使用乳糖酶和LAC(-)乳酸菌(LAB)生产发酵乳制品的制作方法

本发明涉及用于生产发酵结束时具有相对稳定ph值的发酵乳制品(例如，帕斯塔菲拉塔奶酪)的方法，其包括使用乳糖酶和乳酸菌。

背景技术：

1、食品工业使用许多细菌，特别是乳酸菌，来改善例如，食品的味道和质地。在乳业中，广泛使用乳酸菌(lab)不仅为了实现乳的酸化(通过发酵)而且也为了例如，对掺入其的产品进行质构化。

2、控制后酸化具有重要的商业意义。

3、在本领域中，术语“后酸化”通常描述为涉及lab在发酵终止后产生乳酸-例如，wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)第1-2页的段落中写道：

4、“即使在包括快速冷却步骤的方法中，也可以观察到后酸化，即lab在终止发酵后(即在已达到期望的ph之后)仍产生乳酸。现今，认为后酸化代表乳制品发酵期间最重要的问题之一。在发酵乳制品的加工和储存期间ph值的进一步降低导致酸度升高和有效期缩短的问题。”

5、wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)描述了用于改善后酸化控制的不同技术方案，例如：

6、(i)：向乳中加入蔗糖，并使用此蔗糖作为包含乳糖缺陷型(lac(-))嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)细菌(本文称为“st lac(-)细菌”)的发酵剂的唯一可用碳源-参见例如工作实施例2和3，其中使用了包含st chcc17861lac(-)菌株的所谓acidifix培养物；或者

7、(ii)：一种方法，其中在乳糖酶存在下用发酵剂进行发酵-参见例如第23页的方法“e”。

8、关于上面讨论的解决方案(i)，wo2015/193459a1的第34-35页上写道:

9、“本发明生产帕斯塔菲拉塔奶酪的方法可以包括以下方法步骤：

10、·获得具有标准化蛋白质、脂肪和固体的乳制品；

11、·添加足以进行酸化培养的蔗糖；

12、·将温度调节至凝固温度(32℃-38℃)；

13、·添加acidifix培养物(嗜热链球菌chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)chcc18944)；……”

14、帕斯塔菲拉塔奶酪是通过包括凝乳热处理步骤的方法生产的奶酪。热处理步骤赋予成品奶酪纤维结构和特殊的拉伸性能。典型的帕斯塔菲拉塔奶酪包括马苏里拉和普罗沃龙、卡西欧卡伐罗、pallone di gravina和斯卡莫扎奶酪。

15、制作帕斯塔菲拉塔奶酪的过程可以包括以下步骤：

16、(1)使乳酸化；

17、(2)使所得到的酸化乳凝结以形成凝结物；

18、(3)切割凝结物以获得凝乳，并将凝乳加热至合适的目标温度；

19、(4)将凝乳酸化至钙矿化的目标水平以形成产品；

20、(5)加热产品；和

21、(6)拉伸产品。

22、如本领域所知，对于钙矿化的最佳水平以及凝乳的质量/强度，重要的是“(4)酸化凝乳”步骤的ph值在重要的ph 5.0-5.8左右，因此，控制后酸化对于例如制作帕斯塔菲拉塔奶酪具有重要的商业意义。(参见，例如“pulari krishnankutty nair.“new trends forlow moisture part skim mozzarella(pizza cheese)”.ec nutrition 15.3(2020):01-05”或“帕斯塔菲拉塔，融化且伸展的奶酪；https://www.italianfoodtech.com/the-cheese-that-melts-and-stretches/”)。

23、上面讨论的pulari k.nair的文章写道：

24、“现在，在奶酪乳中添加一天(原文如此)的柠檬酸被广泛用于制作传统的高水分(例如，55％至60％)马苏里拉奶酪。”

