专利名称：用酶工程技术制备苹果酸的方法
技术领域：
本发明是关于用酶工程技术制备L-苹果酸的方法。
L-苹果酸可作为食品添加剂，具有酸味正，回味好等特点，并兼有抑菌和辅助抗氧剂作用，在工业、食品、医药化工以及生化分析、临床检验上都有广泛的用途。
现有生产L-苹果酸的方法有化学合成法，微生物法等。化学合成法制备的苹果酸为D-型与L-型两种光学异构体，要进行拆分，所以，L-苹果酸的制备成本高，收率低，还存在三废污染等问题。微生物法制备L-苹果酸，后处理麻烦，成本高，体积大，工业化生产有一定的困难。因此，需要发明一种操作简便，收率高，成本低，易于工业化规模生产的L-苹果酸的制备方法。
本发明的目的，就是为了克服上述不足，用现代生物技术-固定化细胞酶工程技术制制备L-苹果酸。
本发明的制备方法如附图
所示(一)卡拉胶包埋取湿黄色短杆菌细胞(CPU 865，中国药科大学生物技术中心筛选)悬浮于生理盐水中，置45℃恒温水浴保温。另取卡拉胶溶于生理盐水中，加热溶解，两者于45℃混合搅拌10分钟，放置冰箱(2-10℃)1小时，即得到固定化黄色短杆菌细胞(以下简称固定化细胞)，为了增加固定化细胞强度，将固定化细胞放在0.3mol KCl溶液中浸泡4小时，切成小块，用生理盐水洗涤备用。
(二)固定化细胞的活化取湿细胞的固定化细胞，加含0.1-1%胆酸的1mol富马酸钠溶液，37℃保温处理24小时，然后用0.3mol KCl洗涤固定化细胞。
(三)装柱连续柱反应器柱15×150mm，附有外荚套，可通循环水保温。
将活化后的固定化细胞装柱(15×60mm)，在30℃～37℃下恒温水循环，通过荚套保温。
(四)转化1mol富马酸钠盐，pH6.0～8.0，以适当流速，通过连续柱反应器，一次转化率可达80%以上。生成的苹果酸钠转化液与添加的富马酸钙反应转晶生成苹果酸钙和富马酸钠，经转晶反应生成的富马酸钠与体系中未转化的富马酸钠一起通过连续柱反应器，重新进行酶促反应。反复循环后，可便富马酸钠100%地转化。
(五)酸化与结晶苹果酸钙经硫酸酸化，通过阴阳离子交换树脂净化，除去Ca2+与SO2-4后，减压浓缩至d＝1.36～1.38，室温放置24小时，离心收集L-苹果酸结晶，在50℃以下真空干燥。
本发明采用固定化细胞酶工程技术制备L-苹果酸，具有工艺稳定，操作简便，底物转化率高，成品质量稳定，产品后处理简单，生产规模易于控制等特点。产品特性与天然L-苹果酸完全一样，〔比旋度-1.6～2.6(水)〕，纯度可达99.5%以上。
主要工艺技术指标(1)固定化细胞酶表现活力为2.0～2.2万μmol/h·g湿菌，相当于3200～3500μmol/h·g固定化酶。
(2)底物转化率，一次性转化可达80%以上，多次转化可达100%。
(3)连续柱反应器使用半衰期260天(37℃)。
(4)产品收率，以富马酸计，产品总收率85%以上附图为制备L-苹果酸的流程图实施例11L 1mol富马酸钠，pH7.0以80ml/h流过50ml连续柱反应器，在柱转化液中加入0.5mol富马酸钙，搅拌5小时，上清液以80ml/h的流速通过连续柱反应器，反应液与上述钙盐搅拌2小时，过滤收集苹果酸钙，水洗后于80℃，烘干得0.4mol苹果酸钙，上述滤液中加入0.5mol富马酸钙，搅拌6小时，上清液以80ml/h流过连续柱反应器，柱转化液与上述钙盐搅拌2小时，过滤收集苹果酸钙，水洗后于80℃烘干得0.5mol苹果酸钙将上述苹果酸钙悬浮于1L蒸馏水中加入50ml浓H2SO4搅拌2小时，过滤除去CaSO4，滤液通过120ml 732(H+型)阳树脂与120ml 330阴树脂(OH-型)，再用500ml蒸馏水洗涤树脂所得苹果酸溶液于60℃减压浓缩至d-1.34～1.36，放置室温慢速搅拌结晶1天，离心收集L-苹果酸结晶，于50℃真空干燥，得成品100克。经分析含量≥98%，熔点96～104℃重金属(以Pb计)≤0.002%，砷≤0.0002%)。
实例2 1L 1.2mol富马酸钠，pH.，以90ml/h流过60ml连续柱反应器，在柱转化液中加入0.6mol富马酸钙，搅拌5小时，上清液以90ml/h的流速再次通过连续柱反应器，反应液与上述钙盐搅拌5小时(40℃)过滤收集苹果酸钙，将上述苹果酸钙悬浮于1L蒸馏水中，加入60ml H2SO4搅拌2小时，pH应为1.8～2.0，过滤除去CaSO4，滤液通过120ml 732(H2型)阳树脂与120ml330阴树脂(OH型)，再用500ml蒸馏水洗涤树脂，所得苹果酸溶液于60℃减压浓缩至d＝1.35～1.37，放置10℃结晶一天，离心收集L-苹果酸结晶，于50℃真空干燥，得成品121克。经分析含量＞98.5%，溶点96～104℃，重金属(以Pb计)＜0.002%，砷＜0.0002%。
权利要求
1.一种用酶工程技术制备L-苹果酸的方法，其特征是(1)用卡拉胶包埋制备固定化黄色短杆菌(CPU 865)细胞，(2)固定化黄色短杆菌(CPU 865)细胞在含0.1-1%胆酸的1mol富马酸钠溶液中进行活化处理(3)转化生成的苹果酸钠(转化液)加富马酸钙进行转晶反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是经转晶反应生成的富马酸钠与体系中未转化的富马酸钠再一起通过连续柱反应器，重新进行酶促反应。
全文摘要
本发明是关于用固定化细胞酶工程技术制备L-苹果酸的方法，将富马酸钠通过酶促转化、转晶、酸化、浓缩、干燥等方法，得到一种质量稳定，纯度高，与天然L-苹果酸特性相同的L-苹果酸，用于食品、工业、医药化工等领域。
文档编号C12N11/04GK1081206SQ9210764
公开日1994年1月26日 申请日期1992年7月14日 优先权日1992年7月14日
发明者吴梧桐, 汤卫国 申请人:中国药科大学