一种豌豆蛋白凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及食品领域，具体涉及一种豌豆蛋白凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着消费者对环境和健康问题的日益关注，植物蛋白质作为动物蛋白的替代蛋白质的研究越来越多。豆类蛋白质是植物蛋白质的主要来源，其中豌豆蛋白具有低过敏性、不存在转基因问题，因而具有“更干净”的标签。然而相比于大豆蛋白，豌豆蛋白相对较弱的凝胶性能却限制了其广泛应用。因此，本领域迫切需要寻找一种经济有效的方法来提高豌豆蛋白的胶凝能力，制备豌豆蛋白凝胶，使其在食品应用中发挥重要作用。
3.蛋白质交联技术是改善植物蛋白功能特性的重要手段。其中，酶交联技术因其无毒、温和、环保、可生物降解等优点而受到广泛关注。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(microbialtransglutaminases,mtg，ec：2.3.2.13)通过催化谷氨酰胺残基的γ-羧胺基团(酰基供体)和赖氨酸残基的ε-氨基(酰基受体)之间的酰基转移反应，从而导致分子内和分子间蛋白交联，产生ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键。mtg诱导的交联已被广泛用于改善植物蛋白的质构和凝胶特性，包括豌豆、大豆、小麦和蚕豆分离蛋白。然而，豌豆蛋白是紧密的球形蛋白，谷氨酰胺或/和赖氨酸残基被包埋在疏水核中，不利于与mtg的相互接触，从而限制了mtg介导的交联反应，因此，仅仅通过酶交联反应制备豌豆蛋白凝胶的凝胶性能仍有待提升。
4.目前已有一些研究报道试图提高mtg交联度，进而改善豌豆蛋白凝胶的性能。例如非专利文献“gelationbehaviorsofdenaturatedpeaalbuminandglobulinfractionsduringtransglutaminasetreatment”公开了：通过二硫苏糖醇(dtt)化学还原或在80℃下热处理使豌豆蛋白变性，从而提高了豌豆分离蛋白的酶交联度。又如中国专利文献cn114027392a公开了：以豌豆蛋白、多糖为原料，经谷氨酰胺转氨酶共价交联再由金属离子对多糖进行离子交联使之形成致密的双网络结构，除去未参与反应的金属离子，制备得到双网络豌豆蛋白水凝胶，该双网络豌豆蛋白水凝胶营养健康、冻融稳定性好、质构性能好。
5.虽然上述技术方案在改善豌豆蛋白的酶交联度和豌豆蛋白凝胶功能性质方面是有效的，但其中涉及到了一些化学试剂的添加或繁琐的加工步骤。因此，寻找一种安全、简单、有效的方法提高mtg对豌豆蛋白的交联效果以制备凝胶性能好的豌豆蛋白凝胶是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种安全、简单、有效的方法提高mtg对豌豆蛋白的交联效果以制备凝胶性能好的豌豆蛋白凝胶。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)预处理：用柠檬酸盐溶液溶解豌豆蛋白，充分水合，得到豌豆蛋白溶液；
10.(2)酶交联：向步骤(1)得到的豌豆蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶发生交联反应，得到酶交联产物；
11.(3)成胶：将步骤(2)得到的酶交联产物加热后冷却，得到所述豌豆蛋白凝胶。
12.进一步地，步骤(1)中，所述柠檬酸盐溶液的浓度为0.3mol/l。
13.进一步地，步骤(1)中，所述豌豆蛋白溶液中豌豆蛋白的浓度为 0.15～0.20g/ml。
14.进一步地，步骤(1)中，所述柠檬酸盐溶液为柠檬酸钠溶液。
15.进一步地，步骤(1)中，所述充分水合的温度为4℃，时间为12～18h。
16.进一步地，步骤(2)中，每克豌豆蛋白溶液中加入5～10u谷氨酰胺转氨酶。