25、如今，直接柠檬酸酸化在帕斯塔菲拉塔制造程序中广泛使用的一个原因与现今使用的基于乳酸菌程序的后酸化问题有关。

26、如本领域所知-在一些乳品场中使用直接酸化限制了乳酸菌产生的芳香化合物的产生，且因此最终奶酪中缺乏该风味。

27、上面讨论的参考文献wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)没有直接且毫无疑义地描述乳糖酶与lac(-)lab(例如，st lac(-)细菌)的组合使用-它在说明书中没有这样公开，并且在实施例中仅酸奶实施例5中使用了乳糖酶，但其没有指定lab的类型或它们能够代谢什么(例如是否为lac(-))。

28、在wo2018/130630a1(chr.hansen a/s,denmark)的第1页第20-25行引用了ep-a1-2957180(与上面讨论的wo2015/193459a1为同族)，其中写道：“ep-a1-2957180在一项实施方案中公开了使用发酵剂培养物和常规乳糖酶的组合生产发酵乳制品的方法”。

29、ep-a1-2957180的实施例4中使用的所谓常规乳糖酶是ha-乳糖酶tm(chr.hansena/s,denmark)，其也在本文的工作实施例(见下文)被使用。

30、wo2018/130630a1描述了能够在lab发酵期间具有活性的所谓低ph值稳定乳糖酶的使用，该乳糖酶应在发酵步骤的开始、期间或结束时添加(参见例如权利要求1)-在工作实施例中，乳糖酶在发酵开始时与发酵剂一起添加(参见例如第30页，实施例5的第1-2行和其他工作实施例)。

31、因此，wo2018/130630a1没有直接且明确地描述这样的方法，其中，在步骤(a)中将乳糖酶添加到乳中，然后在步骤(b)用lac(-)lab接种步骤(a)的乳。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明要解决的问题是提供用于生产在发酵结束时具有相对稳定ph值的发酵乳制品(例如，帕斯塔菲拉塔奶酪)的方法，且其中所生产的发酵乳制品(例如，帕斯塔菲拉塔奶酪)的优点可以是例如，在例如产品的生产或所生产的发酵乳制品的储存期间具有较低的后酸化。

2、该解决方案是基于本发明人已经确定，可以以受控的方式将乳糖酶与乳糖缺陷型(lac(-))乳酸菌(lab)组合使用，从而其在商业相关规模上(使用至少100l牛奶)可以改善后酸化控制。

3、本文的工作实施例证明，通过使用lac(-)嗜热链球菌(本文称为“st lac(-)细菌”)和lac(-)德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)改善了后酸化控制。

4、鉴于不同类型lac(-)lab的这些阳性结果-相信如本文所讨论的控制后酸化的新方法/构思将适用于基本上所有感兴趣的lac(-)lab。

5、因此，本发明的第一方面涉及生产发酵乳制品的方法，其包括以下步骤：

6、(a)：在使乳糖酶将乳中的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的条件下，将乳糖酶添加到至少100l乳中；

7、(b)：用包含104至1015cfu/g活乳酸菌(lab)细胞的lab组合物接种步骤(a)的乳，其特征在于lab是乳糖缺陷型的(lac(-))且能够代谢葡萄糖(glu(+)，并且任选地还能够代谢半乳糖(gal(+))；

8、(c)：用步骤(b)中的lab lac(-)细菌发酵乳；以及

9、(d)：进行另一个适当的步骤，以最终得到发酵乳制品。

10、由步骤(a)中添加的乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖可被视为步骤(b)的lab(例如stlac(-))可在发酵步骤(c)中使用的主要(如果不是基本上唯一的)糖/碳水化合物。

11、因此，发酵的结束(或者称为发酵的终止)可以说是由步骤(a)乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖在步骤(c)中要发酵乳中的浓度控制的。

12、如上所讨论的，参考文献wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)没有直接且毫无疑义地描述乳糖酶与st lac(-)株的组合使用-它在说明书中没有这样公开，并且在实施例中仅在酸奶实施例5中使用了乳糖酶，但其没有指定任何关于lab类型(例如链球菌、乳杆菌或其他类型的lab)的内容或甚至它们能够代谢什么(例如是否lac(-))。

