促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂及其制备方法

本发明涉及果蔬及其加工副产物精加工领域。更具体地说，本发明涉及一种促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂及其制备方法。

背景技术：

1、通过调节肠道菌群结构调控结肠发酵特性以实现精准干预健康的果蔬功能产品在当今社会倍受青睐。广义上讲，营养物质在大肠内的发酵可以分成碳水化合物发酵和蛋白质发酵。碳水化合物分解后的代谢产物主要是短链脂肪酸，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量较高，且具有生物活性，参与调节机体的生理过程。而大肠中微生物代谢蛋白质会导致有害代谢产物的形成，包括亚硝胺、支链脂肪酸、胺、酚、硫醇、二硫化氢和氨气等。大量研究已证实低聚糖、菊粉等益生元的健康效应，然而由于低分子量益生元的快速发酵特性，也可能产生一系列有害的代谢物。肠道发酵过程从盲肠开始到横结肠结束，快速发酵的益生元可能导致远端结肠微生物缺乏可发酵的碳水化合物，细菌进而选择性地降解蛋白质、肽或脂肪，产生有害代谢物。相反，果胶或其他较高分子质量多糖可以在盲肠、近端结肠、远端结肠均可被肠道菌群所降解利用，但是利用程度取决于果胶的精细结构。

2、果胶多糖是一种潜在的益生元，有利于增强肠道菌群的活性，参与改善机体免疫力、肥胖、高脂血症和结肠炎等生理活动。果胶的益生作用与其在肠道中的微生物发酵过程密切相关，公开号为cb106389378a、名称为一种果胶空心胶囊的发明专利中公开了一种果胶空心胶囊，包括质量份数的如下组分：果胶粉50~65份、聚丙烯酸树脂15~20份，乙基纤维素水分散体15~20份、……、纯化水80~100份，通过添加果胶粉，起到保护胃粘膜，帮助消化的保健功能。但是目前对果胶的利用仍停留于广泛而不精准的利用，果胶分子量太高，肠道微生物发酵速度慢，特别是在盲肠中的降解比例低，果胶的肠道益生功效发挥不充分。

3、为实现精准干预健康，需要筛选并优化功能食品中果胶的类型，精准调控其结构，实现碳水化合物发酵和蛋白质发酵的平衡，使果胶基功能食品在结肠前端和后端经肠道菌群发酵后，促进短链脂肪酸产生菌增殖，产生更多的有益代谢产物；抑制参与蛋白质发酵的菌群活性，减少有害代谢产物产生和积累，最终维持或提高肠道健康水平。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

2、本发明还有一个目的是提供一种果胶基膳食补充剂的制备方法，其能够筛选并优化功能食品中果胶的类型，精准调控其结构，实现碳水化合物发酵和蛋白质发酵的平衡，维持或提高肠道健康水平。

3、为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法，包括：

4、步骤一、以果蔬及其加工副产物为原料，通过顺序提取法依次截流得到水溶性果胶和半纤维素，透析、冻干得固体状的水溶性果胶和半纤维素；

5、步骤二、采用复合酶协同酶解步骤一所得水溶性果胶，得酶解物，将酶解物置于90~100℃的蒸汽下灭酶3~8min，再筛选得到水溶性rg-ii型果胶；

6、将步骤二所得水溶性rg-ii型果胶、半纤维素置于质量浓度为60~80%的阿拉伯糖和半乳糖混合溶液中复溶、冻干，得复配果胶基，备用，其中所述水溶性rg-ii型果胶、半纤维素以及混合溶液的质量比为25~40：6~10： 80~100，混合溶液中溶质阿拉伯糖和半乳糖的质量比为1~3：1；

7、步骤四、取重量份计的步骤三所得复配果胶基620~640份，与甘蔗纤维20~30份、柑橘纤维5~15份以及大豆纤维7~20份混合，倒模、整型，得到果胶基膳食补充剂初产品。

8、在上述技术方案中，所述果蔬及其加工副产品包括叶菜类蔬菜、块茎类蔬菜、瓜果类蔬菜、浆果类水果、瓜果类水果、橘果类水果、核果类水果、仁果类水果及其加工副产品。

9、在上述技术方案中，水溶性rg-ii型果胶和半纤维素形成一代复配体，将一代复配体在阿拉伯糖和半乳糖的混合液中复溶，冻干，形成二代复配体复配果胶基，将二代复配体与甘蔗纤维、柑橘纤维和大豆纤维混合，制得三代复配体果胶基膳食补充剂初产品。

10、在上述技术方案中，步骤三将步骤二所得水溶性rg-ii型果胶、半纤维素于质量浓度为60~80%的阿拉伯糖和半乳糖混合溶液中复溶的具体操作为：先将质量比为1~3：1的阿拉伯糖和半乳糖溶解于水中，形成质量浓度为60~80%的混合溶液，再将水溶性rg-ii型果胶、半纤维素溶于混合溶液中，其中水溶性rg-ii型果胶、半纤维素以及混合溶液的质量比为25~40：6~10： 80~100。

