一种抑制冻藏调理猪肉肌原纤维蛋白氧化的方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种抑制冻藏调理猪肉肌原纤维蛋白氧化的方法。

背景技术：

调理肉制品是以畜禽肉以及水产品等为主要原料加工而成、经简便处理即可食用的肉制品^[1]，具有方便、快捷、营养均衡、附加值高等特点，近年来深受消费者的喜爱。调理肉制品在我国常为冷冻贮藏，但是在贮藏以及运输过程中都很容易发生蛋白质氧化。蛋白质氧化会使蛋白质结构发生变化，交联聚集或片段化^[2~3]，会对肉品中蛋白结构、凝胶性质、持水性、嫩度、色泽、营养与可消化性^[4~6]造成不同程度的影响，从而导致肉品的感官品质恶化和营养价值下降。

为控制肉品蛋白氧化，目前主要通过改良动物的饲养方法^[7]、改善肉制品的包装^[8]以及添加抗氧化剂的措施来达到。但是通过改变饲料日粮成分或喂养方式等饲养措施控制蛋白氧化效果有限，而通过改善包装来提高蛋白抗氧化特性效果也不够明显。因此借助抗氧化剂来有效控制肉制品中蛋白的氧化是一种很好的方法。目前工业上广泛使用的多为化学合成抗氧化剂，但主要针对脂质氧化，且多年来不断有人对其安全性提出质疑，其中，已有研究证明2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylatedhydroxytoluene，bht)，丁基羟基茴香醚(butylhydroxyanisd，bha)与胃、肠和食物过敏的病因有关，长摄入量过多则会引发癌症和畸形。

一些具有优越抗氧化性的天然抗氧化剂如从植物中提取的多酚类、黄酮类化合物和植酸等，常被用来控制肉品的蛋白氧化。这些天然抗氧化剂具有抗氧化能力强、安全性高、无毒副作用和防腐保鲜等优点^[9-10]。因此，天然抗氧化剂的开发利用已成为肉品工业的一个研究重点，大力发展天然抗氧化剂并应用于肉类工业领域具有重要而广阔的前景。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的缺陷，提供了一种抑制冻藏调理猪肉肌原纤维蛋白氧化的方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种抑制冻藏调理猪肉肌原纤维蛋白氧化的方法，包括如下步骤：

（1）猪肉处理：原料猪肉切块后用绞肉机绞碎，调理猪肉饼的基本配方为：以绞碎猪肉500g计，绞碎猪肉中加入食盐8g、复合磷酸钠2g、抗坏血酸钠0.5g，4℃腌制24h，然后加入花椒水80g、醋20g、料酒20g、白胡椒粉1g、鸡精1g、五香粉0.4g、白糖5g、生姜粉0.4g、香油6g、鸡蛋50g搅拌均匀；

（2）抗氧化处理：步骤（1）处理好的猪肉中加入天然抗氧化剂，以冻藏调理猪肉饼重量为计算基准，天然抗氧化剂的加入浓度为：1.0g·kg^-1白藜芦醇、1.5g·kg^-1原花青素、0.35g·kg^-1茶多酚；

（3）制作成肉饼：混合均匀后用模具制成肉饼，保鲜膜包装，置于-18℃条件下冻结60d。

所述原料猪肉为猪背最长肌与猪背膘脂肪，去除背最长肌上的筋腱组织，肥瘦比为3:7。

所述复合磷酸钠为60%三聚磷酸钠、14%焦磷酸钠、12%六偏磷酸钠、12%磷酸氢二钠、1%磷酸三钠、1%焦磷酸二氢二钠。

所述花椒水为100g水中添加0.25g花椒煮沸，然后过滤得到花椒水。

所述白藜芦醇为葡萄皮提取物，纯度为98%；原花青素为葡萄籽提取物，纯度为95%；茶多酚，纯度为98%。

所制备的肉饼重量为60±5g。

白藜芦醇(resveratrol)存在于葡萄皮、花生、虎杖等多种植物中，是非黄酮类的多酚化合物。有关白藜芦醇对肉制品的影响还未见报道，但已有研究表明白藜芦醇具有显著的抗氧化、抗自由基作用，且研究表明，白藜芦醇对于防治衰老相关的氧化胁迫具有很好的作用^[11]。leonard等^[12]研究了白藜芦醇清除活性氧物质和对自由基诱导的细胞反应的影响，证实白藜芦醇可以有效清除oh•和o2^-•等自由基，并对活性氧ros引起的细胞膜脂质过氧化和dna损伤具有保护作用。