13、换句话说，上述第一方面的步骤(a)和(b)的组合在wo2015/193459a1中没有被直接且毫无疑义地公开。

14、关于乳糖酶的使用-wo2015/193459a1描述了一种方法，其中在乳糖酶存在下用发酵剂进行发酵-参见例如第23页的方法“e”。

15、第一方面的方法在“乳糖酶使用”方面也是不同的(即，新的)，因为在步骤(a)中将乳糖酶添加到乳中，然后在步骤(b)中用lac(-)lab(例如，st lac(-))接种步骤(a)的乳。

16、如上所讨论的–wo2018/130630a1(chr.hansen a/s,denmark)也没有直接且毫无疑义地描述这样的方法，其中在步骤(a)中将乳糖酶添加到乳中，然后在步骤(b)中用lac(-)lab(例如，st lac(-))接种步骤(a)的乳。

17、在本文的工作实施例中已证明-通过根据第一方面的步骤(a)向乳中添加乳糖酶，有可能产生有限的足以限制lac(-)lab(例如，st lac(-))的活性的量的半乳糖/葡萄糖，并由此控制培养物的生长以达到感兴趣的精确ph。

18、本领域中没有描述或建议该技术信息-例如，在上面讨论的wo2015/193459a1中没有描述或建议，即使它描述了乳糖酶的使用和st lac(-)细菌的使用作为针对后酸化问题的单独可能的解决方案。

19、下面仅以实施例的方式描述本发明的实施方案。

20、附图

21、图1：在添加葡萄糖和半乳糖或蔗糖的情况下用乳糖阴性培养物chcc17861/chcc18944进行酸化。更多细节参见本文的工作实施例1。

22、图2：本图显示乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖(即本文第一方面的步骤(a))限制了用chcc26980 st lac(-)细菌的发酵(即本文第一方面的步骤(c))，并且可以通过调节乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖浓度来控制酸化水平。更多细节参见本文的工作实施例2。

23、图3：对本发明实施例/实施方案的说明，其中在第一方面的步骤(b)之前，通过向未用乳糖酶处理的标准乳添加乳糖酶来标准化步骤(a)中乳糖酶水解的乳，以获得具有期望的葡萄糖/半乳糖浓度的混合乳。

24、图4：这些酸化曲线表明，chcc18944和chcc27906的酸化水平可以根据乳中的可用葡萄糖和半乳糖来控制，通过在标准化之前对乳进行部分水解来控制。更多细节参见本文的工作实施例3。

25、发明详细描述

26、保藏菌株/细胞

27、上面所讨论的wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)的第47页写道：

28、“德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944于2014年6月12日保藏在dsmz-德国微生物保藏中心gmbh，布伦瑞克因霍芬街7b,d-38124，登录号为dsm 28910。

29、嗜热链球菌chcc17861于2014年6月12日保藏在dsmz-德国微生物保藏中心gmbh,布伦瑞克因霍芬街7b,d-38124，登录号为dsm 28952。”

30、下面的保藏菌株是首次与本技术相关的保藏菌株，即它们本身就是新菌株。

31、新型嗜热链球菌细胞chcc26980的样本已保藏在dsmz(德国微生物保藏中心gmbh，布伦瑞克因霍芬街7b，d-38124)，保藏号为dsm 32600，保藏日期为2017年8月22日。保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》的条件进行的。

32、如本文工作实施例中所讨论的-本文的新型保藏的菌株具有本文相关的有利特性。

33、因此，本发明的一个单独方面涉及以登记号dsm 32600保藏的嗜热链球菌细胞chcc26980。

34、本发明的一个单独方面涉及获得以登记号dsm 32600保藏的嗜热链球菌细胞chcc26980的突变株的方法，其包括使用保藏菌株作为起始菌株，制备保藏菌株的突变体，并分离新的突变株，其中该突变株保留了保藏菌株的st lac(-)特性。

