一种天然蛋白基纳米铁及其制备方法与应用

1.本发明涉及功能食品技术领域，尤其涉及一种天然蛋白基纳米铁及其制备方法与应用。


背景技术：

2.天然蛋白基纳米铁是一种天然富含铁的纳米颗粒，几乎存在于所有生物体中，该蛋白基纳米铁由笼形的蛋白外壳和内部纳米铁核构成，在机体铁代谢稳态中起着重要的作用。天然蛋白基纳米铁约含2000个铁原子，其蛋白基外壳的内部空腔最多可容纳4500个铁原子。在人体中，多余的纳米铁二价铁离子被氧化成三价储存在其蛋白基形成的内部空腔中，以避免过量的二价铁离子对机体产生损伤；而当机体铁原子不足的时候，蛋白基能够在还原剂的作用下释放二价铁离子供机体使用。天然蛋白基纳米铁的蛋白外壳由24个相同或不同的亚基(h型和l型)组成，其结构十分稳定，在体外能够在较宽的ph范围和高温(60℃)下稳定存在。由于传统的补铁制剂容易受到温度、ph及其他食品组分(如植酸、单宁等)的影响，导致铁吸收利用率不高；天然蛋白基纳米铁对比传统的补铁制剂更加稳定，具有更宽的温度和ph适应范围。可见开发一种天然蛋白基纳米铁被认为是一种新型的天然补铁剂。现有技术并未公开如何制备天然蛋白基纳米铁的方案。因此，寻找一种合适的天然蛋白基纳米铁的制备方法可以填补现有技术的不足。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种天然蛋白基纳米铁及其制备方法与应用。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种天然蛋白基纳米铁的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将离体动物内脏与水混合，粉碎至粒径为0.3～0.5mm的组织；
7.(2)将所述粒径为0.3～0.5mm的组织均质，得到均质液；
8.(3)将所述均质液在65～70℃条件下水浴8～10min后，4～6层纱布过滤，取滤液，将所述滤液离心，取上清液，去除所述上清液中的油层，得到含有铁蛋白的溶液；
9.(4)在所述含有铁蛋白的溶液中加入硫酸铵，2～6℃，静置1～2h，得到含有沉淀的混合物；
10.(5)利用tris-hcl溶液将所述含有沉淀的混合物中的沉淀溶解后，在65～70℃条件下水浴10～15min，离心，收集上清液，将所述上清液依次进行透析、纯化、干燥处理后得到天然蛋白基纳米铁。
11.作为优选，所述离体动物内脏为牛脾、猪脾和牛肝中的一种或多种；
12.所述离体动物内脏为剔除脂肪组织和结缔组织的内脏。
13.作为优选，所述离体动物内脏与水混合的质量体积比为1g：1～2ml。
14.作为优选，步骤(2)所述均质时的转速为15000～19000rpm；
15.步骤(2)所述均质的次数为7～8次；
16.每次均质的时间为15～20s。
17.作为优选，步骤(3)和步骤(5)所述离心的转速独立为10000～12000rpm；
18.步骤(3)和步骤(5)所述离心的时间独立为10～20min；
19.步骤(3)和步骤(5)所述离心时的温度独立为2～6℃；
20.步骤(3)所述去除所述上清液中的油层的方法为1～3层纱布过滤。
21.作为优选，步骤(4)所述加入硫酸铵的终浓度为30～50wt％。
22.作为优选，步骤(5)所述tris-hcl溶液的初始摩尔浓度为20～30mmol/l；
23.离体动物内脏与tris-hcl溶液的质量体积比为3～4g：10ml；
24.所述tris-hcl溶液的ph为7～8。
25.作为优选，步骤(5)所述透析的溶液为初始摩尔浓度为20～30mmol/l的tris-hcl溶液；
26.所述透析的次数为2～4次；
27.每次透析的时间为5～7h；
28.步骤(5)所述纯化为deae柱纯化；
29.步骤(5)所述干燥为冷冻干燥；