17.进一步地，步骤(2)中，所述酶交联反应的温度为37℃，时间为120min。
18.进一步地，步骤(3)中，所述加热的温度为95～100℃，时间为10～20min；所述冷却的温度为4℃，时间为12～18h。
19.第二方面，本发明提供所述的制备方法得到的豌豆蛋白凝胶。
20.第三方面，本发明提供所述的制备方法得到的豌豆蛋白凝胶在食品中的应用。
21.本发明技术方案，具有如下优点：
22.本发明通过柠檬酸盐溶液对豌豆蛋白进行预处理，然后加入谷氨酰胺转氨酶发生交联反应，最后成胶制得豌豆蛋白凝胶。经实验证明，利用柠檬酸盐溶液预处理豌豆蛋白相较于不添加柠檬酸盐预处理而言，与mtg反应制备的凝胶的交联度、平均粒径和和质构性能有着明显提升。本发明提供的该方法安全、简单且廉价，制得的豌豆蛋白凝胶具有优良的凝胶性能，拓宽了豌豆蛋白作为动物蛋白的替代蛋白在肉类似物中的应用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是本发明实验例1中各组样品的交联度分析结果；
25.图2是本发明实验例2中各组样品的粒径分析结果。
26.图3是本发明实施例1和对比例1～7制得的豌豆蛋白凝胶的图片。
具体实施方式
27.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
28.原料及仪器来源：
29.豌豆：天津农贸市场；
30.谷氨酰胺转氨酶：天津西玛有限公司；
31.四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、乙醇、柠檬酸钠、碳酸钠、硫酸钠均为国产分析纯；
32.透析袋：北京索莱宝生物科技有限公司；
33.beckman coulter ls-13320 mw激光衍射粒度分析仪：美国贝克曼库尔特公司；
34.双光束紫外可见分光光度计：美国thermo公司；
35.ta.xt plus质构仪:英国sms公司；
36.yc－1型层析冷柜：北京德天佑科技发展有限公司。
37.实施例中各溶液的配制方法如下：
38.邻苯二甲醛溶液：7.620g四硼酸钠和100mg十二烷基硫酸钠(sds) 溶解于75ml去离子水中，用2ml乙醇溶解80mg邻苯二甲醛，两者混合并定容至100ml；
39.醋酸钠溶液(0.3m)：82.03g醋酸钠溶解于去离子水中，定容1l；
40.柠檬酸钠溶液(3m)：77.421g柠檬酸钠(c6h5na3o7)溶解于去离子水中，定容至1l；
41.碳酸钠溶液(3m)：31.797g碳酸钠(na2co3)溶解于去离子水中，定容至1l；
42.硫酸钠溶液(3m)：42.612g硫酸钠(na2so4)溶解于去离子水中，定容至1l。
43.实施例1中豌豆蛋白的提取方法如下：
44.将豌豆瓣用粉碎机粉碎成细粉，然后过100目筛，豌豆粉300g加入到 1000ml的醋酸钠溶液(0.3m)中，用5mol/l乙酸将溶液调pη至8.0，在室温下搅拌1h，5000r/min离心20min，取上清液，按照体积比1：5将上清液与蒸馏水混合，放到4℃的层析柜中2h，然后5000r/min离心10min，取沉淀，加入到蒸馏水中充分重悬，透析3天(每天更换蒸馏水，透析袋截留分子量3000kda)，冷冻干燥得豌豆蛋白。
45.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本技术实施例中采用的原料或仪器。
46.实施例1
47.本实施例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，各步骤如下：
48.(1)预处理：取15g豌豆蛋白，用配制好的柠檬酸钠溶液(3m)定容至100ml，置于4℃层析柜充分水合12h，得到豌豆蛋白溶液；
49.(2)酶交联：向步骤(1)得到的豌豆蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶于37℃交联反应120min，其中，每克豌豆蛋白溶液中加入5u谷氨酰胺转氨酶，得到酶交联产物；
