一种含乳双歧杆菌BL-99的固体饮料及其应用的制作方法

本发明涉及一种包含益生菌的固体饮料及其应用，具体是指一种含乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99的固体饮料及其在促进肠道消化、通便等方面的应用。
背景技术：
：在生活节奏日益加快的今天，不规律的饮食，频繁的商务出差，不够充足的睡眠，以及不可避免地饮酒都严重伤害了人体消化系统。而消化系统的失衡则更多会带来一系列的肠道问题：便秘、腹泻、腹痛、肠鸣、排气……而如果肠道蠕动变慢，粪便滞留在肠道内不能及时排出，粪便在肠道内产生有害物质，严重影响人体健康。调查结果显示，在790名亚裔女性中，37.4％的女性受便秘困扰。研究表明，摄入益生菌能够缩短结肠运载时间，同时对调节肠道菌群，改善受试者胃肠道紊乱具有一定帮助。而结肠运载时间可定义为食物通过吞咽、消化、吸收和排泄所需要的时间。胃肠道的健康及患病有时与结肠运载时间相关。结肠运载缓慢即代表了便秘等症状。技术实现要素：本发明发现了一种乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99具有促进肠道消化的功效，并据此提供了一种含有所述乳双歧杆菌bl-99的固体饮料。根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99，已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99具有耐胃酸和耐肠液性能，在ph2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在ph6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。本发明的研究发现，乳双歧杆菌bl-99(即保藏编号为cgmccno.15650的乳双歧杆菌)菌株单菌即具有促进肠道消化的功效，能够促进肠道蠕动，增加胃蛋白酶排出量。进一步，本发明提供了一种固体饮料组合物，以固体饮料的总重量为100％计，其原料组成中包括：保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)或其活性物质0.1％～50％；麦芽糊精10％～20％。根据本发明的具体实施方案，本发明的固体饮料组合物中，所述活性物质是保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌发酵培养产物，包括但不限于：包含菌体的发酵培养液、去除菌体后的发酵上清液、或从发酵培养液中提取的活性物质等。本发明的乳双歧杆菌bl-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如tpy培养基、bbl培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。本发明同时提供了一种乳双歧杆菌bl-99菌发酵培养产物的制作方法，其是将所述的菌株在液态发酵培养基中厌氧培养，获得包含菌体的发酵液。发酵液可直接或进一步浓缩后作为液态菌制剂，也可将发酵液干燥后制备菌粉，或是从发酵液中分离出菌体制备菌粉。本发明的液态菌制剂也可以是将菌体重悬于培养液、缓冲液或去离子水等溶剂后的液态制剂。本发明的bl-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)可以以活菌形式保存，在保藏期具有较好的稳定性。本发明的bl-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)也可以以灭活的死菌形式保存。所述的菌制剂可以用于制备本发明的固体饮料。根据本发明的优选具体实施方案，所述保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌在所述固体饮料中是以活菌形式存在。根据本发明的具体实施方案，本发明的固体饮料组合物中，所述保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌在饮料组合物中的含量为1.0×103cfu～1.0×1011cfu/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～100mg/天。根据本发明的优选具体实施方案，本发明的固体饮料组合物中，所述保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌在固体饮料中的含量为108cfu～1010cfu/g，或者以菌体的重量计为0.01μg～10mg/天。根据本发明的具体实施方案，本发明的固体饮料组合物中，麦芽糊精可以有利于维持产品在货架期内的活菌数。根据本发明的具体实施方案，本发明的固体饮料组合物中，还可包括现有益生菌固体饮料的一些常规组分。在本发明的一些具体实施方案，本发明的固体饮料的原料组成还包括低聚果糖、低聚木糖、赤藓糖醇中的一种或多种。根据本发明的具体实施方案，本发明的固体饮料组合物还包括余量的水果粉。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的固体饮料组合物，以该固体饮料的总重量为100％计，其原料组成包括：保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌或其活性物质0.1～50％；麦芽糊精10％～20％；低聚果糖5％～50％；低聚木糖5％～20％；赤藓糖醇5％～20％；水果粉余量。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的固体饮料组合物中，所述水果粉为柳橙水果粉，其在固体饮料组合物中的含量为5％～20％。本发明的固体饮料的制备方法可参照现有益生菌固体饮料的制备技术进行。通常，将所述组合物的各组分混合均匀，即可得到本发明的固体饮料。另一方面，本发明还提供了所述的固体饮料组合物在制备具有促消化和/或通便功效的固体饮料中的应用。