35、发酵乳制品

36、第一方面的步骤(a)的乳以及由此得到的第一方面的发酵乳制品的乳可以是例如，如豆奶或动物奶(例如，山羊奶、水牛奶、绵羊奶、马奶、骆驼奶或牛奶)。

37、优选地，乳是牛奶。

38、发酵乳制品优选为乳制品，例如，如酸奶、奶酪、开菲尔或酪乳。

39、可能优选的是，奶酪是例如，新鲜奶酪制品、软奶酪制品、切达干酪、欧式奶酪(continental cheese)、农家奶酪、帕斯塔菲拉塔奶酪、比萨奶酪或马苏里拉奶酪。

40、更优选地，发酵乳制品是农家奶酪或帕斯塔菲拉塔奶酪。

41、最优选的是，发酵乳制品是帕斯塔菲拉塔奶酪，例如，如马苏里拉奶酪、普罗沃龙奶酪、卡西欧卡伐罗奶酪、pallone di gravina或斯卡莫扎奶酪。

42、如本领域已知的-帕斯塔菲拉塔奶酪是通过包括凝乳热处理步骤的方法生产的奶酪。热处理可以通过多种不同的方式进行，包括将凝乳浸泡在热水或乳清中。在另一种替代方案中，将蒸汽注入凝乳中。热处理步骤赋予成品奶酪纤维结构和特殊的拉伸性能。

43、向乳中添加乳糖酶-第一方面的步骤(a)

44、第一方面的步骤(a)如下：“在使乳糖酶将乳中的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的条件下，将乳糖酶添加到至少100l乳中”。

45、如本领域所知-乳糖酶是一种能够将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。

46、关于感兴趣的特定乳糖酶-本领域技术人员知道其在何种条件下具有活性-即乳糖酶将乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的条件。

47、本领域描述了许多不同的合适乳糖酶-例如，如本文工作实施例中使用的ha-lactasetm(chr.hansen a/s,denmark)。

48、可能优选的是，步骤(a)的乳糖酶水解在20℃至45℃的温度进行15分钟至4小时。

49、可能优选的是，添加的乳糖酶的量是100nlu/l至20000nlu/l如，例如，250nlu/l至3000nlu/l乳。

50、中性乳糖酶活力单位(nlu)是本领域技术人员公知的标准单位。

51、例如，取决于感兴趣的乳和发酵乳制品的类型-可能优选的是，在步骤(a)中水解0.5g/l至60g/l的乳糖，例如，如3g/l至55g/l的乳糖或20g/l至55g/l的乳糖。

52、例如，如果步骤(a)中的乳几乎完全被乳糖酶水解，则产生的葡萄糖/半乳糖的量可能过高，而无法获得所期望的最终ph值。

53、在这种情况下，可以向步骤(a)的乳糖酶水解乳中添加未经乳糖酶处理的标准乳，来将步骤(a)的乳糖酶水解乳标准化。

54、因此，可能优选的是，在第一方面的步骤(b)之前，通过添加未经乳糖酶处理的标准乳来标准化步骤(a)中的乳糖酶水解乳，以获得具有所期望的葡萄糖/半乳糖浓度的混合乳。

55、就上述而言，可能优选的是，在步骤(a)中水解20g/l至55g/l的乳糖，并且随后且在第一方面的步骤(b)之前，通过添加未经乳糖酶处理的标准乳将乳糖酶水解乳标准化，以获得具有所期望的葡萄糖/半乳糖浓度的混合乳-例如，如所期望的葡萄糖浓度为0.5g/l到10g/l，例如1g/l到10g/l。

56、在步骤(a)中，可以将一种或几种可发酵的碳水化合物添加到乳中。

57、添加的可发酵碳水化合物优选不同于乳糖，例如蔗糖、葡萄糖或半乳糖。

58、优选地，在第一方面的步骤(b)之前，将乳糖酶灭活(通过例如加热步骤，例如，如巴氏灭菌步骤)。

59、可能优选的是，第一方面的步骤(a)涉及将乳糖酶添加到至少200l乳或至少1000l乳中。

60、用lablac(-)细菌接种乳-第一方面的步骤(b)