50.(3)成胶：将步骤(2)得到的酶交联产物在95℃下加热10min后置于4℃层析柜冷却12h，得到豌豆蛋白凝胶。
51.对比例1
52.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用去离子水替换柠檬酸钠溶液。
53.对比例2
54.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用碳酸钠溶液(3m)替换柠檬酸钠溶液。
55.对比例3
56.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用硫酸钠溶液(3m)替换柠檬酸钠溶液。
57.对比例4
58.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，省去酶交联的步骤。
59.对比例5
60.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用去离子水替换柠檬酸钠溶液，并且省去酶交联的步骤。
61.对比例6
62.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用碳酸钠溶液(3m)替换柠檬酸钠溶液，并且省去酶交联的步骤。
63.对比例7
64.本对比例提供一种豌豆蛋白凝胶的制备方法，具体步骤参照实施例1，不同之处仅在于，预处理步骤中用硫酸钠溶液(3m)替换柠檬酸钠溶液，并且省去酶交联的步骤。
65.实验例1交联度分析
66.利用邻苯二甲醛(opa)方法测定mtg酶交联产物的交联度。
67.以实施例1、对比例1～3步骤(2)得到的酶交联产物作为待测样品，分别记为ci-mtg(柠檬酸钠与mtg协同处理)、dw-mtg(去离子水与mtg协同处理)、ca-mtg(碳酸钠与mtg协同处理)和su-mtg(硫酸钠与mtg协同处理)，交联度的测定方法如下：
68.将待测样品用pbs缓冲液稀释至10mg/ml的浓度(即每毫升稀释液含有10mg的豌豆蛋白)，并以4500
×
g离心10min；取上清液50μl与临用前配制的opa溶液2ml充分混合，并准确孵育2min；通过双光束紫外可见分光光度计在室温下测量340nm处的吸光度；按照下式计算待测样品的交联度：
[0069][0070]
式中，abs(1)是交联样品的吸光度，abs(0)是非交联样品(即省去酶交联步骤，豌豆蛋白溶液)的吸光度。每个待测样品做三次平行实验。
[0071]
如图1所示，同样是加入谷氨酰胺转氨酶于37℃交联反应120min，加入柠檬酸钠预处理相较于去离子水预处理而言，交联度显著增加，由44.6％增加至74.3％(提高约66.67％)，而加入碳酸钠预处理相较于去离子水预处理交联度显著降低，加入硫酸钠预处理相较于去离子水预处理交联度略升高但不显著。由此可见，柠檬酸根离子相较于去离子水和碳酸根离子、硫酸根离子明显更有利于促进mtg交联反应，提高交联度，进而有利于提升制备所得凝胶的性能。
[0072]
实验例2粒径分析
[0073]
使用beckman coulter ls-13320 mw激光衍射粒度分析仪结合偏振强度微分散射(pids)技术测量每个样品的粒度分布。
[0074]
以实施例1、对比例1～3步骤(2)得到的酶交联产物、对比例4～7步骤(1)得到的豌豆蛋白溶液作为待测样品，分别记为ci-mtg(柠檬酸钠与mtg协同处理)、dw-mtg(去离子水与mtg协同处理)、ca-mtg (碳酸钠与mtg协同处理)、su-mtg(硫酸钠与mtg协同处理)、ci (柠檬酸钠处理)、dw(去离子水处理)、ca(碳酸钠处理)、su(硫酸钠处理)，粒径的测定方法如下：
[0075]
待测样品进样1-2ml，机器软件(beckman coulter，ls13 320)使用激光衍射角计
算尺寸分布(输出)作为球体直径的体积当量(受粒径影响)。
[0076]