本发明的固体饮料，因包含所述的乳双歧杆菌bl-99而具有相应的促进肠道消化的功效，能够促进肠道蠕动，增加胃蛋白酶排出量。本发明的固体饮料具有较好的排便功效。附图说明图1显示乳双歧杆菌bl-99对墨汁推进率(％)的影响。图2显示乳双歧杆菌bl-99对大鼠胃液量的影响。图3显示乳双歧杆菌bl-99对大鼠胃蛋白酶活性的影响。图4显示乳双歧杆菌bl-99对大鼠胃蛋白酶排出量的影响。图5为本发明一具体实施例中的发酵工艺流程示意图。图6显示本发明的bl-99固体饮料对排便、消化影响(人体试食问卷结果)。专利程序的微生物保存：本发明的乳双歧杆菌bl-99：保藏日期：2018年04月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：cgmccno.15650；分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或者按照仪器制造商所建议的条件。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本发明的各实施例中，实验数据表示为mean±s.e.m.数据采用prismversion5.0(graphpad,sandiego,ca,usa)进行统计。组间差异采用one-wayanova跟随tukery’smultiplecomparisontest的方法进行统计。p<0.05时具有显著的统计学差异。实施例1：乳双歧杆菌bl-99及其性能测定本发明的乳双歧杆菌bl-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。1.乳双歧杆菌bl-99的分类学特征理化试验结果:16srrna基因序列测序结果(seqidno.1)：gctcccccacaagggtcgggccaccggcttcgggtgctacccactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcggcgttgctgatccgcgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaccggttttcagcgatccgccccacgtcaccgtgtcgcaccgcgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccccggcggtcccacatgagttcccggcatcacccgctggcaacatgcggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaaccggccccgaagggaaaccgtgtctccacggcgatccggcacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgcttaacgcgttggctccgacacgggacccgtggaaagggccccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtgacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactccagcccgcccgtacccggcgcagatccaccgttaggcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataaatccggataacgctcgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcgaacaatccactcaacacggccgaaaccgtgccttgcccttgaacaaaagcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccaatgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtgggccatcaccccgccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaagcatttcccaccccaccatgcgatggagcggagcatccggtattaccacccgtttccaggagctattccggtgcacagggcaggttggtcacgcattactcacccgttcgccactctcaccccgacagcaagctgccagggatcccgttcgact2.乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌bb-作为对比。测试方法：将乳双歧杆菌bl-99菌株于mrs液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率检测结果如表1所示，bb-12在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。表1、菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，bb-12在人工小肠液(ph6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。表2、菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率3.乳双歧杆菌bl-99的的毒力实验及安全性检测将本发明的乳双歧杆菌bl-99接种于bbl液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌bl-99活菌数为3.7×108cfu/ml，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgbw给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌bl-99的bbl培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。