葡萄籽的提取物原花青素(procyanidin)中含有大量多酚类物质，具有清除自由基、抗氧化、抗癌和抗菌等生物活性。据相关研究表明，原花青素作为一种很强的抗氧化剂，可以有效地清除oh•、o2^-•和dpph•等自由基，明显提高过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，并且可以抑制脂质的过氧化^[13-14]。brannan等^[15]在研究葡萄籽提取物对冷冻鸡肉的品质影响时发现，原花青素在质量浓度为0.1%就可有效抑制鸡肉在冷冻贮藏过程中的氧化，且不影响鸡胸肉的感观评价。董晓敏^[16]也研究表明，原花青素溶液能有效抑制肉中蛋白质的分解，且硫代巴比妥酸值(thiobarbituricacid,tba)与对照组相比明显降低（p<0.05）。

茶多酚(teapolyphenol，tp)是一种从茶叶中提取的天然多酚类物质，它可以直接清除活性氧自由基、抑制脂质过氧化反应、螯合金属离子和激活细胞内抗氧化防御系统。茶多酚不仅具有抗氧化功能，而且在人体内很快被降解，不会引起抗药性问题，也不会改变人体内的正常菌群，是一种安全无毒的食品防腐剂^[17-18]。邢新涛等^[19]在研究涂膜处理对冷却猪肉品质变化的影响中表明，涂膜组保鲜效果均优于对照组，其中以壳聚糖-茶多酚涂膜组保鲜效果最好，且贮存21d后仍能达到1级鲜度。杨新磊等^[20]研究发现，茶多酚处理能明显抑制冷却肉中微生物的生长和脂质的氧化，延缓tvb-n的增加，也指出添加1.75%茶多酚的鸵鸟肉保鲜效果最优，理论上能将冷却肉的货架期延长10d左右。

本发明所研制的复合天然抗氧化剂可显著提高冷冻调理猪肉饼的抗氧化性，与空白对照组相比，添加此优化配方的猪肉饼蛋白的羰基含量和tvb-n值分别下降70.73%和69.14%，巯基含量和蛋白溶解度分别升高35.93%和66.49%。根据综合加权评分的分值计算，加入复合抗氧化剂后，肉饼对肌原纤维蛋白总的抗氧化性提高43.78%。

附图说明

图1为不同浓度的天然抗氧化剂对冷冻猪肉饼羰基含量的影响；

图2为不同浓度天然抗氧化剂对猪肉饼巯基含量的影响；

图3为不同浓度的抗氧化剂对冷冻猪肉饼蛋白溶解度的影响；

图4为不同浓度的天然抗氧化剂对冷冻猪肉饼tvb-n值的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，但凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明选用白藜芦醇，原花青素和茶多酚3种天然抗氧化剂对调理猪肉肌原纤维蛋白抗氧化性能进行单因素试验，并在单因素试验的基础上采用l9(3⁴)正交试验进行了三种天然抗氧化剂复合配比的优化，以提高冷冻调理肉肌原纤维蛋白抗氧化性能，确保调理猪肉饼的安全性和冻藏期间的贮藏稳定性，为提高冻藏调理猪肉肌原纤维蛋白的性能以及口感、货架期等提供一定的数据支持和理论指导。

