制备单核细胞趋化因子多肽的方法及其制备用株的制作方法

专利名称：制备单核细胞趋化因子多肽的方法及其制备用株的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备单核细胞趋化因子多肽的方法，该多肽有望作为治疗细菌感染性疾病、改善免疫功能和治疗恶性肿瘤及类似疾病的药物。
单核细胞趋化因子具有吸附活性和激活单核/巨噬细胞活性，后者在活体的防御机制中对炎症反应及免疫反应方面具有重要作用。该因子高度有望在临床应用上作为治疗细菌感染性疾病、改善免疫机能和治疗恶性肿瘤和类似疾病的药物。
已有报导，单核细胞趋化因子可由以植物血凝素(PHA)刺激的人外周血白细胞或类似细胞的培养上清液来制备。〔Yoshimura，T.et al，J.Immunol.，142，1956-1962，1989;Robinson，E.A.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，1850-1854，1989;Mat-sushima，K.et al，J.Exp.Med.，169，1485-1490，1989;De-cock，B.et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，167，904-909，1990〕也可用动物细胞或大肠杆菌作宿主，用编码单核细胞趋化因子的DNA的重组DNA技术来制备。〔Matsushima，K.et al.Cytokine，1，2-13.1989〕.国际出版物号Wo 90/07863公开了用重组DNA技术表达作为非融合多肽的单核细胞趋化因子的方法，也即用直接表达系统来表达所述多肽的方法。也公开了所述多肽具有可测定的单核细胞趋化活性。
然而在用这些方法制备单核细胞趋化因子上的问题在于，它的大规模制备是如此困难，以致于不能稳定地得到足够量的单核细胞趋化因子来完成研究和将它发展成为药品。这个事实已成为单核细胞趋化因子研究发展上的巨大障碍。
本研究用大肠杆菌作为宿主的直接表达系统来大规模制备单核细胞趋化因子，结果，本发明人发现，利用为高效制备而改进的表达质粒和大肠杆菌选择性宿主株，在转化细胞内单核细胞趋化因子可以不溶形式大规模制备。据此，本发明的方法在于用(1)一株大肠杆菌选择性宿主株;(2)以高效制备单核细胞趋化因子的表达性质粒;(3)高产量;(4)作为非融合性多肽;(5)在细胞内以不溶形式存在。这一方法作为经济、有效的大规模制备法，使低耗费、大规模制备所述多肽成为可能。
本发明的目的是提供制备具有单核细胞趋化活性的单核细胞趋化因子多肽的方法。该多肽由以SEQ ID No1为代表的氨基酸序列，或以可用的重组体DNA技术截去1-6N-末端氨基酸的氨基酸序列组成。该重组技术是利用选择性大肠杆菌或其突变株作为宿主，该株是用高效制备用的表达性质粒来转化的。
本发明的另一个目的是提供一株大肠杆菌选择株或其突变株，该株是用高效制备用的表达性质粒来转化的。
本发明涉及制备具有单核细胞趋化活性的多肽及其转化突变型的有效方法。包括用一个具有翻译终止密码和结构基因下游终止序列的表达性质粒;翻译起始密码;核糖体结合位点序列(下文称作“SD序列”);来自大肠杆菌的连接结构基因上游的启动子序列。用以作为宿主的大肠杆菌是大肠杆菌LE392株，BL21(DE3)株，AB1899株，B/r-WP2-hcr-株和C600hflA株，或其突变株。在作为具有单核细胞趋化活性的非融合性多肽的多肽的制备中，采用表达性质粒，该质粒中有编码具有单核细胞趋化活性的多肽的插入性DNA，该多肽由以SEQ ID No1为代表的氨基酸序列或截去1-6N-末端氨基酸的氨基酸序列组成。(此多肽在后文称为“单核细胞趋化因子”或“单核细胞趋化因子多肽”)。采用导入所述表达性质粒的办法将宿主大肠杆菌转化，然后，培养已转化的大肠杆菌。
本发明详述如下。
用于制备单核细胞趋化因子的表达性质粒可按重组体DNA技术和表达的基础理论来构建。(如Maniatis，T.et al，Molecular Cloning，a laboratory manual;Publn.Cold spring Harbor Labora-tory，1982).这样，它可用连接SD序列，翻译起始密码子和编码带有合适的启动子序列(例如trp，lac，PL等)的下游翻译终止密码的单核细胞趋化因子的DNA，连接它的下游终止序列，选择地连接由大肠杆菌中分离得的合适的抑制基因，和将它插入合适的载体(例如pBR322等)。该载体在宿主株中可复制。
编码单核细胞趋化因子的DNA是众所周知的，可以按Furu-tani，Y.et al，Biochem，Biophys.Res.Commun.，159，249-255，1989的方法，或化学合成方法来制备。编码在N末端切去1-6氨基酸的单核细胞趋化因子的DNA可按侧特异突变方法缺失相应DNA来构建。(如Kunkel.T.A.et al，Methods in Enzymol.，154，367-382，1987)。
在构建表达性质粒中作为末端序列，以SEQ ID No2为代表的碱基序列和包括上述序列的碱基序列是可用的，以前面的序列为佳。
以SEQ ID No3为代表的序列被推荐作为从SD序列到翻译起始密码(包括该翻起始密码)的序列。
由大肠杆菌分离得的色氨酸启动子操纵子被选作为启动子序列。作为抑制基因，色氨酸启动子操纵子抑制基因(后文称为“trp R基因”)最好来自大肠杆菌，如以SEQ ID No4为代表的碱基序列。
至于表达性质粒，有较好的具翻译终止密码和上述较好的编码单核细胞趋化因子的DNA下游末端序列的质粒，及上述从SD序列至翻译起始密码的较好序列，和连接其上游的较好的启动子序列。特别较好的是，具有翻译终止密码和以SEQ ID No2为代表的，连接编码单核细胞趋化因子的DNA下游的末端序列，以及以SEQ ID No3为代表(从SD序列到翻译起始密码)和由大肠杆菌分离的，连接其上游的色氨酸启动子操纵子表达性质粒为好。
当采用诸如大肠杆菌LE392株或其突变株等缺乏trpR基因的大肠杆菌株时，带有以SEQ ID No4为代表的trpR基因的表达性质粒的插入特别好。按照氯化钙法将构建好的表达性质粒导入大肠杆菌选择株〔Cohen，S.N.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110-2114，1972〕，该被转化的大肠杆菌按常规途径培养，以在培养的细胞中制备与累积单核细胞趋化因子。
作为例证，可用的选择出的大肠杆菌株包括如下的6株大肠杆菌和其变异株(1)大肠杆菌LE 392(ATCC 33572)(2)大肠杆菌P 2392〔Raleigh，E.A.et al.Current Protocols in Molecular Biolo-gy，Edited by Ausubel，F.M.，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York，Unit 1.4，1989〕(3)大肠杆菌BL 21(DE3)〔Studier，F.W et al，J.Mol.Biol.，189，113-130，1986〕(4)大肠杆菌AB 1899(ME 8082)(5)大肠杆菌B/r-WP2-hcr-(ATCC 23233)(6)大肠杆菌C600hflA〔Young，R.A.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，80，1194-1198，1983〕在上述的大肠杆菌株中，大肠杆菌株LE392，B/r WP2-hcr--和AB1899株较好，LE392株最好。
然后将培养的细胞分解，从细胞的溶胞产物中得到的颗粒部分先以低浓度的表面活性剂和蛋白变性剂的混合物处理，继以脱氧核糖核酸酶处理。然后，收集含单核细胞趋化因子的颗粒部分，将该颗粒部分以高浓度的蛋白变性剂溶解，又经透析或类似方法来除去蛋白变性剂以恢复单核细胞趋化因子成为可溶性多肽。
特别是培养转化的大肠杆菌，将含有单核细胞趋化因子的培养细胞分解，由细胞的溶胞产物中得到颗粒部分。将此颗粒部分用低浓度的表面活性剂和蛋白变性剂的混合物(例如含有1%Triton X-100的0.75M尿素)洗涤，并用脱氧核糖核酸酶消化，由此收集含有单核细胞趋化因子的颗粒部分。将颗粒部分以高浓度的蛋白变性剂(例如6M氯化胍)处理，以溶解单核细胞趋化因子。然后通过透析去除蛋白变性剂，或通过稀释，降低蛋白变性剂的浓度，收集可溶性多肽形式的单核细胞趋化因子。