61、第一方面的步骤(b)如下：

62、“(b)：用包含104至1015cfu/g活乳酸菌(lab)细胞的lab组合物接种步骤(a)的乳，其特征在于lab是乳糖缺陷型的(lac(-))且能够代谢葡萄糖(glu(+))，并且任选地还能够代谢半乳糖(gal(+))”。

63、与现有技术一致-在本发明的上下文中使用术语“乳糖缺陷型”来表征已失去使用乳糖作为细胞生长或维持细胞活力来源的能力的乳酸菌(lab)。

64、优选地，第一方面的步骤(b)的乳酸菌(lab)是嗜热链球菌(st)、乳杆菌属(lactobacillus)(优选德氏乳杆菌保加利亚亚种)和/或乳球菌属(lactococcus)(乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp lactis)或乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcuslactis subsp cremoris))。

65、优选地，第一方面的步骤(b)的乳酸菌(lab)是嗜热链球菌(st)。

66、st lac(-)细菌是技术人员已知的，并且技术人员可以常规地鉴定/获得适合本文的st lac(-)细菌(参见例如上面讨论的wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark))。

67、天然/野生型st细菌能够代谢葡萄糖-因此，明显地，获得/鉴定适合本文的st glu(+)细菌是技术人员的常规工作。

68、天然/野生型st细菌通常不能代谢半乳糖。

69、然而，许多合适的st gal(+)细菌是技术人员已知的-技术人员可以常规地鉴定/获得适合本文的st gal(+)细菌(参见例如上面讨论的wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)和wo2019/042881a1(chr.hansen a/s))。

70、在本文中，可能优选的是，步骤(b)的细菌细胞也能够代谢半乳糖(gal(+))。

71、其一个原因是，由于lab gal(+)(优选st gal(+)细菌)也能够代谢第一方面的乳糖酶水解步骤(a)产生的半乳糖，因此可以使用更少量的乳糖酶以获得发酵结束时所期望的ph值。

72、另一个原因是，例如，使用st gal(+)细菌可以减少与例如制造帕斯塔菲拉塔奶酪(例如，如马苏里拉奶酪)相关的褐变(参见例如wo2019/042881a1(chr.hansen a/s))-参见例如本文的工作实施例4。

73、优选地，在第一方面的步骤(b)中，用每克乳104cfu至1015cfu(或104cfu至1014cfu)(菌落形成单位)的活lab细菌细胞接种乳，包括每克乳至少105cfu，例如至少106cfu/g乳，例如至少107cfu/g乳，例如至少108cfu/g乳，例如至少109cfu/g乳，例如至少1010cfu/g乳或例如至少1011cfu/g乳。

74、优选地，嗜热链球菌(st)细菌细胞是选自由以下组成的组的至少一种细胞：

75、(a)：以登记号dsm 28952保藏的嗜热链球菌细胞chcc17861；以及

76、(b)：以登记号dsm 32600保藏的嗜热链球菌细胞chcc26980。

77、lab细胞可以是不同lab株的混合物-例如，如不同st株的混合物(例如，本文讨论的chcc17861和chcc26980的混合物)-例如一种st株(例如，chcc17861)108cfu/g乳的+另一种st株(例如，chcc26980)108cfu/g乳，这意味着总共对乳接种了2x108 cfu/g乳的活st细菌细胞。

78、通常，细菌(例如，发酵剂组合物)以浓缩形式存在，包括冷冻、干燥或冻干的浓缩物。

79、例如，在第一方面的步骤(b)中，还可以在乳中接种其他感兴趣的乳酸菌(lab)-例如104至1015cfu/g乳杆菌细胞。

80、例如，如果在步骤(b)中用104至1015cfu/g lab gal(+)细胞接种，那么当然也可以用例如其它感兴趣的lab gal(-)细胞接种。

81、其他感兴趣的lab也应该优选为乳糖缺陷型lab-因此，在步骤(b)中，优选对乳接种不超过103个非乳糖缺陷型细菌细胞，更优选接种不超过102个非乳糖缺陷型细菌细胞，且最优选不接种非乳糖缺陷型细菌细胞。