11、优选的是，所述的果胶基膳食补充剂的制备方法还包括步骤五：将步骤四所得果胶基膳食补充剂初产品的每一面喷淋0.05~0.1%氯化钙溶液，并放入真空冷冻干燥仓中干燥至物料质量含水率低于5%，分级、挑选、装盒，充氮包装，得果胶基膳食补充剂。

12、在上述技术方案中，果胶基膳食补充剂初产品喷淋氯化钙溶液后真空冷冻干燥的条件为冷阱温度低于-65℃，物料温度而为30~50℃。

13、优选的是，步骤一中以果蔬及其加工副产物为原料，通过顺序提取法依次截流得到水溶性果胶的方法为：将果蔬及其加工副产物打成果蔬浆，向果蔬浆中添加1~2 m naoh后，与95%乙醇匀浆1~2h，抽滤收集第一滤渣，将所得第一滤渣冷冻干燥后再置于沸水中搅拌20~60min，冷却后抽滤得第二滤液和第二滤渣，将第二滤液置于截留分子量为3500da的透析袋中并于水中透析36~72h，冻干，即得水溶性果胶，置于干燥器中备用。

14、在上述技术方案中，作为优选，第二滤液的处理方法还可以：混合第二滤液和冲洗液，进行旋转蒸发浓缩至400~600ml，将浓缩液置于截留分子量为3500da的透析袋中并于水中透析36~72h，冻干，即得水溶性果胶，置于干燥器中备用。

15、在上述技术方案中，所述第一滤渣冷冻干燥的条件为：真空度5~10pa；冷阱温度-65~-40℃；托盘温度为60~90℃；透析袋中内容物的冻干条件为：真空度5~10pa；冷阱温度-65~-40℃；托盘温度为60~90℃。

16、优选的是，步骤一中以果蔬及其加工副产物为原料，通过顺序提取法依次截流得到半纤维素的方法为：将所述第二滤渣溶解于含0.05~0.5 m cdta的0.1~0.5 m乙酸钾溶液中，抽滤得第三滤液和第三滤渣，将第三滤渣溶解于含0.02~0.1 m nabh4的0.1~0.5 mnaoh溶液中，收集不溶的残渣并加入含有4~6 m koh、0.02~0.1 m nabh4的硼酸盐溶液中，在n2环境下室温搅拌10~20h，过滤取第四滤液，通过hcl溶液调整第四滤液的ph值为2~5，加入1~5ml乙醇，沉淀物置于截留分子量为3500da的透析袋中并于水中透析36~72h，冻干，即得半纤维素，备用。

17、在上述技术方案中，第三滤液和第三滤渣的获得方法还可以是：将所述第二滤渣溶解于含0.05~0.5 m cdta的0.1~0.5 m乙酸钾溶液中，调节ph至6.5，在24℃下搅拌10~20min，然后在28℃恒温振荡培养箱中放置6~8h，分别收集上层清液作为第三滤液和下层残渣作为第三滤渣。

18、在上述技术方案中，所述提取果蔬加工副产物并截流得到半纤维素的方法的具体操作方式为：将第三滤渣残渣装入schott瓶中，加入上述混合溶液中，放入转子，向瓶内充入氮气，约30s后立即盖好瓶盖在室温下搅拌10~20h。溶液采用玻璃烧结过的过滤器过滤，滤芯孔径最大在16~40μm之间；用少量去离子水冲洗schott瓶和过滤器，合并滤液。所得滤液，用hcl调整滤液ph值为5（置于冰浴中，逐滴加入盐酸），加入30ml 37% hcl观察到ph快速下降后，缓慢滴加hcl至ph为5，调ph后可加入几滴75%乙醇减少泡沫。沉淀物置于截留分子量为3500da的透析袋中并于水中透析36~72h，冻干，即得半纤维素，备用。

19、优选的是，步骤二中所述复合酶协同酶解步骤一所得水溶性果胶的方法为：以水溶性果胶为对象，设置水溶性果胶终浓度为2~5 wt %，调节体系ph为4~4.6，添加聚半乳糖醛酸内切酶、聚半乳糖醛酸外切酶并置于35~55 ℃条件下酶解1~4h；随后调节体系ph为5.5~6.5，继续添加果胶裂解酶和果胶甲酯酶并置于50~70℃条件下酶解1~4 h，得到包含水溶性rg-i型果胶和水溶性rg-ii型果胶的酶解物，其中，聚半乳糖醛酸内切酶、聚半乳糖醛酸外切酶、聚半乳糖醛酸外切酶果胶裂解酶和果胶甲酯酶的在水溶性果胶中终浓度均为0.2~1u/ml。