高纯度的制剂可借助于肝素柱、离子交换柱和凝胶过滤色谱来取。更进一步，其他的方法，诸如超滤，电泳，用特异抗体的亲和层析，用反相柱的高效液相色谱法，用于纯化均是有效的。纯化的基本技术可参照Furuta等报导的方法来实施(Furuta，R.et al.，J.Biochem.，106，436-441，1989)。
按照本发明的方法，单核细胞趋化因子多肽在细胞中以高含量被集聚，以不溶性多肽形式被获得。特别是在用大肠杆菌LE392株作为宿主细胞时，以SEQ ID No1为代表的76个氨基酸组成的单核细胞趋化因子多肽〔下文称作“MCF(76)”〕的产量为每100毫升培养肉汤中约达3mg。用大肠杆菌P2392株和大肠杆菌BL21(DE3)株的转化突变型得到的MCF(76)的产量为约2-3mg/100ml(培养肉汤)。以大肠杆菌AB1899株和大肠杆菌B/r-WP2-her-株的转化突变型得到的MCF(76)的产量为约1-2mg/100ml(培养肉汤)。以大肠杆菌C600hflA株转化突变型得到的MCF(76)的产量约为0.5-1mg/100ml(培养肉汤)。在培养细胞中集聚的单核细胞趋化因子可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和用考马斯亮兰-R-250(下文称作“CBB”)蛋白染色法来检测。集聚的量可用在CBB染色的蛋白带上光密度测定来确定。另一方面，在用本发明方法中所采用的大肠杆菌以外的其他大肠杆菌作为宿主时，在培养细胞中的MCF(76)很快降解，所以用电泳-CBB染色法在细胞中不能测得MCF(76)的产物。这样，在以下述26株大肠杆菌作为宿主进行培养的结果，未确认MCF(76)的集聚。
(1) W3110 (ATCC27325)(2) Q13 (ATCC29079)(3) x1776 (ATCC31244)(4) RR1 (ATCC31343)(5) C600r-m-(ATCC33525)(6) HB101 (ATCC33694)(7) MC4100 (ATCC35695)(8) JM105 (ATCC47016)(9) JM109 (ATCC53323)(10) KL-16-19 (ME6252)(11) KL-16 (ME8002)(12) YN2092 (ME8058)(13) CSH29 (ME8117)(14) CSH22 (ME8131)(15) LS6745 (ME8398)(16) KD2157 (JE8448)(17) JRG902 (JE6642)(18) LC158 (ME8476)
(19)N4830(Gottesman，M.E.et al.，J.Mol.Biol.，140，57-75，1980)(20)MC4100htpR(Yura，T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6803-6807，1984)(21)JC1552-03(Yamagishi，J.et al.，Mol.Gen.Genet.，204，367-373，1986)(22)QD5003(Yamagishi，J.et al.，J.Bacteriol.，148，450-458，1981)(23)CJ236(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual，3，A.9，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Publisher)，1989)(24)DH5(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual，3，A.10，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Publisher)，1989)(25)MV1184(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual，3，A.11，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Publisher)，1989)(26)XL1-Blue(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual，3，A.12，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Publisher)，1989)与大肠杆菌株名字一起列出的ATCC号是美国典型培养物保藏中心的编码号(12301 Park-lawn Drive，Rockville，MD 20852，U.S.A)，ME号或JE号是国立遗传学研究所，遗传保藏研究中心的编码号(Tanida 1111，Mishima-shi，Shizuoka Prefecture，411 Japan)。
在本发明方法中所用的大肠杆菌突变株解释如下大肠杆菌突变株的特例是抗生素抗性株，诸如链霉素抗性株(下文称作“Str”)，利福霉素抗性株(下文称作“Rifr”)，胸腺嘧啶依赖突变株(下文称作“Thy-”)，recA基因突变的突变株(下文称作“RecA-”)，和同时兼有二种或更多种特点的突变株。在本发明方法中可用的大肠杆菌突变株也包括用N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍法引起亲代株染色体基因产生突变的株。〔Miller，J.H.，Experiments in Molecular Genetics，125-129，Cold Spring Harbor Laboratory(Publisher)，1972〕.例如可用于本发明的方法中的突变株可按如下步骤得到首先突变株是通过在N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍存在下培育亲代株来获取。次之，上述突变株可用产生单核细胞趋化因子的表达性质粒来转化，然后培育经转化的菌株。最后在本发明方法中可用的突变株是通过选择突变株的办法来取得的。这些株中单核细胞趋化因子是用培养法来收集的。更进一步，含有噬菌体的溶原菌株也包括可用于本发明方法的大肠杆菌突变株中。例如，大肠杆菌LE392株的突变株包括大肠杆菌P2392株，大肠杆菌LE392的P2噬菌体的溶原菌株。将新性质转导给那些突变株的突变株也包括在本发明方法可用的大肠杆菌突变株，直至单核细胞趋化因子能以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和CBB蛋白染色法在经表达性质粒转化过的菌株培养细胞中被测出。这些突变株可以这些技术领域中的常规方式来制备〔Miller，J.H，Experiments in Moleculor Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory(Publisher)，1972〕。在本发明中所用的最佳突变株是大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)，亦即该大肠杆菌的突变株是利福霉素抗性和recA基因突变性株。
在本发明的方法中可使用的大肠杆菌Rifr，Strr、Thy-和RecA株的制备解释如下在本发明的方法中可用的大肠杆菌在37℃于LB培养基中过夜，然而离心。所收集到的细胞悬浮于生理盐水中，然后将该悬液涂布于含有利福霉素的LB琼脂平板的表面，37℃培育过夜。将在LB琼脂平板上形成的菌落悬浮于生理盐水中，划种于含有利福霉素的LB琼脂平板上，在37℃培育过夜。由此，以单个菌落形式将大肠杆菌(Rifr)株分离出来。进一步，大肠杆菌(Strr)株是用含链霉素的LB琼脂平板代替含利福霉素的LB琼脂平板分离出来的。