82、可能优选的是(例如，如果发酵乳制品是酸奶)，在步骤(b)中还接种104至1015cfu/g的活乳糖缺陷型德氏乳杆菌保加利亚亚种-最好是乳糖缺陷型德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944，保藏号为dsm 28910(上面讨论的wo2015/193459a1)。

83、用细菌发酵乳-第一方面的步骤(c)

84、第一方面的步骤(c)如下：“用步骤(b)中的lab lac(-)细菌发酵乳”。

85、步骤(b)的发酵条件通常可以是与感兴趣的lab细菌相关的标准的、合适的lab发酵条件。

86、技术人员知道如何用相关细菌发酵乳以制备感兴趣的发酵乳制品(例如奶酪)-因此，在本文中无需对此进行详细描述。

87、根据现有技术并取决于例如所使用的st，发酵温度可以例如从25℃至48℃，例如，如从35℃至48℃。

88、根据现有技术，第一方面的步骤(b)中的发酵时间可以是2小时至96小时，例如3小时至72小时或例如4小时至48小时。

89、可能优选的是，第一方面的步骤(b)中的发酵时间可以是2小时至30小时，例如3小时至24小时。

90、优选地，步骤(c)的发酵在其中发酵以相对稳定ph值结束的条件下进行，所述相对稳定的ph值被定义为在发酵的最后2小时期间ph变化不超过ph0.1。

91、技术人员知道何时发酵结束，在本文中，这基本上可被视为涉及ph不再显著下降/降低。

92、如上所讨论的，由步骤(a)中添加的乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖可被视为步骤(b)的lab lac(-)细菌可在发酵步骤(c)中使用的主要(如果不是基本上唯一的)糖/碳水化合物。

93、因此，发酵的结束(或者称为发酵的终止)可以说是由步骤(a)乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖在步骤(c)中要发酵乳中的浓度控制的。

94、步骤(c)发酵结束时感兴趣的ph值通常取决于感兴趣的发酵乳制品。

95、例如-步骤(c)发酵结束时的ph值可以是ph 3.2到6.2，例如ph 3.8到6.0。

96、制作帕斯塔菲拉塔奶酪的过程可以包括以下步骤：

97、(1)使乳酸化；

98、(2)使所得到的酸化乳凝结以形成凝结物；

99、(3)切割凝结物以获得凝乳，并将凝乳加热至合适的目标温度；

100、(4)将凝乳酸化至钙矿化的目标水平以形成产品；

101、(5)加热产品；和

102、(6)拉伸产品。

103、如本领域所知，对于钙矿化的最佳水平以及凝乳的质量/强度，重要的是“(4)酸化凝乳”步骤的ph值在ph 5.0-5.8左右-因此，控制后酸化对于例如制作帕斯塔菲拉塔奶酪具有重要的商业意义。

104、如果感兴趣的发酵乳制品是帕斯塔菲拉塔奶酪，则在涉及凝乳酸化的第一方面的发酵步骤(c)期间，优选凝乳酸化步骤结束时的ph值为ph 5.0至5.8。

105、制备感兴趣的发酵乳制品的另外的适当步骤-第一方面的步骤(d)

106、第一方面的步骤(d)涉及进行另一个适当的步骤，以最终得到感兴趣的发酵乳制品。

107、如上所讨论的，技术人员知道如何制作感兴趣的发酵乳制品(例如，奶酪或酸奶)-因此，无需在本文中对此详细描述。

108、实施例

109、实施例1：用乳糖阴性培养物chcc17861/chcc18944对添加了葡萄糖、半乳糖和/或蔗糖的b乳进行酸化

110、保藏菌株：

111、chcc17861：dsm 28952st lac(-)、glu(+)、gal(+)菌株

112、chcc18944：dsm 28910德氏乳杆菌保加利亚亚种lac(-)、glu(+)gal(-)菌株

113、如上所讨论的，wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)中公开了chcc17861和chcc18944。

