一种过瘤胃包被噬菌体的制备及其在防治水牛腹泻中的应用

本发明涉及微生物与畜牧养殖领域，具体涉及一种过瘤胃包被噬菌体的制备及其在防治水牛腹泻中的应用。

技术背景

水牛具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长等生物学特性，水牛产业的发展对广西等省份精准扶贫、提高农民经济收入具有重要的意义。腹泻是水牛发病率高、治疗困难、死亡率高的疾病，可分为败血型、肠型、肠毒血型三种类型。肠道细菌引发疾病是水牛的主要发病因素之一，抗生素的广泛应用可以对肠道细菌进行很好的控制，但目前畜牧养殖中抗生素被过度使用，造成细菌耐药性问题愈发严重。目前，水牛腹泻的主要病原菌包括：由牛副结核分支杆菌引起的牛副结核病、由大肠埃希菌引起的犊牛白痢、由沙门氏菌引起的细菌性肠炎及由空肠弯杆菌引起的冬痢等细菌性肠道疾病。

从世界范围来看，2005年联合国粮农组织(fao)、国际动物卫生组织(oie)和世界卫生组织(who)共同提出了控制兽药抗生素使用的口号。欧盟于2006年1月通过立法规定严禁抗生素在动物饲料中的添加。美国也已经在2013年开始逐步控制对抗生素的使用。抗生素的已知副作用包括：引起儿童大脑发育迟缓、肥胖、免疫能力降低、因耐药性细菌感染生病而死亡。据统计，如果无法应对耐药菌，到了2050年，中国将有100万人因此死亡。因此，用生物方法提高禽畜的抗病能力，开发抗生素替代品，是生态养殖、国民健康的必经之

路。这条路不仅必需要走，而且要尽快走通。

在饲料中添加噬菌体可代替抗生素，具有理论和实践的可行性。噬菌体(英文为bacteriophage或phage)是细菌的病毒，侵染细菌(包括古细菌和真细菌；英文：archaea和bacteria)并在后者细胞内复制。噬菌体是细菌的天敌，可杀死或抑制被侵染细菌；由于噬菌体不能独立生存，被其侵染的细菌又被称为噬菌体的“宿主”。噬菌体是地球上数量最多的生物，预计有10的31次方个，比其它生物加在一起还要多。而已知细菌的大多数都可被噬菌体侵染。噬菌体的抑菌特性，使之成为抗生素的替代品。抗生素的流行使得噬菌体使用日益减少；但是，随着抗生素滥用导致超级细菌(指那些同时对多种抗生素有抗性的细菌)的泛滥，噬菌体作为抗生素替代又重新被提上日程。相对抗生素的广谱杀菌作用，噬菌体通常只侵染特定细菌，具有宿主专一性。抗生素在杀死有害菌的同时，也会不加选择的杀死共生菌和有益菌，破坏肠道细菌的生态平衡，引发严重后果。大量动物实验表明，口服噬菌体可以抑制致病细菌在肠道内的定植。英国科学家smith等开展了噬菌体在猪、牛、羊中防治大肠杆菌腹泻作用的研究，实验中有9只犊牛在攻毒后8小时灌服噬菌体混悬液(浓度为1011pfu)，未发现腹泻现象。如在攻毒发病后饲喂噬菌体，实验组13头犊牛中死亡2头，而对照组未饲喂噬菌体的14头则全部死亡，结果表明，噬菌体可杀灭大肠杆菌，阻止其在动物肠道中定植，有效降低动物死亡率；waddell等对牛进行大肠杆菌o157：h7攻毒，攻毒前后多次给牛口服噬菌体株噬菌体混合剂，结果显示，噬菌体治疗组，在攻毒8天后，牛粪中已无大肠杆菌排出，而此时粪中噬菌体的数量增加到10⁹-10¹⁰pfu/g，这表明噬菌体在牛体内发生了复制增殖，并发挥了有效的杀菌作用。barrow等以鸡和牛为实验动物，研究发现噬菌体能够防治大肠杆菌感染引起的鸡败血症和脑膜炎噬菌体还能推迟牛菌血症的发生，并延长了其存活时间。

因此，噬菌体可以替代抗生素，能避免抗生素使用的副作用。而且噬菌体可作为饲料添加剂，易用性强，操作方便。但是如何选择筛选适宜的噬菌体进行组配，是制约噬菌体在水牛疾病防治中应用的难点。而且水牛属于反刍动物，瘤胃就是一个小型的微生物加工厂，如何保护瘤胃中的微生物不受饲料中噬菌体的误伤，是将噬菌体技术成功应用于水牛肠道疾病防治的关键。