大肠杆菌(Rifr)株的培养物以5%浓度接种到含有胸腺嘧啶、三甲氧苄二氨嘧啶和L-甲硫氨酸的M9培养基中，在37℃下震摇过夜。将此培养物再以5%浓度接种到含有同样成份的新鲜培养基中，在37℃下震摇培育过夜。将此培养物涂布含有胸腺嘧啶的LB琼脂平板，在37℃培育过夜。收集所形成的菌落，测试它们对胸腺嘧啶的需求。将显示有胸腺嘧啶需求的菌落悬浮于生理盐水中，划种含有胸腺嘧啶的LB琼脂平板，在37℃培育过夜。由此，以单菌落形式分离出大肠杆菌(Rifr、Thy-)株。进而，用大肠杆菌(Strr)株代替大肠杆菌(Rifr)株，分离出单菌落形式的大肠杆菌(Strr、Thy-)株。
将大肠杆菌KL-16-19株在LB培养基中，在37℃下培育过夜。将此培养物以10%浓度接种在LB培养基中，于37℃培育过夜。另一方面，将大肠杆菌(Rifr、Thy)株在补充有胸腺嘧啶的LB培养基中培育。大肠杆菌KL-16-19株的培养物与大肠杆菌(Rifr、Thy-)株培养物混合，在37℃培育，以使雄性株、大肠杆菌KL-16-19株，与雌性株、大肠杆菌(Rifr、Thy-)株交联。然后，通过收集在不含胸腺嘧啶的M9琼脂平板上生长的菌落，来获得重组菌株，该重组菌株中大肠杆菌(Rifr、Thy-)株对胸腺嘧啶的需求又回复到对胸腺嘧啶的非需求性。将所获得的菌落划种于LB琼脂平板上，在37℃培育过夜以分离单个菌落。最后通过测试被分离菌落对紫外线(U、V)的敏感性和选择那些对U、V高度敏感的菌株，来分离大肠杆菌(Rifr、Thy-)株，因为由大肠杆菌KL-16-19株得到的recA突变基因是插入了染色体。另外按上述方法，通过以处理大肠杆菌(Strr、Thy-)株代替处理大肠杆菌(Rifr、Thy-)株的方法，也可分离得大肠杆菌(Strr、Thy-)株、单菌落。
单核细胞趋化因子多肽MCF(76)的生产率和分别由MCF(76)截去1个、3个或6个氨基酸的多肽的生产率，用突变株，例如大肠杆菌(Rifr、RecA-)株等于或高于用大肠杆菌LE392株。
按照本发明的方法，单核细胞趋化因子，也称MCF(76)，和分别由MCF(76)截去1个、3个或6个氨基酸的多肽可被有效地制备。
下述缩写用来简化本发明申请专利说明书的描述。
ATP 三磷酸腺苷，dATP 三磷酸脱氧腺苷，dCTP 三磷酸脱氧胞苷，dGTP 三磷酸脱氧鸟苷，dTTP 三磷酸脱氧胸苷，SD sequence Shine-Dalgano序列(核糖体结合位点序列)SDS十二烷基磺酸钠IL-1α白细胞间介素1αStrr链霉素抗性Rifr利福霉素抗性Thy-胸腺嘧啶需求(依赖)RecA-recA基因突变DMSO二甲基亚砜trpRgene色氨酸启动子操纵子阻遏基因。
下述实施例说明了本发明的具体实施方案，但应注意到，本发明并不局限于这些实施例。在下面实施例中制备的多肽是单核细胞趋化因子的事实，可以由它们具有很强的单核细胞趋化活性的事实，由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析测定分子量，用蛋白序列分析仪(470A型，Applied Biosystem，U.S.A)按Edman′s法确定N-末端区的氨基酸序列得到证实。按照Matsushima K等方法(J.Exp.Med，169，1485-1490，1989)单核细胞趋化活性可被测得。
实施例1用于制备单核细胞趋化因子的表达性质粒的构建(1)用于制备以SEQ ID No1为代表的由76个氨基酸组成的单核细胞趋化因子的表达性质粒pHM483按下述方法构建。
表达性质粒pHMC076(参看如下参照例)以限制性酶SpeI和SalI消化，以分离含有以SEQ ID No5为代表的碱基序列的约有0.6千碱基对(kbp)的DNA片段。这个DNA片段称为“MCF(SS)”片段。通过将MCF(SS)片段插入在M13mp19噬菌体载体(Takara shuzo Co.)多克隆位点中限制性酶SalI和XbaI的切开点之间可制备重组噬菌体DNA。按照下述基于位点特异性突变方法的方法，使用此重组噬菌体DNA和以SEQ ID No6为代表的碱基序列的突变引物可将一个碱基(G)插在以SEQ ID No5为代表的MCF(SS)片段的碱基序列的278号和279号碱基(或279号和280号碱基)之间的位置上。(Kunkel，T.A.et al.，Methods in Enzymol.，154，367-382，1987)。这种位点特异性突变可用突变基因体外突变药盒来完成(Bio Rad Labs，U.S.A)。这样，所述的重组噬菌体DNA被转移到大肠杆菌JM105上，该菌株被培养以释放噬菌体。然后，这种噬菌体被转移到大肠杆菌CJ236上，该菌株在37℃，于含有尿苷(1μg/ml)和氯霉素(20μg/ml)的2×TY培养基(1.6%胰蛋白胨，1%酵母浸液，0.5%氯化钠)上培养5小时。引入尿嘧啶的单链的噬菌体DNA可由该上清液中分离得。以T4多核苷酸激酶在5′末端上加上磷酸基团的磷酸化致突变引物在退火作用缓冲液中〔含有2mM氯化镁和50mM氯化钠的20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)〕与如上制备的含有尿嘧啶的单链的噬菌体DNA于70℃杂交10分钟，该混合物以每分钟1℃速率渐渐冷至30℃，以使引物杂交到噬菌体DNA上。然后，噬菌体DNA在合成缓冲液中〔含有4种三磷酸脱氧核苷酸(dGTP，dCTP，dATP和dTTP)，每种0.4mM，0.75mM三磷酸腺苷，3.75mM氯化镁和1.5mM二硫苏糖醇〕与T4多聚酶在反应条件下于冰中反应5分钟，于25℃反应5分钟，37℃反应90分钟，以合成对模板噬菌体DNA的互补DNA。互补DNA的末端被T4DNA连接酶连接，然后在-20℃冰冻停止反应，以制备双链闭环状DNA。所得的DNA被转移到大肠杆菌JM105株，培育该株以分离双链的DNA复制形，在该DNA中已引入突变(下称“突变双链DNA”)。用限制性酶DraⅠ和SalⅠ消化该突变双链DNA，以分离有以SEQ ID No7为代表的碱基序列的DNA片段。这个DNA片段称为“MCF(DS)”。在这个MCF(DS)片段的碱基序列中，带有限制性酶BamHI，在SEQ ID No7的248-253号碱基上的识别序列(GGATCC)是用上述方法，通过插入一个碱基(G)来构建的。
另外，表达性质粒pHMC076可用限制性酶DraI和SalI消化，以切成2个片段。据此即有一个被分离的较大DNA片段(下文称作“HMC076载体片段”)，其包括有从大肠杆菌分离的色氨酸启动子序列(下文称“trp promotor”)，一个氨苄青霉素抗性基因，一个复制区，但不包含有单核细胞趋化因子MCF(76)的结构基因。HMC076载体片段以T4DNA连接酶连接到MCF(DS)片段上以构建一个表达性质粒pHMCO76-B。
将表达性质粒pHMC076-B用限制性酶XhoI和BamHI消化以去除位于XhoI和BamHI切点间的5个碱基(TCGAG，与以SEQ ID No7为代表的碱基序列的244-248号碱基对应的片段)。靠退火二条以SEQ ID No8和9为代表的化学合成的DNA而制备的双链DNA被整合入这个位点，以构建一个表达性载体pHM483。除去了以SEQ ID No9碱基序列为代表的化学合成的DNA的5′末端位的4个碱基后的42个碱基是以SEQ ID No8的碱基序列为代表的化学合成的DNA的互补链。二个DNA片段被退火，以得到如下在两端有限制性酶XhoI和限制性酶BamHI粘合端的，以SEQ ID No10为代表的双链DNA。
5’-TCGAGTAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTCGCTTGAATTCG3’-CATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAAGCGAACTTAAGCCTAG这个DNA序列包括了以SEQ ID No2为代表的碱基序列，它被建立以起终止子作用，也即终止转录的信号。该碱基序列可以按照双脱氧方法，用7-DEAZA序列分析药盒(Takara Shuzo Co.)来确定。