30.所述冷冻干燥的温度为-60～-50℃；
31.所述冷冻干燥的时间为22～26h。
32.本发明还提供了所述的制备方法制备得到的天然蛋白基纳米铁，所述天然蛋白基纳米铁中所含的铁蛋白含量≥112.9g/kg。
33.本发明还提供了所述的天然蛋白基纳米铁在制备功能食品方面的应用。
34.本发明提供了一种天然蛋白基纳米铁及其制备方法与应用。按照本发明的制备方法得到天然蛋白基纳米铁，可补充铁元素和蛋白质。与现有技术补充铁的制剂相比，本发明的天然蛋白基纳米铁的纳米颗粒小且均一，制备过程无污染，并且纳米铁以蛋白作为载体，含铁量高，生物相容性好，没有副作用，食用方便。本发明的制备方法制备得到的天然蛋白基纳米铁颗粒外径为12nm，内径为8nm，并且体蛋白含量≥112.9g/kg。
附图说明
35.图1为实施例1的方法制备得到的天然蛋白基纳米铁的透镜图(其中，a为未染色的透镜图；b为经过磷酸钨染液负染的透镜图)。
具体实施方式
36.本发明提供了一种天然蛋白基纳米铁的制备方法，包括如下步骤：
37.(1)将离体动物内脏与水混合，粉碎至粒径为0.3～0.5mm的组织；
38.(2)将所述粒径为0.3～0.5mm的组织均质，得到均质液；
39.(3)将所述均质液在65～70℃条件下水浴8～10min后，4～6层纱布过滤，取滤液，将所述滤液离心，取上清液，去除所述上清液中的油层，得到含有铁蛋白的溶液；
40.(4)在所述含有铁蛋白的溶液中加入硫酸铵，2～6℃，静置1～2h，得到含有沉淀的混合物；
41.(5)利用tris-hcl溶液将所述含有沉淀的混合物中的沉淀溶解后，在65～70℃条
件下水浴10～15min，离心，收集上清液，将所述上清液依次进行透析、纯化、干燥处理后得到天然蛋白基纳米铁。
42.在本发明中，所述离体动物内脏为牛脾、猪脾和牛肝中的一种或多种；所述离体动物内脏为剔除脂肪组织和结缔组织的内脏。在本发明中，所述离体动物内脏与水混合前要在2～6℃水中浸泡10～14h；优选为在4℃水中浸泡12h。在本发明中，所述离体动物内脏与水混合的质量体积比为1g：1～2ml，优选为1g：1.5ml。在本发明中，所述粉碎为在搅拌机中粉碎；所述粉碎时搅拌机的功率为300w，转速为2200～4000rpm，优选为2700～3500rpm，进一步优选为3100rpm；所述粉碎时搅拌机每开20s停30s，操作7次。在本发明中，所述粉碎的粒径优选为0.4mm。
43.在本发明中，步骤(2)所述均质时的转速为15000～19000rpm，优选为16000～18000rpm，进一步优选为17000rpm；步骤(2)所述均质的次数为7～8次；每次均质的时间为15～20s，优选为16～19s，进一步优选为17.5s。
44.在本发明中，步骤(3)和步骤(5)所述离心的转速独立为10000～12000rpm，优选为11000rpm；步骤(3)和步骤(5)所述离心的时间独立为10～20min，优选为15min；步骤(3)和步骤(5)所述离心时的温度独立为2～6℃，优选为4℃。
45.在本发明中，步骤(3)所述均质液水浴的温度优选为67.5℃；所述水浴的时间优选为9min。在本发明中，步骤(3)所述去除所述上清液中的油层的方法为1～3层纱布过滤，优选为2层纱布过滤。
46.在本发明中，步骤(4)所述加入硫酸铵的终浓度为30～50wt％，优选为40wt％。在本发明中，所述加入硫酸铵的目的为沉淀铁蛋白。在本发明中，步骤(4)所述静置的温度优选为4℃，所述静置的时间优选为1.5h。