为了更直观地观察mtg的交联效果，图2显示了加入盐处理豌豆蛋白的情况下，添加和不添加mtg处理的豌豆蛋白平均粒径的变化。可见，未处理的豌豆蛋白(dw)的平均粒径约为13.48μm，而经硫酸钠处理的豌豆蛋白与之没有显著差异，在碳酸钠和柠檬酸钠处理后平均粒径分别增加至 20.37μm和20.87μm，而且可以清楚地看到在100μm附近出现一个小峰，这可能是由于蛋白质形成了一些更大的蛋白质聚集体。此外，与仅仅加入盐处理相比，所有经盐预处理后mtg交联处理的豌豆蛋白样品的粒径分布均向右移，表明豌豆蛋白溶液与mtg发生了交联反应，并且su-mtg和 ci-mtg的平均粒径分别是su和ci的7.95倍和6.68倍。结果表明，柠檬酸钠和硫酸钠预处理更有利于mtg的交联反应，从而导致更多更大的聚集体的形成，这一结论与交联度的变化趋势相一致。
[0077]
实验例3质构参数分析
[0078]
使用ta.xt plus质构仪进行质构分布分析(tpa)以研究凝胶的质构参数(硬度、弹性、内聚性、粘性、咀嚼性和回弹性)。
[0079]
以实施例1、对比例1～3、对比例4～7制备的豌豆蛋白凝胶作为待测样品，分别记为ci-mtg(柠檬酸钠与mtg协同处理)、dw-mtg(去离子水与mtg协同处理)、ca-mtg(碳酸钠与mtg协同处理)、su-mtg (硫酸钠与mtg协同处理)、ci(柠檬酸钠处理)、dw(去离子水处理)、 ca(碳酸钠处理)、su(硫酸钠处理)，每组各取三个样品进行检测，检测结果以均值
±
标准差的形式记录，各组质构参数检测结果如表1所示。
[0080]
表1各组样品的质构参数
[0081][0082][0083]
如表1所示，dw凝胶样品的硬度、粘性、咀嚼性和回弹性比添加盐处理的样品更高，而dw的弹性略低于ci。通常，凝胶硬度受凝胶网络结构的形成影响，而疏水相互作用和二硫键是蛋白质凝胶网络结构形成的主要原因。至于盐处理制备的豌豆蛋白凝胶，碳酸根(co
32-)、柠檬酸根 (c6h5o
73-)和硫酸根(so
42-)的强烈水化严重破坏了蛋白质的结构，导致蛋白质的疏水性较高，而这些疏水基团的暴露对豌豆蛋白质本身的硬度产生了不利影响，这可能是由于蛋白质结构的展开不利于凝胶形成过程中的疏水相互作用。
[0084]
此外，由表1可以看出，添加mtg对所有豌豆蛋白凝胶的tpa参数均有显著影响。与不添加mtg制得的凝胶样品相比，添加mtg制得的凝胶样品具有更高的硬度、粘性、内聚性和
咀嚼性。交联物质构属性的改善可能归因于mtg介导ε-氨基和γ-羧胺之间共价键的形成，即gln-lys异肽键，其强度约为非共价键的20倍。正如交联度所示，凝胶硬度在柠檬酸钠和mtg协同作用(ci-mtg)时最高，其次是su-mtg和dw-mtg以及 ca-mtg，这可能归因于柠檬酸根离子会诱导蛋白质暴露出更多的交联活性位点，从而提升了mtg交联反应的可及性。值得注意的是，ca-mtg 的硬度较低，弹性略有增加，这是由于其粒径较小，有利于形成结构均匀、更具弹性的凝胶。
[0085]
经计算，柠檬酸钠预处理后与mtg交联制得的豌豆蛋白凝胶与不加入柠檬酸钠预处理制得的凝胶而言，硬度提高了49.54％，粘度提高了82.91％，咀嚼度提高了83.88％，弹性提高了73.68％。
[0086]
如图3所示，第一排是分别是dw(去离子水处理)、ca(碳酸钠处理)、ci(柠檬酸钠处理)、su(硫酸钠处理)，第二排是分别加入mtg 交联反应。从图中可以看出，四种预处理的方法不能使豌豆蛋白完全成型，但是经过柠檬酸钠、硫酸钠处理后的豌豆蛋白相比其余处理的结构比较紧密，从第二排的图可以看出，只有mtg酶和柠檬酸钠二者相结合，才能使豌豆蛋白成型较好，除此之外，其余处理都影响成型效果。
[0087]
由上述实验例证明，添加柠檬酸钠预处理相较于去离子水或添加其他钠盐预处理而言，显著提高了mtg交联度和蛋白粒径，凝胶性能得到明显提升。
[0088]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。