专利名称：用微生物方法对含氮杂环羧酸进行羟基化的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从相应的含氮杂环-羧酸来生产具有通式Ⅰ的羟基-含氮杂环-羧酸或它的可溶性盐的新微生物方法以及该方法所用的适当微生物。
下面我们将阐明含氮杂环-羧酸的羟基化或非羟基化，以及它的可溶性盐，例如碱金属盐或铵盐。
2-羟基-含氮杂环-羧酸是活性物质合成中的重要中间产物，例如在生产2-氯代烟酸可用2-羟基烟酸作为起始原料(US-PS4081451)，以及在制药时作为重要的中间产物。(Ann.Pharm、Er.，1980，3803)，第243-252页)。
迄今为止，还没有用微生物来生产羟基-含氮杂环-羧酸的方法。
本发明的任务是提供一种生产在化学上难于接触的2-羟基-含氮杂环-羧酸的简单的、符合环境要求的微生物方法。
本发明的任务根据本发明权利要求1所述的方法和权利要求6所述的新的微生物来解决。
本发明的方法是这样的把通式Ⅱ的含氮杂环-羧酸
作为基质，借助于含有特定羟化酶的可利用6-甲基烟酸的微生物把该物经羟基化成式Ⅰ表示的羟基-含氮杂环-羧酸。在式Ⅱ中，R1、R2可以相同，也可不同，表示氢原子、卤原子或C1-C4烷基，X表示氮原子或CR3-官能团，其中R3表示氢或卤原子;式Ⅰ中R1、R2和X具有上述同样的含义。
对“含特定羟基化酶应用于6-甲基烟酸的微生物”概念的理解如下用例如污水过滤后的淤泥作培养基来把6-甲基烟酸生物物质接种物培养成能利用6-甲基烟酸的微生物，该微生物利用6-甲基烟酸作为唯一碳源、氮源和能源。这时用现有的技术方法来选择微生物，把6-甲基烟酸完全分解，通过中间产物2-羟基-6-甲基烟酸得到含特定羟化酶的微生物，即该种微生物特定地能在酸官能团与氮原子之间的碳原子上羟基化。
原则上所有的微生物都适于本发明，按此规律例如可从污水过滤下的污泥或土壤样品进行挑选菌种，本文本中对微生物不作规定，是本发明的一部分。
适当地，本方法中的微生物以及它的后代和突变体定名KilolCDSM6920。这在1992年10月2日德文“微生物和细胞培养有限公司汇编”(SammlungfiirMikroorganismenandZellkulturenGmbH)Mascheroderweg1bD-3300Braunschweig中有记载。
Ki101(DSM6920)的科学描写;
细胞形状极小的棍状宽μm0.4-0.5
长μm1.0-1.5可流动性-Geisseln-革兰氏反应-(阴性)3%KOH中溶化情况+氨基肽酶(Gerny)+孢子-氧化酶+过氧化氢酶+关于16SrRNA序分析的类型还未被确定。
采用6-甲基烟酸进行微生物的筛选和培养按照专业上常用的方法进行。
选种时的“筛选”(Screening)系根据微生物在需氧条件下合适地进行，较好地在“筛选”时，微生物是静止培养的(不是摇瓶)。
在选种和培养时6-甲基烟酸的合适量为达1%重量，优选为0.5%重量。
选样和培养合适地在5-9pH值，较好在6-8pH值下实施。
选样和培养合适地在15-50℃，较好在25-40℃温度下进行。
通常选样和培养在矿物盐介质中进行，较好的在具有表1所描述的组成的矿物盐介质中进行。
适当微生物的光学密度在650nm(OD650)为0.5-100，可用专业常用的方法得到，或者可把作基体的含氮杂环-羧酸直接加入到微生物中，以测得适当转化的组成(生物转化)。
在细胞不生长的情况下用专业常用的方法来进行适当的生物转化。
用作通式Ⅱ的基质物质可以是例如烟酸，吡嗪羧酸或它的卤化物或C1-C4-烷基衍生物。
卤代的烟酸或吡嗪酸衍生物中较好的是用6-氯代烟酸，5，6-二氯烟酸和5-氯吡嗪羧酸来进行羟基化。
较好的是用5-甲基吡嗪-羧酸羟基化来得到C1-C4-吡嗪羧酸衍生物。