114、添加糖-酸化实验：

115、采用过夜培养物进行酸化实验：

116、将chcc17861接种于12ml m17-1％葡萄糖中。

117、将chcc18944接种于10ml mrsdifco肉汤中。

118、在37℃厌氧条件下孵育过夜。

119、然后如下将培养物接种在200ml称为b乳的半脂乳(1.5％脂肪)：

120、1.0.8％ chcc17861+0.5％葡萄糖

121、2.0.8％ chcc18944+0.5％葡萄糖

122、3.0.8％ chcc17861+0.1％ chcc18944

123、4.0.8％ chcc17861+0.1％ chcc18944+0.5％蔗糖

124、5.0.8％ chcc17861+0.1％ chcc18944+0.5％葡萄糖

125、6.0.8％ chcc17861+0.1％ chcc18944+0.25％葡萄糖+0.25％半乳糖

126、7.b乳+0.25％葡萄糖+0.25％蔗糖+0.25％半乳糖

127、用cinac系统(scientific solutions)在41℃酸化48小时。

128、结果

129、图1的图表显示，在单独乳糖阴性培养物st chcc17861和chcc17861/chcc18944组合中添加0.5％的可发酵碳水化合物后，ph可以稳定下来。混合培养物的初始酸化与是否使用蔗糖、葡萄糖或葡萄糖和半乳糖的混合物无关。然而，添加葡萄糖/半乳糖类似于乳与乳糖酶提前孵育(preincubation)，最终的ph值与单独添加葡萄糖相比更高。

130、结论

131、结果表明，采用单独乳糖阴性培养物st chcc17861或乳糖阴性培养物chcc18944和chcc17861/chcc1894组合培养物，在向乳中添加0.5％的可发酵碳水化合物后，ph可以稳定。

132、实施例2：乳糖酶对乳中乳糖的水解，和st lac(-)细菌培养物st chcc26980的酸化

133、保藏菌株：

134、chcc26980：dsm 32600st lac(-)、glu(+)、gal(-)菌株

135、乳中乳糖的乳糖水解

136、使用(一种用于检测无乳糖乳中残留乳糖的生物传感器测试)重复3次测得的乳糖含量为4.5％。通过对巴氏灭菌乳使用nola拟合剂量计算器，计算出1升脱脂乳必须与5ml ha乳糖酶5200nlu/g(gin：705612，批3488452，密度＝1.175g/m)在30℃、ph6.5和800nlu/l的乳糖酶剂量下孵育1小时，才能将乳糖完全水解为半乳糖和葡萄糖。

137、孵育结束时乳糖残留量用测定不足0.01％。

138、然后将水解的乳在水浴中进行巴氏灭菌(65℃，30min)(当达到65℃的t℃时，开始计时30min)以灭活酶。

139、用乳糖酶水解乳将5升巴氏灭菌部分脱脂乳标准化至2.5g/l葡萄糖和半乳糖

140、由于水解前的乳糖含量为4.5％，(根据化学计量平衡)计算得到2.25％(22.5g/l)的葡萄糖和等量的半乳糖。基于该计算，通过添加标准(即，未经乳糖酶处理的)乳对巴氏灭菌部分脱脂乳进行标准化，以获得2.5g/l的葡萄糖最终含量(存在相同量的半乳糖-例如，参见图3的说明)。