20、优选的是，步骤二中筛选得到水溶性rg-ii型果胶的方法为：通过deae-纤维素柱层析，先用蒸馏水洗脱灭酶后的酶解物2~5 h得到中性糖级分，继续用0.5~2.0 m nacl溶液进行洗脱，得到的酸性糖级分，所得酸性糖级分通过0.5~2.0 m nacl溶液在高分辨分子排阻色谱中洗脱，收集洗脱时间在10~15min范围内的酸性糖级分，利用硫代巴比妥酸法，筛选分离得到水溶性rg-ii型果胶。

21、优选的是，步骤二中所述灭酶处理是将酶解物采用ptfe过滤透气封口膜包裹，置于90~100℃蒸汽下，灭酶3~8min。

22、优选的是，步骤四中倒模前需在模具中涂有植物油。

23、在上述技术方案中，所述植物油优选为牡丹籽油、橄榄油和菜籽油，最优选的植物油为牡丹籽油。

24、本发明进一步要求保护一种果胶基膳食补充剂，所述果胶基膳食补充剂采用所述果胶基膳食补充剂的制备方法制备而成。

25、本发明至少包括以下有益效果：

26、1、本发明提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法能够筛选并优化功能食品中果胶的类型，精准调控其结构，实现碳水化合物发酵和蛋白质发酵的平衡，使果胶基功能食品在结肠前端和后端经肠道菌群发酵后，促进短链脂肪酸产生菌增殖，产生更多的有益代谢产物；抑制参与蛋白质发酵的菌群活性，减少有害代谢产物产生和积累，维持或提高肠道健康水平；

27、2、本发明提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法填充了水溶性rg-ii型果胶筛选的技术空白，精准复配水溶性rg-ii型果胶和一定比例的不可溶性膳食纤维，从而通过改变果胶结构，影响其被大肠微生物发酵的速度，精准调控微生物代谢产物；

28、3、本发明提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法对果蔬及其加工副产物的提取液中加入碱液，一方面破坏细胞壁的结构，使果胶更易提出，同时破坏果胶、半纤维素和纤维素之间的交联，溶出更多结构多样的果胶，再通过定向二级酶解从水溶性果胶继续分离制备具有较小的分子量、较高比例的rg-ii结构域，该方法的提取率较高，且果胶结构利于肠道微生物的利用；

29、4、本发明提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法中通过将果胶和不可溶性膳食纤维复合物在中性糖溶液中复溶、再冻干的方法添加了中性糖，在不溶性rg-ii型果胶和不可溶性膳食纤维复合物中添加特定中性糖，有利于显著增加发酵阶段的肠道微生物多样性，同时提高有益代谢产物产生量；

30、5、本发明所提供的果胶基膳食补充剂的制备方法所得果胶基膳食补充剂果胶基的得率为29.15g/100 g d.b.，分子量223.47kg/mol，半乳糖醛酸、鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，木糖和岩藻糖的含量分别为533.88、20.52、48.40、49.06，19.14、6.35和1.17mg/g，黏度适中，可有效到达远端结肠，产生大量的有益代谢产物短链脂肪酸（36.75mmol/l）和少量的有害代谢产物游离氨（3.28mmol/l）；

31、6、本发明所提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法所得果胶基膳食补充剂在24h内肠道中的降解率超出80%，且总短链脂肪酸产生率高于200%，同时控制4、8、12和24h发酵期间内乙酸和丙酸生成速率稳定在75-80%，从而有效抑制蛋白质发酵，使之在结肠末端的发生时间更晚，发酵速度更慢；

32、7、本发明所提供的促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂的制备方法所得果胶基膳食补充剂因富含阿拉伯糖和半乳糖，是厚壁菌门的良好碳源。产品经多糖降解菌发酵后，可显著增加肠道内细菌的多样性，提高菌群丰富性、均匀度和覆盖度，使短链脂肪酸产生菌（毛螺菌、拟杆菌、放线菌、念珠菌、双歧杆菌、巨单胞菌、普拉梭菌、瘤胃球菌）明显被富集，同时与蛋白质发酵相关的菌群（硬核丙酸杆菌、普雷沃菌属）丰度降低。短链脂肪酸在维护肠道平衡及宿主健康方面起着至关重要的作用。其中，毛螺菌、拟杆菌属、瘤胃球菌、双歧杆菌、放线菌可将葡萄糖转化为乙酸，其可抑制食欲、调节脂肪吸收；毛螺菌、瘤胃球菌既可以生产丙酸又可以生产丁酸，其中丁酸是肠道细胞的重要能量来源，能调节上皮细胞和淋巴细胞的生长及凋亡，并促进其生长和分化，从而有助于预防溃疡性结肠炎和结肠癌；巨单胞菌同时产生戊酸和己酸，拟杆菌、普拉梭和念珠菌等可利用戊糖或己糖合成丙酸，其可参与脂质代谢，抑制胆固醇的合成；

33、8、本发明首次提出以短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）生成速率表示碳水化合物发酵速度，以胺、吲哚及硫化氢的生成速率表示蛋白质发酵速度，实现了对碳水化合物发酵速度和蛋白质发酵速度的相对表征，为肠道健康的精准研究垫底了基础。

34、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。