具体方法如下：

1.试验材料：猪背最长肌与猪背膘脂肪：购于山西农业大学双汇冷鲜肉专卖店。原料为10月龄的雌性长白猪，屠宰后在0-4℃下成熟24h后低温运至店内。

白藜芦醇（葡萄皮提取物，纯度为98%）、原花青素（葡萄籽提取物，纯度为99.5%）和茶多酚（纯度为99.8%）购于西安普瑞斯生物工程有限公司。

2.试验试剂：2-硫代巴比妥酸、氯仿（三氯甲烷）、三氯乙酸（trichloroaceticacid,tca）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,edta）、丁基羟基茴香醚（butylhydroxylanisd,bha）、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂、硼酸、盐酸、氯化钾、氯化镁、磷酸氢二钠、氢氧化钠、硫酸铜、氯化钠、酒石酸钾钠、浓硫酸、牛血清蛋白、tris、甘氨酸、考马斯亮蓝（g-250）、无水乙醇、磷酸、edta、尿素、dtnb、dnph、乙酸乙酯、盐酸胍，以上试剂均为分析纯。

3.试验仪器与设备：stw-32f电动绞肉机，济南创宏机械设备有限公司；3k15型高速冷冻离心机，德国sigma公司；紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；hh-s8电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；hy-2调速多用振荡器，常州国华电器有限公司；先行者分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；cr-400型色差仪，日本minolta公司；高剪切分散乳化机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；bc/bd500卧式新飞冷藏冷冻转换柜，福安市雷诺电气有限公司；dhg-9243bs-恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。

4.样品处理：实验原料为猪背最长肌与猪背膘脂肪。去除背最长肌上的筋腱组织，切成小块后用绞肉机绞碎。调理猪肉饼的基本配方为：以绞碎猪肉500g（肥瘦比：3:7）计，食盐8g、复合磷酸钠2g（含60%三聚磷酸钠、14%焦磷酸钠、12%六偏磷酸钠、12%磷酸氢二钠、1%磷酸三钠和1%焦磷酸二氢二钠）、抗坏血酸钠0.5g，4℃腌制24h后加入花椒水80g（100g水中添加0.25g花椒煮沸）、醋20g、料酒20g、白胡椒粉1g、鸡精1g、五香粉0.4g、白糖5g、生姜粉0.4g、香油6g、鸡蛋50g搅拌均匀。

分别称取白藜芦醇（添加量分别为0.5g·kg^-1、1.0g·kg^-1、1.5g·kg^-1、2.0g·kg^-1，以肉饼质量计）、原花青素（添加量分别为1.0g·kg^-1、1.5g·kg^-1、2.0g·kg^-1、2.5g·kg^-1）、茶多酚（添加量分别为0.25g·kg^-1、0.3g·kg^-1、0.35g·kg^-1、0.4g·kg^-1）于肉饼中，对照组不添加任何抗氧化剂，混合均匀后用模具制成重约(60±5)g的肉饼，保鲜膜包装，放入托盘中，置于-18℃条件下冻结60d后取出。

5.指标测定：

a、肌原纤维蛋白提取：参照潘君慧^[22]的方法。最后离心后得到的蛋白膏保存于冰盒中备用。蛋白浓度用双缩脲法测定。

b、羰基含量测定：参照oliver等^[23]的方法，按式（2）进行计算。

（2）；

式中：c为盐酸胍做空白在280nm处测得的蛋白浓度（mg·ml-1），2.2×10⁴为摩尔吸光系数，10⁶为单位转换系数；a2为370nm处测定吸光度。

c、总巯基含量测定：总巯基含量的测定采用dtnb^[24]法，最后按式（3）进行计算。

（3）；

式中：c为考马斯亮蓝法测定所得的蛋白实际浓度；1.36×10⁴为摩尔吸光系数；10⁶为单位转换系数。

d、肌原纤维蛋白溶解度测定：用pipes缓冲液（0.6mol·l^-1的nacl，20mm·l^-1的mgcl2，10mm·l^-1的pipes,10mm·l^-1的焦磷酸钠）配制浓度为5mg·ml^-1的蛋白溶液，取5ml蛋白于离心管中，在2℃条件下放置4h，每隔20min振摇一次。4h后于2℃，5000×g条件下离心15min，取上清液用双缩脲法测定蛋白质浓度，空白对照为pipes缓冲液，按公式（4）进行计算。