技术实现要素：

为了解决以上问题，本发明提出一种过瘤胃包被噬菌体的制备及其在防治水牛腹泻中的应用。

本发明的过瘤胃包被噬菌体的制备方法，所述过瘤胃包被噬菌体为6种噬菌体组配而得，包括：金黄色葡萄球菌噬菌体52、金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1、大肠杆菌噬菌体t1、大肠杆菌噬菌体t3、大肠杆菌噬菌体s13、枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e；上述6种噬菌体均采购自美国atcc；

所述过瘤胃包被噬菌体的制备方法包括如下步骤：

s1、将上述6种噬菌体的冻干粉与辅料按重量比1～3：5～10混合均匀；

s2、在上述混合物中加入浓度为2％的羟丙基甲基纤维素水溶液制得软材；

s3、将上述软材制成条状物料，并经过剪切、滚圆、烘干制得丸芯；

s4、将上述丸芯加入空气流化床包衣机中，喷入包衣液，干燥后即得过瘤胃包被噬菌体。

优选地，所述6种噬菌体的冻干粉是所述金黄色葡萄球菌噬菌体52：金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1：大肠杆菌噬菌体t1：大肠杆菌噬菌体t3：大肠杆菌噬菌体s13：枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e按重量比0.5：1：1：1：2：1混合而得。

优选地，所述辅料为微晶纤维素、面粉、滑石粉、玉米淀粉按重量比1：1：1：1混合而得。

优选地，所述包衣液由9％的丙烯酸树脂iv、4.5％的乙基纤维素、85％的乙醇混合搅拌至完全溶解后，加入1.5％的滑石粉制得。

优选地，所述丸芯与包衣液的重量比为1：1.5。

优选地，所述过瘤胃包被噬菌体粒径为20-100目。

优选地，所述6种噬菌体的冻干粉与辅料按重量比3：10混合均匀。

本发明还提供一种过瘤胃包被噬菌体在防治水牛腹泻中的应用方法，将过瘤胃包被噬菌体按每吨精料添加30-70公斤的比例添加到水牛精料补充料中。

本发明的有益效果如下：

1、经过前期试验发现，水牛腹泻的主要病原菌包括：由牛副结核分支杆菌引起的牛副结核病、由大肠埃希菌引起的犊牛白痢、由沙门氏菌引起的细菌性肠炎及由空肠弯杆菌引起的冬痢，但是在实践中，并不能及时筛选到与致病菌一一对应的噬菌体，我们根据生物信息学分析，对水牛肠道细菌进行画像，筛选现有的与导致水牛腹泻关联度较高的肠道细菌噬菌体，分别是金黄色葡萄球菌噬菌体52、金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1、大肠杆菌噬菌体t1、大肠杆菌噬菌体t3、大肠杆菌噬菌体s13、枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e，上述6种噬菌体均采购自美国atcc(americantissueculturecollection，美国组织培养库)，进行科学搭配，组合成鸡尾酒式噬菌体，通过过瘤胃包被的形式对水牛进行给药，获得了较理想的效果，为后期筛选特定噬菌体的研究提供了参考。

2、组配方式合理，经过动物试验发现，金黄色葡萄球菌噬菌体52：金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1：大肠杆菌噬菌体t1：大肠杆菌噬菌体t3：大肠杆菌噬菌体s13：枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e按重量比0.5：1：1：1：2：1混合而得的试验组效果最好。

3、本发明利用了现有的过瘤胃包被技术，将噬菌体包被成微丸，在瘤胃中不被微生物分解，到真胃时包衣才开始溶解，到肠道时噬菌体开始发挥作用，完全不影响水牛瘤胃消化，噬菌体也不会在瘤胃被分解。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：筛选关联度较高的噬菌体

