一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法

(一)本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、羊肚菌，又称羊肚子、羊肚蘑、羊雀菌、包谷菌等，是羊肚菌科(morchellaceae)真菌羊肚菌(morchella esculenta)、小顶羊肚菌(morchella angusticeps)、尖顶羊肚菌(morchella conica)、粗柄羊肚菌(morchella crassipes)和小羊肚菌(morchelladeliciosa)等的子实体。羊肚菌多生于潮湿的阔叶林地上，菌盖近球形、卵形至椭圆形，因其菌盖表面常有不规则凹陷和褶皱，且形似羊肚而得名。

2、羊肚菌是我国四大珍贵食用菌之一，其风味独特，富含蛋白质、多糖、叶酸、氨基酸、多酚、三萜和维生素等多种营养成分，含有的人体必需氨基酸种类齐全。羊肚菌最早收录于《本草纲目》，中医认为其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补脑、提神之功能。现代本草专著《中华本草》和《新华本草纲要》对羊肚菌药理作用描述为味甘、性平，和胃消食，化痰理气，可用于消化不良、痰多气短等疾病的治疗。近年的研究表明，羊肚菌表现出显著的抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抑菌、降血脂、护肝、促进胃肠蠕动、提高免疫力等功效，具有极高的营养保健价值和药用价值。古代野生羊肚菌稀少，属于珍惜食品，近些年来，由于人工栽培技术逐渐成熟，市场上供应的羊肚菌增多，已成为人们餐桌上的普通菜肴。羊肚菌提取物含有丰富的营养和活性成分，具有良好的营养和保健功效，添加在饮料等食品中，可以增加它们的营养功效，市场已有羊肚菌保健饮料销售。

3、目前，有不少关于羊肚菌提取物制备方法的报道，按提取使用的溶剂，方法可以分为两类，即乙醇提取法和水提取法。乙醇提取得到的主要是醇溶性物质，包括多酚、三萜和甾醇等，提取的成分较少，产品适用于化妆品中使用；水提取得到的主要是水溶性物质，主要是多糖，以及多肽、低聚糖和氨基酸等，产品适合使用在食品领域。在这两种方法的基础上，有辅以超声波或微波强化提取，能提高提取物的得率。超声辅助提取的设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够理想；微波辅助提取的耗时短、效率高，但由于内部高温，往往会导致提取的活性成分结构受到破坏。

4、近年来，酶解技术在食用菌和植物的活性成分的提取中有广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解食用菌或植物原料，其细胞壁被水解，从而有利于胞内活性成分在提取时溶出。酶解辅助法不仅能够显著提高提取得率，条件温和，不会破坏提取物中活性成分的结构；而且，酶解作用可以降低多糖的分子量，以及将一些糖苷转化为苷元，提取物的生物活性会更好。

5、为了提高羊肚菌提取物的得率和抗氧化活性，本发明用纤维素酶酶解羊肚菌后，再使用超声波热水提取，提取物的得率、多糖含量和抗氧化活性可以显著提高。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，将纤维素酶的酶解技术和超声波提取技术应用于羊肚菌提取物的制备，羊肚菌经纤维素酶酶解后，再经超声波热水提取，提取物的得率显著提高，多糖含量增加，抗氧化活性也显著提高。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，所述方法为：(1)羊肚菌经干燥、切片和粉碎，加入去离子水和纤维素酶，搅拌均匀，构成羊肚菌酶解体系；(2)羊肚菌酶解体系于水温为35–45℃中，酶解4–5h后，转入沸水浴中提取50–60min，再于超声波80–90℃提取25–35min，趁热过滤，收集滤液，得羊肚菌水提液；(3)羊肚菌水提液经减压浓缩，真空干燥，粉碎，获得羊肚菌提取物。

4、进一步，步骤(1)所述的羊肚菌是羊肚菌科(morchellaceae)真菌羊肚菌(morchella esculenta)、小顶羊肚菌(morchella angusticeps)、尖顶羊肚菌(morchellaconica)、粗柄羊肚菌(morchella crassipes)或小羊肚菌(morchella deliciosa)等的子实体。羊肚菌经85℃烘干后，切成薄片，粉碎过60目筛。

5、进一步，步骤(1)所述的去离子水加入体积是按羊肚菌粉质量计的25–35ml/g[即料液比为1:25–1:35(g:ml)]。

6、进一步，步骤(1)所述的纤维素酶加入量是按羊肚菌粉质量计的8％–10％；所述的纤维素酶单位酶活为100u/mg。

7、进一步，步骤(2)所述超声波频率为40khz，功率是160–200w。

8、进一步，步骤(3)从羊肚菌水提液回收羊肚菌提取物的方法为：羊肚菌水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至原去离子水体积的1/20–1/25，获得羊肚菌水提浓缩物，浓缩物于60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得羊肚菌提取物。