实施例2制备单核细胞趋化因子的表达性质粒的构建(2)用以制备由MCF(76)截去N末端1-6个氨基酸得的单核细胞趋化因子的表达性质粒可按下法构建。由MCF(76)截去N末端1个，3个和6个氨基酸的多肽分别被称为MCF(75)，MCF(73)和MCF(70)。在这种情况下，用以制备这三种截去N末端氨基酸的多肽的表达性质粒分别被称为“pHM484，pHM485，pHM486”。
(1)表达性质粒pHM484的构建用以制备单核细胞趋化因子MCF(75)的表达性质粒pHM484可按如下方法构建。将由实施例1的方法所得的表达性质粒pHM483用限制性酶SpeI和SalI消化，以分离含有编码MCF(76)的区域的DNA片段。将此DNA片段插入M13mp19噬菌体载体的多克隆位点中限制性酶SalI与XbaI的切点之间，以构建重组噬菌体DNA(MCF76)。利用这种重组噬菌体DNA(MCF76)，采用实施例1中所描述的点特异性突变法，删去其与MCF(76)的N末端氨基酸(Gln)相应的密码(CAG)。作为突变引物，使用有以SEQ ID No11为代表的碱基序列的合成DNA。将合成的突变的双链DNA用限制性酶DraI和XhoI消化，以分离已删去MCF(76)N-末端氨基酸(Gln)相应密码的突变的DNA片段。
将按实施例1中所描述的方法构建的表达性质粒pHM483用限制性酶DraI和XhoI消化，以切成2个片段来分离较大的DNA片段(下文称作“HM483载体片段”)，该片段包含有trp启动子，终止子序列，氨苄青霉素抗性基因和复制区域，但不包括单核细胞趋化因子MCF(76)的结构基因。将此HM483载体片段用T4DNA连接酶连接到所述的突变了的DNA片段上，以构建表达性质粒pHM484。表达性质粒pHM484的碱基序列与由表达性质粒pHM483的碱基序列切去了与MCF(76)的N末端氨基酸(Gln)相应的密码子后的序列相对应。该碱基序列可用7-DEAZA药盒，按双脱氧方法来测定。
(2)其他表达性质粒的构建用于制备多肽的表达性质粒pHM485和pHM486，也就是由MCF(76)切去N末端3个和6个氨基酸后构成的MCF(73)和MCF(70)，可由重组噬菌体DNA(MCF76)和各自相应的突变引物，按照上述(1)所述方法来构建。作为突变引物，可使用与编码被切断的多肽的碱基序列相应的特殊的化学合成的DNA。
表达性质粒pHM485可构建如下按位点特异性突变法，用重组噬菌体DNA(MCF76)和以SEQ ID No12为代表的突变引物，获得切去编码MCF(76)的N末端3个氨基酸(Gln Pro Asp)的碱基序列(CAGCCAGAT)的突变的双链DNA。然后将用限制性酶DraI和XhoI消化突变的双链DNA所得到的突变的DNA片段连接到所述的HM483载体片段上。
表达性质粒pHM486构建如下按位点特异性突变法，用重组噬菌体DNA(MCF76)和以SEQ ID No13为代表的突变引物，获得切去编码MCF(76)的N-末端6个氨基酸(Gln Pro Asp Ala lle Asn)的碱基序列(CAGCCAGATGCAATCAAT)的突变的双链DNA。然后将用限制性酶DraI和XhoI消化突变的双链DNA所得到的突变的DNA片段连接到HM483载体片段上。
实施例3制备单核细胞趋化因子的表达性质粒的构建(3)用以制备单核细胞趋化因子的，其中已插入trpR基因的表达性质粒pHM583可以下述方法构建。可按由Cosloy方法(Cosloy et al.，Mol.Gen.Genet.，124，1-10，1973)改进的下述方法由大肠杆菌HB101提取染色体DNA。将培养的细胞悬浮于含有0.1M乙二胺四乙酸二钠溶液的0.1M氯化钠溶液中，然后与含有链霉蛋白酶K(50μg/ml)和0.5% SDS的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混合，在42℃加热1小时，以溶解细胞和消化细菌蛋白质。然后将苯酚加入反应混合液中以去除蛋白质;加入核糖核酸酶A(50μg/ml)以恢复水相，在37℃加热30分钟以降解RNA。最后加入酒精于反应混合液中以回收大肠杆菌染色体DNA。
用限制性酶NlaⅣ消化所得的染色体DNA，按低融化温度琼脂糖凝胶电泳方法分离1千碱基对片段。将这种DNA片段插在M13mp18噬菌体载体的多克隆位点上限制性酶SmaI切点间以制备重组噬菌体DNA库。
将含有以SEQ ID No15为代表的trpR基因的DNA片段与具有从这种库里所得的以SEQ ID No14为代表的碱基序列(与SEQ ID No15的363到376碱基序列相对应)的探针，按由空斑杂交法改良而得的下述方法来进行克隆〔Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Vol.1，2.108，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Publisher)，1989〕。
按照空斑杂交法，首先将所述的重组噬菌体DNA库感染大肠杆菌JM105，以形成空斑。然后，将大约500个单个空斑逐个感染大肠杆菌JM105，受染菌株被培养以重新获得作为结果的噬菌体。制备成的噬菌体点斑于硝酸纤维素滤膜上，此膜浸入含有0.1N氢氧化钠的1.5M氯化钠溶液中，于室温下固定5分钟，并浸入含有3M氯化钠的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中于室温下中和10分钟。将此滤膜在80℃烤2小时以固定其上的噬菌体DNA。
以〔r-32p〕ATP标记以SEQ ID No14为代表的探针是用MEGALABEL药盒用5′末端DNA标记法来制备的(Takara Shuzo Co)。
其上有所述重组噬菌体DNA的滤膜在5倍浓度的含有32p标记的探针(约1，000，000cpm/ml)，变性鲑鱼精DNA(100μg/ml)，0.1% SDS，1mM乙二胺四乙酸二钠，0.02%牛血清白蛋白，0.02%聚乙烯吡咯烷酮和0.02%Ficoll的SSC(含有0.015M枸椽酸钠和0.15M氯化钠的溶液称为“SSC”)中于约40℃下培育48小时。然后将滤膜在5倍浓度的含0.1%SDS的SSC中在650℃加热1小时，并以2倍浓度的SSC洗3次。该滤膜被干燥与进行放射自显影以检测结合有32p标记探针的噬菌体。与这种噬菌体DNA相应的重组噬菌体称为“候选噬菌体(candidate)”。此种候选噬菌体按约每100个噬菌体中可得约1个的频率从重组噬菌体DNA库中得到。然后，可用常规方法从候选噬菌体中分离单链噬菌体DNA。这种单链噬菌体DNA的碱基序列可用双脱氧法用7-DEAZA系列分析药盒来确定。它能确定所选择的重组噬菌体含有以SEQ ID No15为代表的trpR基因。这种重组噬菌体，下文称为“M13mp18-trpR”。
利用M13mp18-trpR，按照实施例1所描述的位点特异性突变方法限制性酶EcoRI的切开识别序列(GAATTC)被插在SEQ ID No15的116号碱基和117号碱基之间。限制性酶BamHI的切开识别序列(GGATCC)被插在SEQ ID No15的956号碱基和957号碱基之间。
含有SEQ ID No16和SEQ ID No17的碱基序列的化学合成DNA被用作突变引物。
用限制性酶EcoRI和BamHI消化合成的突变的双链DNA以分离在SEQ ID No15的117号至956号碱基序列的5′末端上有EcoRI粘合端的序列和在3′末端有BamHI粘合端的序列的trpR基因片段。这个trp R基因片段称为“TRP(EB)片段”。
将按实施例1所描述的方法构建的表达性质粒pHM483用限制性酶EcoRI和BamHI消化，以切为2个片段。由此，较大的一个DNA片段，(含有trp启动子，终止子序列，氨苄青霉素抗性基因、单核细胞趋化因子结构基因和复制区域)被分离。这个DNA片段被称为HM483(EB)载体片段。所述的TRP(EB)片段用T4DNA连接酶连接到这个载体片段上，以构建表达性质粒pHM583。表达性质粒pHM583的碱基序列与以下序列相对应，该序列在表达性质粒pHM483的EcoRI和BamHI切开位点间缺少6个碱基(AATTCG，该片段与SEQ ID No8的碱基序列的41号至46号碱基相对应)，且在上述缺失位点中插入了以SEQ ID No4为代表的TRP(EB)片段。它的碱基序列可用7-DEAZA序列分析药盒按双脱氧法来测定。