47.在本发明中，步骤(5)所述tris-hcl溶液的初始摩尔浓度为20～30mmol/l，优选为25mmol/l；离体动物内脏与tris-hcl溶液的质量体积比为3～4g：10ml，优选为3.5g：10ml；所述tris-hcl溶液的ph为7～8，优选为7.5。步骤(5)所述水浴的温度优选为67.5℃；步骤(5)所述水浴的时间优选为12.5min。在本发明中，步骤(5)所述透析的溶液为初始摩尔浓度为20～30mmol/l的tris-hcl溶液，优选为25mmol/l；所述透析的次数为2～4次，优选为3次；每次透析的时间为5～7h，优选为6h；所述透析的目的为除去铁蛋白溶液中的硫酸铵。步骤(5)所述纯化为deae柱纯化；步骤(5)所述纯化时的洗脱液为nacl溶液；所述nacl溶液的初始摩尔浓度为0.1～0.5mol/l。在本发明中，步骤(5)所述纯化结束后可以加入食品领域可以接受的辅料，用于遮盖铁蛋白的腥味。步骤(5)所述干燥为冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为-60～-50℃，优选为-55℃；所述冷冻干燥的时间为22～26h，优选为24h。
48.本发明还提供了所述的制备方法制备得到的天然蛋白基纳米铁，所述天然蛋白基纳米铁中所含的铁蛋白含量≥112.9g/kg。
49.本发明还提供了所述的天然蛋白基纳米铁在制备功能食品方面的应用。
50.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.实施例1
52.取牛脾300g、猪脾100g置于去离子水中，4℃浸泡14h后，取出，用剪刀将牛脾和猪脾的脂肪组织和结缔组织剔除，放入搅拌机中，加入400ml去离子水，搅拌至粒径为0.5mm的
组织。
53.将粒径为0.5mm的组织在转速为19000rpm的均质机中均质15s后，调到低档，停止均质，重复均质8次，得到均质液。将均质液在65℃水浴锅中水浴10min后，利用4层纱布过滤，取滤液，在6℃，转速为10000rpm的离心机中离心10min，取上清液，将所述上清液在3层纱布中再次过滤去除铁蛋白中的油层，取滤液得到含有铁蛋白的溶液。
54.在所述含有铁蛋白的溶液中加入硫酸铵，用于沉淀蛋白，硫酸铵的加入量至终浓度为50wt％时停止加入，之后4℃静置2h，得到含有沉淀的混合物。在含有沉淀的混合物中加入ph为7.5，初始摩尔浓度为25mmol/l的tris-hcl溶液1l待混合物中的沉淀溶解后，在70℃水浴锅中水浴15min，在2℃，12000rpm的离心机中离心10min，收集上清液。将上清液在ph为7.5，初始摩尔浓度为25mmol/l的tris-hcl中透析3次，每次6h，去除铁蛋白溶液中的硫酸铵。将透析液过deae柱，洗脱液为初始摩尔浓度为0.3mol/l的nacl溶液。收集洗脱液在-50℃条件下冷冻干燥26h，得到天然蛋白基纳米铁。
55.取1g天然蛋白基纳米铁置于白色瓷盘中，在自然光下观察其色泽和状态。感官形态如表1所示。
56.参照gb 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》，电感耦合等离子体质谱法测定天然蛋白基纳米铁中的铁含量，结果如表2所示。
57.参照gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，凯氏定氮法测定天然蛋白基纳米铁中蛋白含量以及铁蛋白的含量，结果如表3所示。
58.采用透射电镜直接观察天然蛋白基纳米铁的尺寸形貌，结果如图1所示。
59.图1显示，本发明的方法制备得到的天然蛋白基纳米铁为一个球状纳米颗粒，外层为蛋白质，中心为铁核，天然蛋白基纳米铁颗粒的外径为12nm，内径为8nm。
60.实施例2
61.取牛脾100g、牛肝200g置于去离子水中，6℃浸泡10h后，取出，用剪刀将牛脾和牛肝的脂肪组织和结缔组织剔除，放入搅拌机中，加入600ml去离子水，搅拌至粒径为0.3mm的组织。