141、菌株的繁殖：

142、 名称 gin 批次 f-dvs@stcth26980(chcc26980) 715582 3462171

143、在1l b乳中加入1％的蔗糖

144、用f-dvs chcc26980接种

145、在37℃孵育过夜

146、ph值为4.6时冷却

147、用0.5m naoh溶液调节ph至标准乳(用于cinac)的初始ph

148、繁殖后使用chcc26980如下进行剂量反应：

149、0.9％26980

150、1.8％26980

151、2.7％26980

152、乳对照品

153、在固定温度41℃下测试

154、运行cinac至少8小时或过夜

155、结果：

156、图2的曲线表明，chcc26980 st lac(-)细菌发酵的最终ph值稳定很多小时，即后酸化控制得到改善。

157、结论：

158、本实施例的结果表明，乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖(即本文第一方面的步骤(a))限制chcc26980 st lac(-)细菌(即本文第一方面的步骤(c))的发酵，并且可以通过调节乳糖酶产生的葡萄糖/半乳糖浓度来控制酸化水平。

159、实施例3：部分脱脂部分水解乳的酸化

160、如以上实施例2所述对有机部分脱脂乳进行水解和标准化。

161、将水解乳标准化，分别得到0.3％和0.5％的葡萄糖(+等量的半乳糖)。

162、

163、按表1所述，酸化进行18小时。

164、结果

165、结果如图4所示，且显示约2小时chcc18944酸化停止且约6小时chcc27906酸化停止。

166、结论

167、chcc18944和chcc27906的曲线表明，通过将葡萄糖和半乳糖的量降低到特定的水平，可以使发酵中断或停止。这一特性在帕斯塔菲拉塔生产过程中具有很高的潜在价值，以避免ph值低于特定工艺的限制，通常在传统工艺中为5.0-5.2。酸化停止在农家奶酪生产过程中也有价值，其中避免后酸化是一种优势，因此菌株chcc27906 st lac(-)的使用可能是有益的。可以通过改变乳中葡萄糖和半乳糖的水平来调节确切ph值的临时稳定，因此可以针对需要稳定在不同ph值的不同奶酪类型例如帕斯塔菲拉塔或农家干酪定制酸化。

168、实施例4：碳水化合物分析

169、分析来自实施例3的酸化乳培养物在发酵结束时的碳水化合物葡萄糖、半乳糖和乳糖的浓度。

170、为此，在dionex ics-5000、ics-6000或integrion系统(thermo fischerscientific,waltham,ma,美国)上，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(hpae-pad)分析单糖和二糖。系统均配备dionextmcarbopactmpa210柱(4mm×250mm，4μm)和egc koh洗脱液发生罐。

171、结果见表2。

172、表2.乳糖酶处理并发酵的乳中碳水化合物分析的结果。结果以mg/g表示

173、

174、与未接种的瓶子(13)相比，半乳糖减少的百分比如表3所示。当使用半乳糖阳性菌株chcc17861或培养物chcc17861+chc18944时，将大量的半乳糖(>90％)发酵。缺少0.3％水解乳的碳水化合物数据。即使我们假设用于单一菌株chcc17861发酵的0.3％乳的原始半乳糖水平更低，那么仍然可以得出结论，半乳糖的主要部分被发酵。

175、这将导致最终产品中半乳糖浓度显著降低的已解释的优势，其可以降低披萨乳酪的褐变水平。

176、其他优点是，在半乳糖浓度升高的情况下，污染物生长的风险更低，而且还避免了由于这些污染物的活性(除了发酵剂的活性)而导致的后酸化，而且由于半乳糖浓度高，乳清的粘性降低，乳清的质量更高。

177、

178、参考文献

179、1.wo2015/193459a1(chr.hansen a/s,denmark)

180、2:pulari krishnankutty nair.“new trends for low moisture part skimmozzarella(pizza cheese)”.ec nutrition 15.3(2020):01-05”或

181、3:帕斯塔菲拉塔，融化且伸展的奶酪；https://www.italianfoodtech.com/the-cheese-that-melts-and-stretches/

182、4:wo2018/130630a1(chr.hansen a/s,denmark)

183、5:wo2019/042881a1(chr.hansen a/s,denmark)