实施例4制备单核细胞趋化因子的表达性质粒的构建(4)插入trpR基因的制备单核细胞趋化因子MCF(75)，MCF(73)和MCF(70)的表达性质粒，按如下方法构建。这三种表达性质粒依次称为“pHM584，pHM585，pHM586。
将按实施例2所描述的方法构建的表达性质粒pHM484，pHM485，pHM486用限制性酶EcoRI和BamHI消化，以分离分别含有编码MCF(75)，MCF(73)，和MCF(70)的区域的较大的DNA片段。分别将这三个载体片段以T4DNA连接酶连接到按实施例3的方法制备的TRP(EB)片段上，以构建表达性质粒pHM584，pHM585，pHM586。这些表达性质粒的碱基序列用7-DEAZA序列分析药盒按双脱氧法来测定。
实施例5单核细胞趋化因子MCF(76)的制备(1)单核细胞趋化因子按下述方法用引导表达性质粒pHM483进入大肠杆菌LE392来制备。
将大肠杆菌LE392株接种在LB培养基〔1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸液，1%氯化钠(PH7.2)〕中，于30℃培育，直至在波长为600nm时吸光度(OD600nm)达到约为0.5为止。这种培养液在冰中固定30分钟，离心取得细胞。将细胞悬浮于50mM氯化钙溶液中，在冰中放置60分钟，离心取得细胞。细胞再悬浮于含有20%甘油的50mM氯化钙溶液中。在这种细胞悬液中加入按实施例1方法构建的表达性质粒pHM483。结果所得的混合物在冰中反应20分钟，在室温下反应10分钟，再与LB培养基混合，在37℃于摇动状况下培育60分钟。将这种培养物涂布于含有氨苄青霉素(25μg/ml)的LB琼脂平板(琼脂浓度1.5%)，在37℃培育过夜，由此选择出由导入所述质粒而具有氨苄青霉素抗性的转化大肠杆菌。结果所得的转化的大肠杆菌称为大肠杆菌“LE392/pHM483”。
在LB培养基上将大肠杆菌LE392/pHM483在37℃培育过夜。培养物以1%浓度接种于加有最终浓度为20μg/ml的3-吲哚乙酸的制备培养基〔成份1.5%含12份结晶水的磷酸氢二钠，0.3%磷酸二氢钾，0.1%氯化铵，2μg/ml维生素B1，0.5%酪蛋白氨基酸，2mM硫酸镁，0.1mM氯化钙，1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸液，1%氯化钠，0.4%甘油〕，在37℃培育24小时。将由离心收集的细胞悬浮于20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，然后以(超)声波来破碎，以取得细胞溶解物。这种细胞溶解物中MCF(76)的含量用电泳-CBB染色法来测试。
结果，在细胞溶解物中可测到大量的MCF(76)。在细胞溶解物离心后的颗粒部分中MCF(76)中的极大部分作为不溶性多肽被回收。在大肠杆菌LE392/pHM483的培养物中的总固相蛋白中MCF(76)的含量不少于约20%。MCF(76)的产量约为每100ml培养物中3mg。由于翻译始动密码，在MCF(76)的N末端可测到甲硫氨酸残基并发现该甲硫氨酸残基可几乎未去除。
实施例6单核细胞趋化因子MCF(76)是制备(2)单核细胞趋化因子MCF(76)是靠培育每一种转化体来制备的，这些转化体是由导入按实施例5的方法，用大肠杆菌P2392株，BL21(DE3)株，AB1899株，B/r-WP2-hcr-株和C600hflA株作宿主细胞，导入按实施例1的方法构建的表达性质粒而制成的。大量的MCF(76)可在大肠杆菌P2392株，BL21(DE3)株，AB1899株，B/r-WP2-hcr-株和C600hfl株的转化体的细胞溶解物中，用电泳-CBB染色法观察到。在大肠杆菌P2392株和BL21(DE3)株的转化体中，它的含量约为每100ml培养肉汤2-3mg。大肠杆菌AB1899株和B/r-WP2-hcr-株的转化体中，约每100ml培养肉汤1-2mg。在大肠杆菌C600hflA株中，每100ml培养肉汤约0.5-1mg。
实施例7
作宿主的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株中单核细胞趋化因子的制备(1)单核细胞趋化因子按下面描述的参考例2中的方法，用大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株作宿主细胞，在直接表达系统中制备。
将按实施例1的方法构建的表达性质粒pHM483按实施例5的方法导入大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株。将产生的转化的大肠杆菌进行培育。可以肯定，在用大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)作宿主时，与用大肠杆菌LE392株作宿主的情况相比较，用电泳-CBB染色法测定细胞溶解物中MCF(76)的含量，那么在直接表达系统中MCF(76)是等量的。在以大肠杆菌LE392株作宿主的情况下，由于在MCF(76)的N末端有翻译始动密码，用分析N末端氨基酸序列法可测到甲硫氨酸残基。可以发现，甲硫氨酸残基几乎没有被去除。
实施例8在作宿主的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)中单核细胞趋化因子的制备(2)单核细胞趋化因子MCF(75)，MCF(73)，MCF(70)，也即N-末端截去的MCF(76)多肽，可用下面参照例2描述的方法制得的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株作宿主，在直接表达系统中制备。这样按实施例2方法构造的用于制备每种截去的多肽的表达质粒(pHM484，pHM485，pHM486)按实施例5的方法被导入大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株。将产生的转化的大肠杆菌进行培育。按照电泳-CBB染色法来测定培育细胞中每一多肽的产量，可以肯定，这些多肽中的每一种，如与用大肠杆菌LE392株的情况相比，在转化体，大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株中，可等量地产生。更进一步，可观察到一种倾向，即从这些单换细胞趋化因子多肽的N末端去除由于翻译始动密码而存在的甲硫氨酸残基的比率依赖于每一多肽的N-末端结构。由于单核细胞趋化因子MCF(75)，MCF(73)和MCF(70)的翻译始动密码而存在的甲硫氨酸残基被发现几乎已完全去除。
实施例9用大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株作宿主单核细胞趋化因子的制备(3)单核细胞趋化因子MCF(76)和N-末端截去的多肽，也即单核细胞趋化因子MCF(75)，MCF(73)和MCF(70)，可用以如下描述的参照例2的方法制备的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株作宿主，在直接表达系统中制备。
这样，制备按实施例3和4描述的方法插入了trpR基因的各种单核细胞趋化因子的表达性质粒(pHM583，pHM584，pH585和pH586)按实施例5的方法被导入大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株。将每种已转化的大肠杆菌进行培育。按电泳-CBB染色方法测定每一被培育的细胞中每一单核细胞趋化因子的产量，与用大肠杆菌LE392株的情况相比较，可以肯定，在已转化的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株中，所述的多肽是等量或更多地产生。它的产量也相等于或更多于以pHM483，pHM484，pHM485，pHM486作为制备每一单核细胞趋化因子的表达性质粒的情况。更进一步，由翻译始动密码而存在的甲硫氨酸残基，在单核细胞趋化因子MCF(76)的N末端中可发现几乎完全存留，但在MCF(75)，MCF(73)，和MCF(70)的末端，由于翻译始动密码存在的甲硫氨酸残基，被发现几乎完全去除。
