专利名称：：耐贮存产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对易受微生物孢子损坏或致毒的产品、尤其是对环境稳定和长期冷藏的产品、特别是对食品进行的稳定化处理，及其制备方法。
背景技术：
：食用产品常遇到的问题是储存中易滋生孢子，因此需要防腐系统来延长其保存期限。一般的防腐系统有；对环境稳定的产品(i)中性pH加杀菌。杀菌一般包括相当于121℃持续3分钟的最小热处理(F0＝3)；(ii)低平衡pH(pH≤4.6)加巴氏杀菌以延长保存期限并使营养病原失活。用方法(i)和(ii)制造的产品都是高水分活度(Aw大于0.93)；或(iii)向产品中引入较多量的盐和/或糖再巴氏灭菌得到低水分活度(Aw)产品(Aw≤0.93)，从而延长保存期限并使营养型病原失活。对长期冷藏产品从安全角度出发，一般认为要长期冷藏的、中性pH和高Aw的产品需相当于90℃持续10分钟的处理方法使非分解蛋白质的肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)失活。从腐坏角度考虑，为防止耐热芽孢杆菌属增生需要相当于95℃持续25分钟的处理方法。所有这些防腐系统通常对产品的品质有损害，因此一段时间以来一直在寻求新的防腐系统来提供品质损失最小，即产品质地、颜色和/或口感损失最小的耐贮存产品，该系统能用于pH大于4.6和水分活度大于0.93的食用产品。令人惊奇地发现，如果采用下述步骤能达到以上目的首先使产品经高压处理，细胞膜毁坏剂可在高压处理前或后加入；然后经过将任何残余营养细胞失活的处理，这些细胞可能是由于孢子和/或非孢子形成微生物的繁殖而出现的。发明的说明因此本发明涉及制造耐贮存产品的方法，包括(a)将产品在小于或等于60℃下经10-1000兆帕压力处理1分钟-10小时；以及(b)使该产品中的任何残留营养细胞失活；其中膜毁坏剂在步骤(a)或步骤(b)之前或紧随步骤(b)之后加入到产品中。耐贮存产品是指无论在环境贮存条件(稳定期＞3个月)还是在冷藏条件(稳定期＞10天)下具有延长了保存期限的产品。营养细胞是指发芽的孢子或非孢子形成微生物。优选在步骤(a)之前加入膜毁坏剂为了获得所需的耐贮存产品，必须防止任何孢子在产品中发芽，或刺激孢子发芽然后杀死发芽的孢子。尽管本申请人不希望受任何理论的约束，但认为在上述步骤中存在下述情况。在步骤(a)中适中温度和压力条件下持续1分钟-10小时可使孢子发芽。优选该过程在膜毁坏剂存在下完成。令人惊奇地发现联合运用压力条件和膜毁坏剂导致很大程度的孢子发芽和极少量的超休眠孢子。我们相信这种非常有效的发芽和将超休眠孢子去除至少量是联合运用压力条件和膜毁坏剂独有的，这在其它条件，如联合使用温度和膜毁坏剂条件下是不存在的。此外，膜毁坏剂的存在可有效地防止活性微生物从发芽的孢子上形成。步骤(b)中的营养细胞是用例如热处理(常规巴氏杀菌)，反复热处理，压力处理，反复压力处理或其结合处理而失活的。该步骤不仅杀死非孢子形成微生物，而且还杀死发芽的孢子。净结果是孢子被很有效地去除，没有从孢子处形成活性微生物。步骤(a)的条件是10-1000兆帕和小于或等于60℃温度下持续1分钟-10小时。步骤(a)中优选的压力是50-400兆帕，更优选50-300兆帕，最优选50-250兆帕。可用任何产生高压的方法产生压力，例如可施用液压，其中产品本身是液体或浸入水中，然后升高水的压力。普通高压技术及其潜在用途由例如R.G.Earnshaw记述(FoodTechnologyInternationalEurope′92P85-88)。优选的温度是10-60℃，更优选20-60℃，最优选35-60℃。