24h，后期厌氧48h；d：前期好氧36h，后期厌氧36h；e：前期好氧48h，后期厌氧24h。测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、粗脂肪(干基计)、粗纤维(干基计)，结果见表3。由表3所知，完全好氧和完全厌氧环境时菌落数处于很低的状态，适当的好氧时间和厌氧时间使得各理化性质达到较好的状态，所以最佳固态发酵时间为前期好氧24h，后期厌氧48h。
表3不同固体发酵时间对发酵产物各理化指标的影响
实施例4
本发明将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌比例为1:2的液体种子液，按照5％(v/w)接种量加入玉米酒精糟和豆渣的比例为2:3的固体培养基中，置于发酵罐中，发酵温度35℃，先好氧发酵24h，通入空气量0.5(v/v·m)，然后再厌氧发酵48h，通入氮气量0.5(v/v·m)，将发酵产物低温烘干即得动物饲料。对发酵产物中的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、粗脂肪(干基计)、粗纤维(干基计)、赖氨酸、蛋氨酸含量进行了测量，与未发酵的原料进行了对比，结果见表4结果表明发酵产物中总菌落数达到3.87×1011cfu/g，粗蛋白质(干基计)含量可达67.34％，粗脂肪(干基计)含量可达5.86％，粗纤维(干基计)可减少至2.32％，赖氨酸含量可达1.58％，蛋氨酸含量可达0.93％，均超出国家标准(gb/t5916-2008)，具有广阔的市场前景。
表4发酵产物指标检测结果
实施例5
本发明对动物饲料在家畜养殖中的应用进行了考察。将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌比例为1:2的液体种子液按照5％(v/w)接种量接入玉米酒精糟和豆渣的比例为2:3的固体培养基中，置于发酵罐中，发酵温度35℃，先好氧发酵24h，通入空气量0.5(v/v·m)，然后再厌氧发酵48h，通入氮气量0.5(v/v·m)，将发酵产物低温烘干即得饲料成品。以石家庄市纯源生物科技有限公司的ddgs饲料作为空白对照组，以本发明的发酵饲料作为试验组进行试验。仔猪自由采食，饲喂30天，饲喂结果如表5。
表5本发明动物饲料对断奶仔猪的影响
由表5可以看出：和空白对照组相比，喂食本发明的饲料的试验组断奶仔猪日增重提高41.11％，料肉比降低33.15％，腹泻率降低57.14％，成活率提高8.11％。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。