参照例1表达性质粒pHMC076的构建用于制备单核细胞趋化因子MCF(76)的表达性质粒pHMC0-76按如下方法构造。编码MCF(76)的DNA用重组质粒pHMCF7制备〔Furutani，Y.et al，Biochem Biographys.Res.Commun.，159，249-255，1989〕。插入于重组质粒pHMCF7中的互补DNA的碱基序列显示于SEQ ID NO18。将重组质粒pHMCF7用限制性酶PstI消化，以分离含有编码MCF(76)的碱基序列的DNA片段。这个DNA片段被插入M13mp18噬菌体载体，(Takara Shuzo CO)的多克降位点的限制性酶PstⅠ的切点。按实施例(所描述的位点特异性突变法，用这个重组噬菌体DNA和含有以SEQ ID NO19和20为代表的碱基序列的2个化学合成DNA作为各自致突变引物，将以SEQ ID NO21为代表的碱基序列插入与MCF(76)的N-末端氨基酸(Gln)相对应的密码子(CAG)的上游。进一步，将5′-TGACTCGAG-3′碱基序列插入连续到C-末端氨基酸(Thr)的末端密码子的下游。产生的突变的双链DNA，称为“(DraI)(XhoI)插入噬菌体DNA”。这部分碱基序列显示于SEQ ID NO22。这个突变的双链DNA被限制性酶DraI和XhoI消化，以分离与以SEQ ID NO22为代表的碱基序列的第142至第384号碱基相对应的DNA片段。这个DNA片段称为“MCF(DraI-XhoI)片段。”这个MCF(DraI-XhoI)片段包括具有编码MCF(76)的DNA的翻译始动密码子上游及其翻译终止密码子下游的序列。
表达性载体，pEP205(Furuta，R，et al，J.Biochem，106，436-441，1989)以限制性酶DraI和XhoI消化，以分离插在pEP205中的完全无人的白细胞间介素1α结构基因的大的DNA片段。这个DNA片段称为EP205载体片段。EP205载体片段的碱基序列包括trp启动子，氨苄青霉素抗性基因和复制点。所述的MCF(DraI-XhoI)片段，以T4DNA连接酶连接到EP205载体片段上，以构造表达性质粒pHMCO76。该碱基序列可用7-DEAZA序列分析药盒，用双脱氧法来确定。
更进一步，表达性载体pEP205的结构揭示于Furuta，R等的报告的图2(p.437)(J.Biochem，106，436-441，1989)。这个EP205载体片段对应于图2结构中除(C)区外的(d)-(a)-(b)区的约3.7千碱基对。该(a)-(b)区包括trp启动子和SD序列，称为“大肠杆菌trp-SD序列”。这个碱基序列以SEQ ID NO23为代表。(d)区应归于pBRS6(Yamada，M等，J.Biotechnol.，3，141-153，1985)，pBR322的衍生物，限制性酶DraI的识别序列(3个位点)是游离的。质粒pBR322的完全碱基序列已经确定〔Sutcliffe，J.G.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，43，77-90，1979;Peden，K.W.C.，Gene，22，277-280，1983〕。
参照例2大肠杆菌LE392突变株的制备以大肠杆菌LE392株作亲本株，一株有利福霉素抗性(Rifr)的突变株〔下文称为“大肠杆菌LE392(Rifr)”〕;一株需求胸腺嘧啶的突变株〔下文称为“大肠杆菌LE392(Rifr，Thy)”〕;一株recA突变株〔称为大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)〕在整合recA突变基团后，有利福霉素抗性与对紫外线的高敏性。
(1)大肠杆菌LE392(Rifr)株制备大肠杆菌LE392株，在37℃，震摇情况下于10ml LB培养基中培育过夜。将离心收集的细胞悬浮于1ml生理盐水中。将细胞悬液(0.1ml)涂布含有利福霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培育过夜。在LB琼脂平板上形成的菌落悬浮于盐水中，再划种含有利福霉素(100μg/ml)的琼脂平板，于37℃培育过夜，以分离单个菌落。这些被分离菌落被确定具有二个特性也即，由亲代株的表型决定的对甲硫氨酸的需求，和对突变株特异的利福霉素抗性，这个株被鉴定为“大肠杆菌LE392(Rifr)。”利福霉素的抗性可由在含有利福霉素(100μg/ml)的LE琼脂平板上的生长指数来确定。对甲硫氨酸的需求，可由在含有L-甲硫氨酸(40μg/ml)的M9琼脂培养基上(成份1.5%Na2HPO4·12H2O，0.3%KH2PO4，0.1%NH4Cl，2μg/ml维生素B1，2mMgSO4，0.1mM CaCl2，0.05%NaCl，0.2%葡萄糖和1.5%琼脂)的生长指数，和不在无L-甲硫氨酸的M9琼脂平板上生长，来确定。作为结果的大肠杆菌LE392(Rifr)株在含有利福霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养。这个培养物与7%浓度的二甲基亚砜(DMSO)混合，冷冻储存。
(2)大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株的制备在含有利福霉素(100μg/ml)的LB培养基上，在震摇下将所收获的大肠杆菌LE392(Rifr)株培养物培养过夜，以5%浓度，接种于含有胸腺嘧啶(200μg/ml)，三甲氧苄二氨嘧啶(200μg/ml)，和L-甲硫氨酸(40μg/ml)的M9培养基(成份1.5%Na2HPO4·12H2O，0.3%KH2PO4，0.1%NH4Cl，2μg/ml维生素B1，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.05%NaCl和0.2%葡萄糖)，在震摇下，于37℃培养过夜。进一步，该培养物，以5%浓度接种于含有相同成份的新鲜的M9培养基中，在37℃震摇培育过夜。将产生的培养物涂布含有胸腺嘧啶(200μg/ml)的LB琼脂平板，在37℃培育。所形成的菌落被测试对胸腺嘧啶的需求。对胸腺嘧啶的需求可由能在含有胸腺嘧啶(200μg/ml)和L-甲硫氨酸(40μg/ml)的M9琼脂平板上生长，但不能在含有L-甲硫氨酸(40μg/ml)的M9琼脂平板上生长的指标来确定。将用所述试验测得的对胸腺嘧啶有需求的菌落悬浮于盐水中，划种含有胸腺嘧啶(200μg/ml)的LB琼脂平板，在37℃培养过夜，以分离单个菌落。再次确定，此被分离的菌落有如下特征，诸如对胸腺嘧啶需求，利福霉素抗性和对甲硫氨酸需求，据此，这些菌株被定为大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株。制备好的大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株培育在含有利福霉素(100μg/ml)和胸腺嘧啶(200μg/ml)的LB培养基上。产生的培养物与7%浓度的二甲基亚砜混合，冰冻储存。
(3)大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株的制备大肠杆菌KL-16-19株仍在LB培养基上，37℃培养过夜。将此培养物以10%浓度在LB培养基上接种，以很慢速震摇，在37℃培育。当培养物的浓度在600nm波长下达到0.5，也即培养物相当于约5×108/ml细胞数时，培育停止。大肠杆菌KL-16-19株可从日本三岛411，国立遗传学研究所遗传保存物研究中心得到。这个研究所的保存号是ME6252。