根据对水牛直肠粪便中病毒粒子和dna测序，结合水牛的生物信息学分析，筛选关联度较高的噬菌体。

本实施例选取广西华胥水牛生物科技有限公司养殖基地的20头水牛，其中10头为健康，10头为患有腹泻疾病，直接从水牛直肠中采取粪便样本，每样本分为两份，一份样本用于提取病毒粒子，用三代pacbio进行测序，以获得噬菌体和其它病毒的基因组序列；另一份样本用于提取dna直接进行三代pacbio测序，对测序结果进行组装和后续生物信息学分析；利用go(基因功能分析常用数据库)、kegg(代谢通路分析常用数据库和工具)对蛋白编码基因进行归类，从各个角度对健康与疾病状态下水牛肠道细菌进行画像，筛选与导致水牛腹泻关联度较高的肠道细菌噬菌体。通过前期试验，我们筛选到与导致水牛腹泻关联度较高的市售肠道细菌噬菌体共6种，分别是金黄色葡萄球菌噬菌体52、金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1、大肠杆菌噬菌体t1、大肠杆菌噬菌体t3、大肠杆菌噬菌体s13、枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e，上述6种噬菌体均采购自美国atcc。

实施例2：养殖试验验证

首先制备过瘤胃包被噬菌体，所述过瘤胃包被噬菌体为6种噬菌体组配而得，包括：金黄色葡萄球菌噬菌体52、金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1、大肠杆菌噬菌体t1、大肠杆菌噬菌体t3、大肠杆菌噬菌体s13、枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e；上述6种噬菌体均采购自美国atcc；

所述过瘤胃包被噬菌体的制备方法包括如下步骤：

s1、将上述6种噬菌体的冻干粉与辅料按重量比3：10混合均匀；

s2、在上述混合物中加入浓度为2％的羟丙基甲基纤维素水溶液制得软材；

s3、将上述软材制成条状物料，并经过剪切、滚圆、烘干制得丸芯；

s4、将上述丸芯加入空气流化床包衣机中，喷入的包衣液，干燥后即得过瘤胃包被噬菌体。

本实施例中，所述6种噬菌体的冻干粉是所述金黄色葡萄球菌噬菌体52：金黄色葡萄球菌亚种噬菌体b1：大肠杆菌噬菌体t1：大肠杆菌噬菌体t3：大肠杆菌噬菌体s13：枯草芽孢杆菌噬菌体phi-e按以下重量比分组配合：

表1各试验组的6种噬菌体配比表

本实施例中，所述辅料为微晶纤维素、面粉、滑石粉、玉米淀粉按重量比1：1：1：1混合而得。

本实施例中，所述包衣液由9％的丙烯酸树脂iv、4.5％的乙基纤维素、85％的乙醇混合搅拌至完全溶解后，加入1.5％的滑石粉制得。

本实施例中，所述丸芯与包衣液的重量比为1：1.5。

本实施例中，所述过瘤胃包被噬菌体粒径为20-100目。

试验设计为，选用实施例1的10头健康水牛和10头患有腹泻疾病的水牛，在广西华胥水牛生物科技有限公司养殖基地进行饲养，每组两头水牛，每头水牛独立占一个饲养棚，对上述6种噬菌体的组配比例进行验证。试验过程为15天，水牛每日采食的日粮精粗比为3:7，对照组为常规饲喂，a/b/c/d组为将各组的过瘤胃包被噬菌体按每吨精料添加50公斤的比例添加到水牛精料补充料中，统计各试验组大便次数及粪便表观形貌，观察本发明的鸡尾酒式过瘤胃包被噬菌体添加到饲料中后对水牛肠道健康的影响，

结果如下：

表2各试验组水牛每天大便次数(单位：大便次数/天)

根据水牛粪便表观形貌，将水牛腹泻分为重型、中型、轻型、正常四级，

重型：粪堆为液态不成形，四散流开、水分含量高；

中型：粪堆为糊状不成形，四散流开但扩散面积不大，水分含量高；

轻型：粪堆为膏状，未四散流开，水分含量略高；

正常：粪堆为成形的膏条状，底面近似圆形，自然堆高，不流散。

表3各试验组水牛大便表观形貌分类

见表1-3，通过饲养试验各试验组大便次数及粪便表观形貌可见，本发明的鸡尾酒噬菌体，采用过瘤胃包被的方式投喂，对腹泻有显著的治疗治疗效果，综合来看，c组为最优例，用c组投喂时，不会对健康牛产生影响，但是对腹泻牛能显著减少大便次数和改善粪便表观形貌，在投喂c组13-15天时，排便次数和粪便表观形貌已经完全恢复正常，说明采用本发明c组的技术方案，可以有效地防治水牛腹泻，避免使用抗生素治疗，实现水牛养殖中的绿色无抗要求。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。