（4）。

e、挥发性盐基氮（tvb-n）的测定：参照gb5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法进行。

f、综合加权评分的确定：参照吴阳阳^[25]的方法，并稍作修改。采用综合加权评分法处理羰基含量、巯基含量、蛋白溶解度和tvb-n值4个指标，其所得总分作为最终判断指标。指标权重分别定为30%、30%、20%、20%，加权评分按照式（5）和（6）计算：

对于测定值越大、品质越佳的巯基含量和蛋白溶解度指标，计算式如式5：

(5)。

对于测定值越小、品质越佳的tvb-n和羰基含量值，计算式如式6：

（6）。

式中yi为该指标加权得分；a为该指标权重分值；wi为该指标各试验测定值。

6.数据处理：试验均重复三次，结果表示为：平均值±标准偏差。用microsoftexcel2010计算各个指标的平均值与标准差；测定结果用statistic8.1对数据进行处理分析，并用oringinpro8.5绘图软件绘制图形；采用statistix8.1中turkeyhsd程序进行显著性差异分析(显著水平为p<0.05)；用正交设计助手ⅱv3.1进行正交试验设计。

7、结果与分析

a、不同浓度抗氧化剂对猪肉饼中羰基含量的影响：在肉饼贮藏过程中，蛋白质氧化也是导致肉品品质降低的重要因素^[26]。蛋白质过度氧化可生成交联体和羰基，从而影响其功能特性^[27]。因此，可通过测定羰基含量来评估蛋白质被氧化损伤的程度，羰基含量越大，则证明蛋白质氧化程度越高。

图1为不同浓度的天然抗氧化剂对冷冻猪肉饼羰基含量的影响，可以看出随着天然抗氧化剂浓度的增加，肉饼中羰基量先下降后趋于平缓，且各处理组的羰基含量与对照组相比差异显著（p<0.05）。在一定浓度范围内，羰基含量随着白藜芦醇的浓度增加而不断降低，白藜芦醇对猪肉饼有显著的抗氧化、抗自由基作用，能改善其品质。白藜芦醇浓度在1.0g·kg^-1时羰基值最低，之后虽然羰基含量随浓度增加有所波动，但无明显差异（p>0.05），说明浓度为1.0g·kg^-1时猪肉饼就已经有良好的抗蛋白氧化的效果。由原花青素对猪肉饼羰基值的影响可看出，随着原花青素浓度的增加猪肉饼的羰基含量随之下降，后略有上升，但上升幅度不大（p>0.05）。原花青素不仅可以通过酚羟基与自由基进行去氢反应生成半醌自由基，从而生成稳定的联苯酚或儿茶酸-氧醌，中断链式反应，还可通过自身的还原作用直接给出电子而清除自由基，从而达到抗氧化效果^[28]，原花青素还能够通过对金属离子的螯合,降低若干需金属离子催化的反应,从而间接实现抗氧化作用。与原花青素相似，随着茶多酚浓度的增加，肉饼中羰基量先下降后趋于平缓，并且在0.3g·kg^-1时茶多酚抑制羰基含量达到最大程度，羰基值为0.49mol·l^-1且与空白对照组和0.25g·kg^-1处理组差异显著（p<0.05）。茶多酚具有明显的抗氧化作用，其中儿茶素抗氧化能力最强。茶多酚中的酚羟基上的活泼氢能与自由基结合，螯合金属离子，增强体内抗氧化酶活性^[29]。

b、不同浓度抗氧化剂对猪肉饼中巯基含量的影响：通常情况下，蛋白分子中的巯基易被氧化形成二硫键，因而巯基含量的变化是蛋白质氧化的另一个重要标记^[30-31]。巯基含量越低，则表示蛋白质氧化水平越严重。如图2所示，在一定浓度范围内，各组肉饼样品中的巯基含量均随抗氧化剂添加浓度的增加而显著增加(p<0.05)，抗氧化剂的添加不同程度地控制了巯基含量的减少。