大肠杆菌392(Rifr，Thy-)株，在上述相同条件下，于含有胸腺嘧啶(200μg/ml)的LB培养基中培育，以使培养物达到相同水平的细胞数。将得到的大肠杆菌KL-16-19株的培养物与大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株的培养物，按1∶10比率混合，在很慢速度的震摇下于37℃培育。以使雄性株，大肠杆菌KL-16-19株，与雌性株，大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株交联。在培育60分钟后，将此混合培养物于冰中降温，涂布含有利福霉素(100μg/ml)和L-甲硫氨酸(40μg/ml)的M9琼脂平板，并在37℃培育2天。生长在无胸腺嘧啶的M9琼脂平板上的菌落被选出，以获得重组的大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株，该株的对胸腺嘧啶的需求又回复到不需求。这个菌株被悬浮于盐水中，涂布LB琼脂平板，在37℃培育过夜，以分离单个菌落。再次确定，被分离的单菌落之一显示对甲硫氨酸需求，利福霉素抗性，但无对胸腺嘧啶需求。对这些特征的测试在上面已述。
进一步，测试被分离菌落对紫外线的敏感性。在此，由于整合了分离的大肠杆菌KL-16-19株的recA突变基因而显示有对紫外线高敏性的菌落被挑选出来。对紫外线敏感试验可这样进行将菌株接种LB琼脂平板，以紫外线(0.5mW/cm2)照射5秒钟，在37℃培育过夜，看菌株是否生长。用如上所述的在紫外线照射下不生长的标准来挑选任何一株对紫外线显示高度敏感性的菌株。在这种条件下，大肠杆菌LE392株，大肠杆菌LE392(Rifr)株或大肠杆菌LE392(Rifr，Thy-)株能生长。作为结果的，显示有高度紫外线敏感性的菌株，称为“大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株”。制备的大肠杆菌LE392(Rifr，RecA-)株在含有利福霉素(100μg/ml)的LB培养基上培育，与7%浓度的二甲基亚砜混合，冰冻储存。
参照例3大肠杆菌B/r-WP2-hcr-突变株的制备(1)用大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株作亲本株，按参照例2中所描述的方法制备显示利福霉素抗性的大肠杆菌株B/r-WP2-hcr-(Rifr)株，及显示利福霉素抗性和胸腺嘧啶需求的大肠杆菌B/r-WP2-hcr-(Rifr，Thy-)株。
参照例4大肠杆菌B/r-WP2-hcr-突变株的制备(2)用大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株作亲本株，按参照例2中描述的方法制备显示链霉素抗性的大肠杆菌B/r-WP2-hcr-(strr)株，及显示链霉素抗性和对胸腺嘧啶需求的大肠杆菌B/r-WP2-hcr-(strr，Thy-)株。在这种情况下，在制备突变株的每一步中，均用链霉素(100μg/ml)代替利福霉素。
样本序列目录SEQ ID NO1序列长度76序列类型氨基酸结构线性分子类型蛋白质序列描述
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr15 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75SEQ ID NO2序列长度28序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸终止子特征名字/关键码终止子定位点1……28确定方法S序列描述AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTTSEQ ID NO3序列长度18序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-从SD序列到翻译始动密码的序列特征名字/关键码RBS定位点1……8
确定方法S序列描述AAGGAGGTTT AAATTATGSEQ ID NO4序列长度850序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-TRP(EB)片段特征名字/关键码mat肽定位点360……681确定办法S序列描述
SEQ ID NO5序列长度554序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-MCF(SS)片段特征名字/关键码mat肽定位点40……267确定方法S名字/关键码RBS定位点22……29确定方法S序列描述
SEQ ID NO6序列长度17序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸…化学合成致突变引物序列描述TGACTCGAGG ATCCTCT
SEQ ID NO7序列长度524序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-MCF(DS)片段特征名字/关键码mat肽定位点9……236确定方法S序列描述
SEQ ID NO8序列长度46序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成DNA序列描述TCGAGTAGCC CGCCTAATGA GCGGGCTTTT TTTTCGCTTG AATTCGSEQ ID NO9序列长度46序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成DNA反意义是序列描述GATCCGAATT CAAGCGAAAA AAAAGCCCGC TCATTAGGCG GGCTACSEQ ID NO10序列长度50序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-化学合成DNA其他信息与碱基序列号5-46相应的完整链，在完整链中于碱基序列号47-50存在一个“CTAG”碱基序列。
序列描述TCGAGTAGCC CGCCTAATGA GCGGGCTTTT TTTTCGTTG AATTCG
SEQ ID NO11序列长度30序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述GAGGTTTAAA TTATGCCAGA TGCAATCAATSEQ ID NO12序列长度30序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述GAGGTTTAAA TTATGGCAAI CAAIGCCCCASEQ ID NO13序列长度30序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述GAGGTTTAAA TTATGGCCCC AGTCACCTGCSEQ ID NO14序列长度14序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成DNA序列描述CAACAATCAC CCTASEQ ID NO15序列长度979序列类型核酸链双链结构线性分子类型染色体DNA原始来源组织类型大肠杆菌K-12株细胞系HB101特征名字/关键码CDS定位点356……683确定方法S名字/关键码mat肽定位点360……681确定方法S序列描述
SEQ ID NO16序列长度30
序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述CAGCGCCGGG CGGAATTCTA TCGACGCAGTSEQ ID NO17序列长度30序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述ATCTCATCAA TAGGATCCCC GGTATAACGCSEQ ID NO18序列长度741序列类型核酸链双链结构线性分子类型对mRNA的DNA原始来源组织类型人(前骨髓)早幼粒白血病细胞细胞系HL-60特征名字/关键码CDS定位点70……369确定方法S名字/关键码Sig肽定位点70……138
确定方法S名字/关键mat肽定位点139……366确定方法S序列描述