62.将粒径为0.3mm的组织在转速为15000rpm的均质机中均质20s后，调到低档，停止均质，重复均质7次，得到均质液。将均质液在70℃水浴锅中水浴8min后，利用6层纱布过滤，取滤液，在4℃，转速为12000rpm的离心机中离心15min，取上清液，将所述上清液在1层纱布中再次过滤去除铁蛋白中的油层，取滤液得到含有铁蛋白的溶液。
63.在所述含有铁蛋白的溶液中加入硫酸铵，用于沉淀蛋白，硫酸铵的加入量至终浓度为30wt％时停止加入，之后6℃静置1h，得到含有沉淀的混合物。在含有沉淀的混合物中加入ph为8，初始摩尔浓度为30mmol/l的tris-hcl溶液1l待混合物中的沉淀溶解后，在65℃水浴锅中水浴10min，在4℃，10000rpm的离心机中离心20min，收集上清液。将上清液在ph为7.0，初始摩尔浓度为20mmol/l的tris-hcl中透析2次，每次7h，去除铁蛋白溶液中的硫酸铵。将透析液过deae柱，洗脱液为初始摩尔浓度为0.3mol/l的nacl溶液。收集洗脱液，将所述洗脱液与40g磷虾油、50g透明质酸、45g麦芽低聚糖、40g单双甘油脂肪酸酯、50g天然草莓香料混合，得到混合液，将所述混合液静置6h后，置于12000rpm的均质机中均质7次，每次20s，均质后得到的混合物在-60℃条件下冷冻干燥22h，得到含有天然蛋白基纳米铁。
64.取1g含有天然蛋白基纳米铁，置于白色瓷盘中，在自然光下观察其色泽和状态。感
官形态如表1所示。
65.参照gb 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》，电感耦合等离子体质谱法测定天然蛋白基纳米铁中的铁含量，结果如表2所示。
66.参照gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，凯氏定氮法测定天然蛋白基纳米铁中蛋白含量以及铁蛋白的含量，结果如表3所示。
67.表1本发明制备得到的天然蛋白基纳米铁的感官形态
68.项目实施例1实施例2色泽淡黄色或黄棕色淡黄色或淡黄棕色气味略腥，无其他异味清甜味，无其他异味组织形态粉状，无结块现象粉状，无结块现象杂质无肉眼可见的外来杂质无肉眼可见的外来杂质
69.表1显示，本发明的方法制备得到的天然蛋白基纳米铁纯度高，无杂质。加入食品领域可以接受的辅料用于制备天然蛋白基纳米铁可以遮盖铁蛋白的腥味。
70.表2本发明制备得到的天然蛋白基纳米铁中的铁含量
71.项目实施例1实施例2铁含量/(g/kg)0.0870.086
72.表2显示，本发明的方法制备得到的天然蛋白基纳米铁中铁含量大于0.086g/kg。说明本发明的方法可以得到铁含量高的纳米铁。
73.表3本发明制备得到的天然蛋白基纳米铁中蛋白的含量
74.项目实施例1实施例2蛋白质含量/％72.060.1铁蛋白含量/(g/kg)114.1112.9
75.表3显示，本发明的方法制备得到的天然蛋白基纳米铁中蛋白质的含量大于60.1％，铁蛋白的含量大于112.9g/kg。说明本发明的方法可以制备得到蛋白质含量和铁蛋白含量均高的纳米铁。
76.由以上实施例可知，本发明提供了一种天然蛋白基纳米铁及其制备方法与应用。按照本发明的制备方法得到天然蛋白基纳米铁，可补充铁元素和蛋白质。与现有技术补充铁的制剂相比，本发明的天然蛋白基纳米铁的纳米颗粒小且均一，制备过程无污染，并且纳米铁以蛋白作为载体，含铁量高，生物相容性好，没有副作用，食用方便。本发明的制备方法制备得到的天然蛋白基纳米铁颗粒外径为12nm，内径为8nm，并且体蛋白含量≥112.9g/kg。
77.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。