图2为不同浓度天然抗氧化剂对猪肉饼巯基含量的影响，图中可以看出，随着白藜芦醇浓度的增加巯基含量呈现先上升后下降的趋势。其中质量浓度为1.0g·kg^-1时巯基含量最高达到了73.55mol·mg^-1，且与其它浓度处理组差异性显著（p<0.05），抗蛋白氧化效果最好。由图可看出，随着原花青素浓度的增加，猪肉饼中巯基含量先增后减。质量浓度为1.5g·kg^-1、2g·kg^-1和2.5g·kg^-1时巯基含量分别为76.66、59.72和57.44mol·mg^-1，明显高于对照组（p<0.05），其中2g·kg^-1与2.5g·kg^-1处理组无明显差异（p>0.05），所以在一定范围内,随着原花青素的添加浓度增大,肉饼中蛋白质氧化程度较低。原花青素中存在独特的分子结构，其分子中存在的大量酚羟基，所以原花青素具有较强的抗氧化活性^[26]。添加茶多酚可以有效减少猪肉饼中巯基的损失，这一结果与其他两种天然抗氧化剂相似，茶多酚对巯基量的影响也呈先上升后下降的趋势，据报道，更高浓度的茶多酚可能起到促氧化剂的作用^[29]，所以达到一定浓度后巯基含量明显下降。茶多酚保护巯基的作用可能与其所含有的酚类物质有关，酚类物质可以捕获自由基，减少自由基进攻巯基，刘焱^[30]研究也表明，茶多酚对冻藏肌原纤维蛋白中的巯基具有保护作用，一定程度上可防止蛋白质分子交联、聚合现象的发生。

c、不同浓度抗氧化剂对猪肉饼中蛋白溶解度的影响：溶解性是蛋白质重要的性质之一，而肉饼氧化过程中产生的自由基与蛋白质的交联可导致蛋白质的聚集和溶解性下降，所以蛋白质溶解度是表示蛋白质氧化程度的重要指标，可评价蛋白质变性以及被破坏的程度。从图4可知，3种抗氧化剂对蛋白质溶解性的影响与巯基的趋势相似，蛋白溶解度随着各个抗氧化剂的增加而增加，且各处理组肉饼与对照组相比有显著性差异（p<0.05）。

由图3可知，白藜芦醇可显著影响肉饼中蛋白质溶解性（p<0.05），且当浓度达到1.0g·kg^-1时肉饼的蛋白溶解性最高，随后呈下降趋势。肉饼氧化过程中产生的自由基与蛋白质的交联可导致聚集和蛋白质不溶性，而白藜芦醇一定程度上防止了蛋白质分子的交联、聚合现象的发生。从图中可以看出在一定范围内肉饼的蛋白溶解度随原花青素质量浓度的增加而上升，随后显著降低（p<0.05），可能是因为原花青素浓度过高会促进脂肪氧化从而导致肌原纤维蛋白质的变性，使肌原纤维蛋白的盐溶性下降。由茶多酚对猪肉饼蛋白溶解度的影响可知，随着茶多酚添加浓度的增加，蛋白溶解度先快速增加达到最大值后又略微下降，当添加浓度为0.35g·kg^-1时蛋白质溶解度为21.88g·kg^-1，显著高于对照组的12.32g·kg^-1（p<0.05）。这是因为茶多酚中苯环上的π电子与酚羟基上的氧原子上不成对的单电子发生共轭效应，使得单电子向苯环靠近，酚羟基中的氢氧键减弱，因此酚羟基上氢变得活泼，能够与不饱和脂肪酸的自由基结合争夺活性氧，使自由基转变成惰性化合物，继而终止脂肪自由基自动氧化，进而减少蛋白变性^[29]。

d、不同浓度抗氧化剂对猪肉饼tvb-n的影响：挥发性盐基氮是肉及肉制品由于自身酶或污染的微生物分解胞外酶作用，分解蛋白质而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，所以tvb-n值常作为肉制品质量和保质期的一个评价标准^[30]。图4为不同浓度的天然抗氧化剂对冷冻猪肉饼tvb-n值的影响。由图4可知，各处理组肉饼的tvb-n值均明显地低于对照组（p<0.05），白藜芦醇与茶多酚对tvb-n的抑制效果优于原花青素。