SEQ ID NO19序列长度34序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述CAAGGGCTCG CTTTTAAATT ATGCAGCCAG ATGCSEQ ID NO20序列长度34序列类型核酸链单链结构线性分子类型其他核酸-化学合成致突变引物序列描述CCGAAGACTT GATGACTCGA GACACTCACT CCACSEQ ID NO21序列长度11序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-插入DNA序列描述TTTAAATTAT GSEQ ID NO22序列长度418序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-(DraI)(XhoI)插入噬菌体DNA特征名字/关键码Sig肽定位点70……138确定方法S名字/关键码mat肽定位点150……377确定方法S序列描述
SEQ ID NO23序列长度337序列类型核酸链双链结构线性分子类型其他核酸-大肠杆菌trp-SD序列特征名字/关键码-35标志定位点280……285确定方法S名字/关键码-10标志定位点303……308确定方法S名字/关键码RBS定位点328……335确定方法S序列描述
权利要求
1.制备具有单核细胞趋化活性的多肽的方法，其特征在于包括用一表达性质粒，该质粒具有翻译终止密码和结构基因下游的终止序列，和翻译始动密码，和核糖体结合位点序列，和由大肠杆菌分离得的，连接于结构基因上游的启动子序列；和用作宿主的大肠杆菌大肠杆菌LE392株，大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899株，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株或大肠杆菌C6000hflA株，或它们的突变株；用构建表达性质粒来制备非融合多肽形式的，具有单核细胞趋化活性的多肽，该质粒中存在整合的DNA，该DNA编码具有单核细胞趋化活性的多肽，该多肽由以SEQIDNO1为代表的氨基酸序列，或它们的在N-末端截去1或6个氨基酸的氨基酸序列组成；用引导所述的表达性质粒入内的方法转化作为宿主的大肠杆菌，培养该已转化的大肠杆菌。
2.制备具有单核细胞趋化活性的多肽的方法，其特征在于包括用一表达性质粒，该质粒具有翻译终止密码和结构基因下游终止序列，和由大肠杆菌分离的，插入的，可任意选择的阻遏子基因，和翻译始动密码，核糖体结合位点序列，由大肠杆菌分离的，连接于结构基因上游的启动子序列;用作宿主的大肠杆菌大肠杆菌LE392株，大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899株，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株，或大肠杆菌C600 hfl A株，或它们的突变株;用构建表达性质粒来制备非融合多肽形式的，具有单核细胞趋化活性的多肽，该质粒中存在整合的DNA，该DNA编码具有单核细胞趋化活性的多肽，该多肽由以SEQ ID NO1为代表的氨基酸序列，或它们的在N-末端截去1到6个氨基酸的氨基酸序列组成;用引导所述的表达性质粒入内的方法转化作为宿主的大肠杆菌，培养该已转化的大肠杆菌。
3.按权利要求2的方法，其特征在于终止子序列是以SEQ ID NO2为代表的碱基序列。
4.按权利要求2的方法，其特征在于终止子序列是以SEQ ID NO2为代表的碱基序列和从翻译始动密码到核糖体结合位点序列的序列，是以SEQ ID NO3为代表的碱基序列。
5.按权利要求2的方法，其特征在于宿主大肠杆菌的突变株是抗生素抗性株，胸腺嘧啶需求株，recA基因突变株或大肠杆菌LE392株，大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899株，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株或大肠杆菌C600hflA株的噬菌体的溶原菌株。
6.按权利要求2的方法，其特征在于阻遏子基因是一以SEQ ID NO4为代表的碱基序列，启动子序列是由大肠杆菌分离的色氨酸启动子操纵子，作宿主的大肠杆菌是大肠杆菌LE392株或它的突变株。
7.按权利要求2的方法，其特征在于宿主大肠杆菌的突变株是大肠杆菌LE392株、大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899株，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株或大肠杆菌C600hflA株的突变株，它们至少具有抗生素抗性、胸腺嘧啶需求、recA基因突变和噬菌体溶原性中的2个特性。
8.按权利要求2的方法，其特征在于宿主大肠杆菌株是大肠杆菌LE392株或它的有利福霉素抗性和recA基因变突的株。
9.按权利要求2的方法，其特征在于终止子序列是以SEQ ID NO2为代表的碱基序列;由翻译始动密码到核糖体结合位点序列的序列是以SEQ ID NO3为代表的碱基序列;阻遏子基因是以SEQ ID NO4为代表的碱基序列;启动子序列是由大肠杆菌分离的色氨酸启动子操纵子;作宿主的大肠杆菌是具有利福霉素抗性和recA基因突变的大肠杆菌LE392株。
10.大肠杆菌LE392株，大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899株，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株或大肠杆菌C600 hflA株，或它们的突变株，其特征在于是以一个有翻译终止密码，和下游终止序列的表达性质粒，和一个翻译始动密码，一个核糖体结合位点序列和一个从大肠杆菌分离的，连接编码具有单核细胞趋化活性的，由以SEQ ID NO1为代表的氨基酸序列或截去了它们N-末端1到6个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽的DNA上游的启动子序列来进行转化的。
11.大肠杆菌LE392株，大肠杆菌BL21(DE3)株，大肠杆菌AB1899，大肠杆菌B/r-WP2-hcr-株或大肠杆菌C600hflA株，或它们的突变株，其特征在于是用一个有翻译终止密码和下游终止序列，和由插入的从大肠杆菌分离的任意选择的阻遏子基因的表达性质粒，和一个翻译始动密码，一个核糖体结合位点和一个由大肠杆菌分离的，连接编码具有单核细胞趋化活性的，由以SEQ ID NO1为代表的氨基酸序列或截去它们N-末端1到6个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽的DNA上游的启动子序列来进行转化的。
12.按权利要求11的大肠杆菌株或它们的突变株，其特征在于由具有以SEQ ID NO2为代表的碱基序列作终止子序列的表达性质粒进行转化的。
13.按权利要求11的大肠杆菌株或它们的突变株，其特征在于是以具有以SEQ ID NO2为代表的碱基序列作为终止序列，和以SEQ ID NO3为代表的碱基序列作为从翻译始动密码到核糖体结合位点序列的序列的表达性质粒进行转化的。
14.按权利要求11的大肠杆菌株或它的突变株，其特征在于其中转化的大肠杆菌是大肠杆菌LE392株，或它们有利福霉素抗性和recA基因突变的株。
15.按权利要求11所述的具有利福霉素抗性和recA基因突变的大肠杆菌LE392突变株，其特征在于是以有以SEQ ID NO2为代表的碱基序列作为终止序列的表达性质粒;以SEQ ID NO3为代表的碱基序列作为从翻译始动密码到核糖体结合位点序列的序列;以SEQ ID NO4为代表的碱基序列作为阻遏基因序列;和从大肠杆菌分离的色氨酸启动子操纵基因进行转化的。
全文摘要
制备单核细胞趋化因子的方法，包括构建表达性质粒，在该质粒中插入编码由76个氨基酸或它们的截去N-末端氨基酸的多肽组成的单核细胞趋化因子的DNA，和有所述DNA下游插入的终止子序列；引导该表达性质粒进入选择出的大肠杆菌。诸如大肠杆菌LE392株或类似株，以转化所述大肠杆菌，并培养该转化的大肠杆菌。
文档编号C12N15/71GK1066470SQ9210346
公开日1992年11月25日 申请日期1992年5月9日 优先权日1991年5月9日
发明者山岸纯一, 松尾德幸, 福进寿一, 山田正明 申请人:大日本制药株式会社