为了生物转化可连续或一次地加入基质，适当的基质的加入应使培养介质中的基质浓度不超过10%重量，较好的不超过7%重量。
生物转化的介质可用技术上常用的，较好的，生物转化应在-低摩尔磷酸-缓冲剂中进行。
通常生物转化在微生物悬浮液中进行，650nm(OD650)的光学密度为0.5-100，较好为5-50。
该生物转化适当地在15-50℃温度，较好在25-35℃温度，5-9pH值，较好在6.5-7.5pH值下进行。
在通常的反应持续5小时-3天以后，通式Ⅰ的羟化产品可用专业常用的方法，例如，通过酸化无细胞的上清液使之分离出来。
按本方法生产的通式Ⅰ的羟基含氮-杂环-羧酸，式Ⅰ中，当X表示氮原子时，R1和R2可相同或不同地表示氢原子，卤原子或C1-C4-烷基，例外的是当X表示CH-官能团，R1和R2表示一个卤原子时，R1、R2不能都是氢原子，这在本文中未作限制。
本发明中新颖化合物的较好代表是5，6-二氯-2-羟基烟酸、3-羟基-5-甲基吡嗪羧酸和3-羟基-5-氯吡嗪羧酸。
实施例1可利用6-甲基-烟酸的微生物的分离。
在300ml的锥形烧瓶中加入含1mmol 6-甲基烟酸(表1)的100ml矿物盐培养基，并掺入10ml污水过滤的淤泥，该淤泥来自瑞士Visp的隆萨公司生产的污水处理设备，或掺入来自Visp的隆萨工厂的泥土试样，在30℃静置培养10天后，可用分光光度计来证明有2-羟基-6-甲基烟酸的沉淀。随后在新鲜的矿物盐介质中接种培养多次，然后把能生成2-羟基-6-甲基烟酸的细胞悬浮液从含1.6%(w/v)琼脂培养基的同样介质上划线培养，接着，琼脂培养碟在含4%O2和96%N2的气氛中在30℃培养，把单细胞菌落逐个地移入液体介质并静止培养，定名为Kilol(DSM6920)的菌族即在6-甲基烟酸-2-羟基-6-甲基烟酸上生长、形成。
实施例2将烟酸经微生物氧化成2-羟基烟酸在1l Fernbach-烧瓶中，向800ml矿物盐培养基(表1)中的名称为Kilol(DSM 6920)的微生物中加入8毫摩尔6-甲基烟酸，在一摇瓶机上、在30℃、保温(每分钟100转下培养，接种量为达5%(v/v)，5天后OD650达到约0.5。随后把收得的细胞用50毫摩尔磷酸盐缓冲剂洗涤一次，接着把细胞再放于含200mg(1.38mmol)的烟酸-钠盐的20ml、50mM、pH为7.0的磷酸盐缓冲剂中悬浮，OD650达20。在摇瓶机上、30℃下培养6小时后，借助薄层色谱法证明不再有烟酸。然后离心分离生物物质并把上清液酸化至pH2.5，使2-羟基烟酸可沉淀下来。
借助1H-NMR(DMSO)分析可证明有分离出来的产品中没有污染，被分离出来的2-羟基烟酸为140mg(1mmol)，产率对烟酸来说为72%。
表1矿物盐介质储存液NaH2PO4·2H2O 156.0g
NH4Cl 10.0gK2SO41.2g用KOH调节pH值到7.0蒸馏水500.0ml储存液2:
对氨基苯甲酸8.0mgD-生物素2.0mg烟酸20.0mgD-泛酸钙10.0mg盐酸吡哆醛30.0mg二氯化硫胺20.0mg氰钴胺素(维生素B12) 10.0mg蒸馏水100.0ml消毒过滤储存液3HCl(37%)7.0mlFeCl2·4H2O 1.5gZnCl20.07gMnCl2·4H2O 0.1gH3BO30.006gCoCl2·6H2O 0.19gCuCl2·7H2O 0.002gNiCl2·6H2O 0.024gNa2MoO4·2H2O 0.036g
蒸馏水1000.0ml,121°压力釜蒸煮,20分钟。
储存液4NaOH0.5gNa2SeO3·5H2O 0.003gNa2WO4·2H2O 0.004g蒸馏水1000.0ml,121°压力釜蒸煮20分钟。
储存液5MgCl2·6H2O 40.0gCaCl2·2H2O 5.0g蒸馏水200.0ml,121°压力釜蒸煮20分钟。