采用sn/t1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌bl-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌bl-99对氨苄西林ampicillin、青霉素gpenicilling、红霉素erythromycin、氯霉素chloramphenicol、克林霉素clindamycin、万古霉素vancomycin和四环素tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(europeanfoodsafetyauthority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌bl-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。4.小肠运动试验98只健康spf级babl/c小鼠，体重18-20g，由北京华阜康生物科技有限责任公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心动物房：维持室温(25±2℃)，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为7组，每组14只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表3示。表3、分组安排分组受试物人体每日剂量(cfu/天)对照组pbs--模型组pbs--bl-99极低剂量组bl-99乳双歧杆菌1×106bl-99低剂量组bl-99乳双歧杆菌1×107bl-99中剂量组bl-99乳双歧杆菌1×108bl-99高剂量组bl-99乳双歧杆菌1×109bl-99极高剂量组bl-99乳双歧杆菌1×1010适应性喂养3天后开始正式实验。以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20ml/kg，对照组与模型组灌胃给予pbs，干预时间30天。在实验期内，动物表征正常，精神及活动状况良好，每日给予受试物后未出现任何不良反应。由表4体重数据可以看出，实验周期内，各组动物体重并未出现显著差异(p＞0.05)。表4、乳双歧杆菌bl-99对小鼠体重的影响(g)图1显示乳双歧杆菌bl-99对墨汁推进率(％)的影响。如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠墨汁推进率显著低于对照组(p＜0.05)，说明成功建立小鼠小肠蠕动一致模型。与模型组比较，bl-99益生菌极低剂量组(1×106cfu/天)、低剂量组(1×107cfu/天)和高剂量组(1×108cfu/天)小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组(p＜0.05)，实验结果阳性。表明极低剂量组(1×106cfu/天)、低剂量组(1×107cfu/天)和高剂量组(1×108cfu/天)bl-99可促进小鼠肠道运动。5.bl-99与大鼠消化酶试验221只健康spf级sd大鼠，体重180-220g，由北京华阜康生物科技有限责任公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心动物房：维持室温(25±2℃)，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为17组，每组13只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表3所示。适应性喂养3天后开始正式实验。使用苦味酸对大鼠进行分组编号后，分别于给予受试物第0周、第1周、第2周、第3周、第4周称重，计算大鼠灌胃量。每周称重大鼠饲料，计算大鼠摄食量。以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20ml/kg，对照组与模型组灌胃给予pbs，干预时间30天。使用2.0mm玻璃管，加入新鲜蛋清，置于沸水中3～5秒，至蛋清变白，取出后吸水纸吸干管壁水分，选取无气泡的蛋白管备用。蛋白管于实验前新鲜制作。大鼠末次干预后，于消化酶测定实验前禁食不禁水24小时。使用脱毛膏涂抹于大鼠腹部，去除大鼠胸骨下约4x4cm毛发。采用吸入式麻醉方法麻醉大鼠，腹部朝上置于实验台上，使用碘伏对大鼠腹部皮肤进行消毒。无菌剪刀剪开大鼠胸骨下约1cm处皮肤，暴露大鼠胸腔及胃部，开口约1～2cm，无菌镊子找出大鼠胃部与十二指肠连接处(即大鼠幽门)，使用手术缝合线将大鼠幽门结扎。幽门结扎3小时后，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死大鼠，解剖，取出大鼠胃部并将胃液收集于离心管内，测定单位时间内胃液量。取胃液1ml放入50ml三角烧瓶中，加入0.05mol/l盐酸溶液15ml摇匀，放入新鲜制作的蛋白管两根。塞好瓶口，37℃恒温箱中孵育24小时。计算蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量。胃蛋白酶活性单位(μ/ml)＝(四端蛋白管透明部分长度均值)2×16；胃蛋白酶排出量(μ/h)＝胃蛋白酶活性×每小时胃液量。5.1体重增重、摄食量和食物利用率干预后结果如表5显示，bl-99中剂量组(1×108cfu/天)体重总增重及总摄食量显著低于对照组(p＜0.05)，其他各组在总增重、总摄食量及总食物利用率指标并无显著差异。表5、乳双歧杆菌bl-99对小鼠总增重、总摄食量、总食物利用率的影响(g)5.2消化酶结果如图2所示，与对照组比较，bl-99中剂量组(1×108cfu/天)、bl-99高剂量组(1×109cfu/天)胃液量显著高于对照组(p＜0.05)。如图3所示，与对照组比较，各实验组胃蛋白酶活性无显著性差异(p＞0.05)。如图4所示，与对照组比较，bl-99中剂量组(1×108cfu/天)胃蛋白酶排出量显著高于对照组(p＜0.05)。