9、进一步，本发明所述的纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，具体按以下步骤操作：

10、(1)新鲜羊肚菌清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得羊肚菌粉；

11、(2)羊肚菌粉于烧杯中，加入羊肚菌粉质量计的25–35ml/g去离子水[即料液比为1:25–1:35(g:ml)]，加入按羊肚菌粉质量计8％–10％的纤维素酶，搅拌均匀，构成羊肚菌酶解体系；

12、(3)羊肚菌酶解体系于水温为35–45℃中，酶解4–5h，转入沸水浴中提取50–60min，再于功率为160–200w、温度80–90℃超声波(频率为40khz)中，提取25–35min，趁热过滤，收集滤液，得羊肚菌水提液；

13、(4)羊肚菌水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至原去离子水体积的1/20–1/25，获得羊肚菌水提浓缩物；

14、(5)羊肚菌水提浓缩物于60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得羊肚菌提取物。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明羊肚菌先经过纤维素酶酶解，纤维素酶能够水解羊肚菌细胞壁中的纤维素，使细胞壁破损；再用超声波热水提取，超声波的空穴效应能增强物质分子的运动频率和速度，两者联合作用有助于细胞壁中与纤维素结合的物质和胞内物质溶出，提取物的得率显著提高，多糖含量也显著提高。本发明提供的纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，较直接采用热水提取法相比，羊肚菌提取物的得率可以提高18.8％，多糖含量增加16.7％，提取物的抗氧化活性也有显著提高。

16、(四)具体实施方式

17、下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

18、本发明实施例所用的羊肚菌是羊肚菌科(morchellaceae)的真菌morchellaesculenta的子实体。

19、本发明实施例所述的纤维素酶的活力单位为100u/mg。

20、本发明实施例所述的羊肚菌提取物的提取得率按公式1计算：

21、

22、实施例1：纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法1

23、一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，可以按如下步骤操作：

24、(1)市售新鲜羊肚菌清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得羊肚菌粉；

25、(2)10g羊肚菌粉于500ml烧杯中，加入350ml的去离子水[即料液比为1:35(g:ml)]，加入纤维素酶1.0g(羊肚菌粉质量的10％)，搅拌均匀，构成羊肚菌酶解体系；

26、(3)羊肚菌酶解体系于水温为35℃中，酶解5h，转入沸水浴中提取60min，再于功率为160w、温度80℃超声波(频率为40khz)中提取35min，趁热过滤，收集滤液，得羊肚菌水提液；

27、(4)步骤(3)制备的全部羊肚菌水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至14ml(原去离子水体积的1/25)，获得羊肚菌水提浓缩物；

28、(5)步骤(4)制备的全部羊肚菌水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物4.98g，减去加入的1.0g纤维素酶，羊肚菌提取物质量为3.98g，得率为39.8％。

29、对比例1：实施例1中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取60min后，再于80℃保温35min(未超声)，其他步骤完全相同，10g羊肚菌可制备得3.39g提取物，得率为33.9％。

30、比较实施例1与对比例1的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，羊肚菌的提取物得率由33.9％提高到39.8％，提高了17.4％。

31、实施例2：纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法2

32、一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，可以按如下步骤操作：

33、(1)市售新鲜羊肚菌清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得羊肚菌粉；

34、(2)10g羊肚菌粉于500ml烧杯中中，加入300ml的去离子水[即料液比为1:30(g:ml)]，加入纤维素酶0.9g(羊肚菌粉质量的9％)，搅拌均匀，构成羊肚菌酶解体系；

35、(3)羊肚菌酶解体系于水温为40℃中，酶解4.5h，转入沸水浴中提取55min，再于功率为180w、温度85℃超声波(频率为40khz)中提取30min，趁热过滤，收集滤液，得羊肚菌水提液；

36、(4)步骤(3)制备的全部羊肚菌水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至12ml(原去离子水体积的1/25)，获得羊肚菌水提浓缩物；

37、(5)步骤(4)制备的全部羊肚菌水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物5.01g，减去加入的0.9g纤维素酶，羊肚菌提取物质量为4.11g，，得率为41.1％。

38、对比例2：实施例2中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取55min后，再于85℃保温30min(未超声)，其他步骤完全相同，10g羊肚菌可制备得3.46g提取物，得率为34.4％。