6-甲基烟酸(500mM)6-甲基烟酸-钠盐80.0g蒸馏水1000.0ml,121°压力釜蒸煮20分钟。
生长培养基10mM6-甲基烟酸溶液125.0ml6-甲基烟酸20.0ml蒸馏水1000.0ml,121°压力釜蒸煮20分钟。
消毒后加入溶液20.5ml溶液31.0ml溶液41.0ml溶液50.5ml表2实施例3-7
实施例3-7按实施例2来实施，结果概括于表2。
实施例初始原料浓度 OD650时间产品产率(w/v)nm[h]36-氯代烟酸1%20166-氯-2-羟基-70%(分离)45,6-二氯烟1%20165,6二氯-2-羟20%(分析)酸钠盐基烟酸5吡嗪羧酸钠0.3%5243-羟基吡嗪羧70%(分析)盐酸65-甲基-吡0.3%5243-羟基-5-甲80%(分析)嗪羧酸钠盐基-吡嗪羧酸75-氯-吡嗪0.3%5243-羟基-5-氯-50%(分析)羧酸钠盐吡嗪羧酸实施例6分析的数据(3-羟基-5-甲基-吡嗪碳酸)1H-NMR(DMSO，400MHz)δ以ppm表示2，4，s;2，6，s;3，8，s;7，8，s。
13H-NMR(DMSO，100，5MHz)δ以ppm表示20，t;40，m;130，s;134，s;155，s，164，s;170，s。
实施例7的分析数据(3-羟基-5-氯-吡嗪羧酸)1H-NMR(D2O和二噁烷，400MHz)δ以ppm表示3，8，s;4，7，s;8，0，s。
13C-NMR(D2O和二噁烷100，5MHz)δ以ppm表示132，s;133，s;145，s;149，s，164，s;172，s。
权利要求
1.一种用微生物生产具有通式Ⅰ的羟基含氮杂环-羧酸或它的可溶性盐的方法，
式Ⅰ中，R1和R2可相同或不同地表示氢原子、卤原子或C1-C4-烷基，X表示氮原子或CR3-官能基团，其中R3表示氢原子或卤原子，其特征在于是在含特定羟化酶的利用6-甲基烟酸的微生物帮助下，把作为基质物质的通式Ⅱ的含氮杂环-羧酸或它的可溶性盐转化成式Ⅱ的产品，
式Ⅱ中，R1、R2和X具有上述的含义。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，把通式Ⅱ的含氮杂环-羧酸用作基质，
式中，R1和R2可相同或不同的表示氢原子、氯原子或甲基，X表示氮原子或CH-官能团。
3.如权利要求1和2的至少一项所述的方法，其特征在于反应是与名称为Kilol(DSM 6920)的微生物或它的后代和突变体进行。
4.如权利要求1-3的至少一项所述的方法，其特征在于，在反应进行时，一次性或连续地加入基质物质，使在培养介质中的基质浓度不超过10%重量。
5.如权利要求1-4的至少一项所述的方法，其特征在于，反应在15-50℃温度、5-9pH值下进行。
6.一种微生物，是这样被选出的，即利用6-甲基烟酸用作唯一的碳源、氮源或能源，以制成2-羟基-6-甲基烟酸。
7.如权利要求6所述的微生物，具有Kilol(DSM 6920)的名称，以及它的后代和突变体。
8.一种通式为
的羟基含氮杂环-羧酸，式中X表示氮原子，R1和R2可相同或不同的表示氢原子、卤原子或C1-C4-烷基，有一例外，即当X表示CH-官能团，R1和R2表示一个氯原子时，R1及R2不能都是氢。
9.5，6-二氯-2-羟基烟酸。
10.3-羟基-5-甲基吡嗪羧酸。
11.3-羟基-5-氯吡嗪羧酸。
全文摘要
本发明涉及从相应的含氮杂环-羧酸生产具有通式I的羟基含氮杂环-羧酸或它的可溶性盐的新微生物方法，以及与此方法相适应的新的微生物。
文档编号C12P7/02GK1077748SQ9310266
公开日1993年10月27日 申请日期1993年3月3日 优先权日1992年3月4日
发明者安德烈亚斯·基内亚, 安德烈亚斯·切希, 安德烈亚斯·廷舍特, 克劳斯·海因策尔曼 申请人:瑞士隆萨股份公司