以上结果表明中、高剂量bl-99乳双歧杆菌一定程度上改善了小鼠胃肠道消化能力，促进胃液分泌。实施例2：含乳双歧杆菌bl-99的固体饮料参照图5所示的发酵工艺流程，将本发明提供的乳双歧杆菌bl-99(即保藏编号为cgmccno.15650的乳双歧杆菌)在tpy液体培养基中进行厌氧培养。tpy液体培养基(g/l)：水解酪蛋白10.0，大豆胨5.0，酵母粉2.0，葡萄糖5.0，l-半胱氨酸0.5，磷酸氢二钾2.0，氯化镁0.5，硫酸锌0.25，氯化钙0.15，氯化铁0.0001，吐温801.0，ph值6.5±0.1。经一级、二级并扩大培养后的发酵液，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。所收集的菌体经冷冻干燥，得到bl-99活性菌粉，-18℃以下保存。考察本实施例的bl-99活性菌粉对小鼠排便功能的影响。经动物实验证明，bl-99纯菌粉，从106～1010cfu/天对于首粒排便时间、排便粒数、排便重量，在统计上均无显著差异(表6)。结合实施例1中的消化试验结果可知，bl-99本身虽然具有促消化效果，却不具有改善排便的能力。表6、bl-99活性菌粉对动物排便功能的影响按照以下表7配料配制本实施例的固体饮料，固体饮料产品规格：2000毫克/条。表7、固体饮料配料表配料表每包需要克数(mg)百分比(％)bl-99菌粉1728.6％麦芽糊精28814.4％低聚果糖80040.0％柳橙水果粉20010.0％低聚木糖20010.0％赤藓糖醇34017.0％总计2000100.0％将上述各配料混合均匀，制备得到本实施例的固体饮料。货架期内活菌数维持在100亿/包。将本实施例的bl-99固体饮料进行人群试食，两个月后问卷访查结果发现，食用bl-99固体饮料的人群有较佳的排便体感(图6，图中百分比数据表示体感人数百分比)。本发明的bl-99固体饮料能增加消化的体感、增加排便次数、减少排便时间。序列表<110>内蒙古伊利实业集团股份有限公司<120>一种含乳双歧杆菌bl-99的固体饮料及其应用<130>gai19cn2300<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1398<212>dna<213>乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)<400>1gctcccccacaagggtcgggccaccggcttcgggtgctacccactttcatgacttgacgg60gcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcggcgttgctgatccgcgattactag120cgactccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaccggttttcag180cgatccgccccacgtcaccgtgtcgcaccgcgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaa240gccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccc300cggcggtcccacatgagttcccggcatcacccgctggcaacatgcggcgagggttgcgct360cgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctg420tgaaccggccccgaagggaaaccgtgtctccacggcgatccggcacatgtcaagcccagg480taaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccg540tcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgcttaacgcgtt600ggctccgacacgggacccgtggaaagggccccacatccagcatccaccgtttacggcgtg660gactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtgac720ggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgatatctacacattccaccgtta780caccgggaattccagtctcccctaccgcactccagcccgcccgtacccggcgcagatcca840ccgttaggcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagccctttacgccc900aataaatccggataacgctcgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagc960cggtgcttattcgaacaatccactcaacacggccgaaaccgtgccttgcccttgaacaaa1020agcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgc1080ccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtccc1140aatgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtgggccatcaccc1200cgccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaagcatttcccaccccac1260catgcgatggagcggagcatccggtattaccacccgtttccaggagctattccggtgcac1320agggcaggttggtcacgcattactcacccgttcgccactctcaccccgacagcaagctgc1380cagggatcccgttcgact1398当前第1页1 2 3