39、比较实施例2与对比例2的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，羊肚菌的提取物得率由34.4％提高到41.1％，提高了18.8％。

40、实施例3：纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法3

41、一种纤维素酶协同超声波辅助制备羊肚菌提取物的方法，可以按如下步骤操作：

42、(1)市售新鲜羊肚菌清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎过60目筛，得羊肚菌粉；

43、(2)10g羊肚菌粉于500ml烧杯中，加入250ml的去离子水[即料液比为1:25(g:ml)]，加入纤维素酶0.8g(羊肚菌粉质量的8％)，搅拌均匀，构成羊肚菌酶解体系；

44、(3)羊肚菌酶解体系于水温为45℃中，酶解4h，转入沸水浴中提取50min，再于功率为200w、温度90℃超声波(频率为40khz)中提取25min，趁热过滤，收集滤液，得羊肚菌水提液；

45、(4)步骤(3)制备的全部羊肚菌水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至12.5ml(原去离子水体积的1/20)，获得羊肚菌水提浓缩物；

46、(5)步骤(4)制备的全部羊肚菌水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物4.87g，减去加入的0.8g纤维素酶，羊肚菌提取物质量为4.07g，得率为40.7％。

47、对比例3：实施例3中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取50min后，再于90℃保温25min(未超声)，其他步骤完全相同，10g羊肚菌可制备得3.44g提取物，得率为34.4％。

48、比较实施例3与对比例3的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，羊肚菌的提取物得率由34.4％提高到40.7％，提高了18.3％。

49、实施例4生物酶解法制备羊肚菌提取物中多糖含量分析

50、采用苯酚-硫酸法测定实施例1–3和对比例1–3制备的羊肚菌提取物的多糖含量，具体方法如下：

51、用去离子水将羊肚菌提取物配制成浓度为1mg/ml的水溶液，取1ml羊肚菌提取物水溶液于10-ml离心管中，再加入4ml的无水乙醇(体系的乙醇体积分数为80％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加10ml去离子水溶解，得羊肚菌提取物的多糖水溶液。

52、1ml羊肚菌提取物的多糖水溶液于10ml具塞管中，加1ml体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5ml浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1ml去离子水代替多糖水溶液的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(a490)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的a490，绘制葡萄糖浓度—a490标准曲线，得回归方程，由回归方程计算测定的羊肚菌提取物的多糖含量。

53、所述的羊肚菌提取物的多糖含量按公式2计算：

54、

55、由实施例1–3、对比例1–3制备羊肚菌提取物的多糖含量见表1。

56、表1不同实施例和对比例制备的羊肚菌提取物多糖含量

57、

58、由表1数据可以看出，实施例1–3制备的羊肚菌提取物的多糖含量均显著高于对比例1–3，说明采用纤维素酶协同超声波辅助制备的羊肚菌提取物多糖含量，较非酶解未超声法制备有显著提高。

59、实施例4生物酶解法制备羊肚菌提取物抗氧化活性

60、用dpph法测试了实施例1–3、对比例1–3制备羊肚菌提取物抗氧化活性。

61、羊肚菌提取物的抗氧化活性测定采用的dpph法，具体方法为：羊肚菌提取物用去离子水配制成1–5g/l的待测提取物水溶液，1ml不同浓度的待测提取物水溶液于试管中，加入3ml浓度为0.1mmol/l的dpph溶液(2,2-联苯基-1-苦基肼基，95％乙醇配制，现配现用)，摇匀，室温避光反应20min后，以95％乙醇做参比，于波长517nm处测定吸光值(as)；以1ml去离子代替待测提取物水溶液，按如上操作，测定空白组的517nm吸光值(ab)；1ml待测提取物水溶液于试管中，加入3ml的95％乙醇摇匀，按如上操作，测定对照组的517nm吸光值(ac)，按公式3计算dpph自由基清除率。

62、

63、按本实施例测定方法，由实施例1–3、对比例1–3制备羊肚菌提取物dpph自由基清除活性见表2。

64、表2不同实施例和对比例制备的羊肚菌提取物的dpph自由基清除率

65、

66、由表2结果可以看出，实施例1–3制备的羊肚菌提取物的抗氧化活性均显著高于对比例1–3，如在浓度为3g/l时，实施例1制备的羊肚菌提取物的抗氧化活性(73.6％)较对比例1(52.3％)提高了40.7％。以上结果说明羊肚菌经过酶解后，再用超声波热水提取，提取物的抗氧化活性也显著提高。