由图4可知，白藜芦醇质量浓度为1g·kg^-1时，tvb-n值较低且与对照组差异性显著（p<0.05），质量浓度＞1g·kg^-1时，tvb-n值显著不差异（p>0.05），因此可知白藜芦醇质量浓度达到1g·kg^-1左右时即可抑制tvb-n值的生成。由图中不同浓度原花青素对猪肉饼tvb-n值的影响可看出，随着原花青素浓度的增加猪肉饼的tvb-n值含量随之下降，后略有上升。这表明原花青素可有效抑制肉制品中氧化酶和微生物的活性，且随着花青素含量的增加，肉饼中酶和细菌的作用逐渐减弱，蛋白质较难被分解产生氨及胺类等挥发性类含氮物质，从而有效地延长了肉制品的货架期^[31]。如图所示，随着茶多酚浓度的增加猪肉饼的tvb-n值随之下降，但质量浓度＞0.3g·kg^-1后tvb-n值基本保持不变（p＞0.05）。

添加茶多酚可以明显地降低猪肉饼中tvb-n的含量，从而延长猪肉饼的货架期，这与杨新磊等^[20]研究茶多酚对冷却猪肉保鲜效果以及chih-chenglin等^[32]研究冷冻金枪鱼片的结果相一致，茶多酚中的多酚能够影响细胞膜的磷脂双分子层，破坏细胞的结构，进而增加细胞通透性，使细菌死亡，茶多酚还会严重影响细菌重要成分的合成以及能量代谢，或是作用于酶或功能蛋白，使微生物生长繁殖受到抑制^[33-34]。

e、复配抗氧化剂的确定

a、正交试验设计：根据白藜芦醇、原花青素和茶多酚的单因素可知，白藜芦醇较适质量浓度为1g·kg^-1，原花青素的较适质量浓度为1.5g·kg^-1，茶多酚的较适质量浓度为0.35g·kg^-1。为了进一步优化抗氧化效果更好的复合抗氧化剂配方，利用l9(3⁴)正交表进行正交试验。表1为因素水平表。

表1正交试验因素水平表

正交试验中，每一个试验组冻藏60d后测定其羰基、巯基、蛋白溶解度和tvb-n值、，计算各正交组的加权评分数，从而确定效果最好且价格适中的复合抗氧化剂配方。

b、正交试验结果与分析：表2为复合抗氧化剂的正交试验结果及分析，按极差r的大小可知，各因素的主次顺序为a>b>c，即白藜芦醇对肉饼综合品质影响最大，原花青素次之，茶多酚影响最小；根据ki值的大小初选最优工艺条件为a2b2c2，而实际最优工艺条件为a2b2c3。通过验证试验得到最佳复配配方为a2b2c3，即白藜芦醇1.0g·kg-1，原花青素1.5g·kg-1，茶多酚0.35g·kg-1，此时猪肉饼的羰基、巯基和蛋白溶解度分别为0.37mol·l-1、60.06mol·mg-1和20.51mg·g-1，tvb-n值为11.19mg·100g-1。与空白对照组相比，羰基和tv-n值分别下降70.73%和69.14%，巯基含量和蛋白溶解度分别升高35.93%和66.49%。根据综合加权评分的分值计算，加入复合抗氧化剂后，肉饼对肌原纤维蛋白的总的抗氧化性提高43.78%。

表2复合抗氧化剂的正交试验方案及结果

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