步骤(a)中优选的时间是10分钟-8小时，更优选20分钟-5小时，最优选20分钟-4小时。鉴于本说明书的目的，细胞膜毁坏剂一词是指本领域中已知的含义即能够侵袭微生物膜的任何试剂，例如lantibiotics，假无规肽类，magainins，attacins，cecropins，defensin，丁子香酚，allecin，枯草菌素，Pep5，表皮纤维，肉桂霉素，Ro09-0918，耐久霉素和ancovenin。细胞膜毁坏剂的优选用量是10-1000ppm，更优选15-300ppm，最优选25-150ppm。特别优选的细胞膜毁坏剂是例如EP427912记载的，名为lantibiotics。该组成员包括乳链菌肽和pediocin。该类中特别优选的是乳链菌肽。膜毁坏剂的另一类是假无规肽类。鉴于本说明书的目的，“假-无规”一词用以指完全无规的肽类和这些肽其中没有进行任何步骤抑制或限制肽生长成单一步骤延伸肽链，从而产生有序的残基序列。这些肽远比天然存在的肽结构简单，为已知的可用作药物载体或免疫测定技术中的试剂。肽类一般包括至少一种等电点大于7的氨基酸与至少一种有大官能团的氨基酸形成的共聚物。鉴于本说明书的目的，大官能团是总共有5个或更多个碳原子和杂原子的官能团。它们包括从甲苯甲酰环衍生的芳香基团(如苯丙氨酸和酪氨酸中)和吲哚类(如色氨酸中)，以及足够长的侧链如精氨酸的胍基，和赖氨酸的氨基。等电点大于7的氨基酸一般选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组。有芳族基团或其它大官能团的氨基酸一般选自由精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及其混合物组成的组。值得注意的是精氨酸和鸟氨酸有很高的等电点和很大的侧链官能团，因此聚精氨酸和聚鸟氨酸是有效的肽类。特别优选的肽类是那些包括精氨酸均聚物和赖氨酸与苯丙氨酸的共聚物，精氨酸和色氨酸的共聚物和/或赖氨酸与色氨酸的共聚物之肽类。混合系统也在构思之中。所有上述氨基酸都是天然存在的L手性型，因此优选使用这类氨基酸。两类氨基酸的摩尔比优选范围是10∶1-1∶10，更优选5∶1-1∶2，具有等摩尔或占优势摩尔的碱式氨基酸为优选。可在肽中出现的其它氨基酸包括非标准氨基酸如鸟氨酸，它不是必须氨基酸，但其等电点接近10。因此，优选的膜毁坏剂选自lantibiotics、假-无规合成肽类及其混合物。优选的膜毁坏剂是乳链菌肽。营养细胞的失活(步骤(b))可按任何适当的方式进行，例如温度在60-100℃进行热处理1-100分钟。但特别优选的失活是压力300-1500兆帕和温度60℃或更低以及时间1分钟-10小时进行的高压杀菌。如果在步骤(a)和步骤(b)中运用了高压条件则可提供极佳的产品质量。在本发明的一个特别优选的实施方案中，步骤(b)中的压力至少比步骤(a)中的压力大50兆帕，更优选比步骤(a)中的压力高100兆帕，例如比步骤(a)中的压力高100-400兆帕。步骤(b)中优选的压力是350-500兆帕。步骤(b)中高压失活期间优选的温度是5-50℃，更优选10-45℃，最优选15-40℃，例如环境温度。步骤(b)中高压失活优选的时间是5分钟-8小时，更优选10分钟-5小时，最优选10分钟-4小时。如果需要，步骤(a)和(b)可再进行重复以减少产品中的孢子数量。例如产品可经过2-10次上述防腐循环。优选的循环次数为2-4。本发明的防腐方法优先用于所有趋于出现孢子的产品。适用的产品例子有食品、个人用品和洗涤用品。本发明的防腐方法优先用于pH大于4.6，更优选pH大于4.6而小于10，最优选pH大于4.7而小于8的产品。食品的水分活度Aw优选为大于0.93，Aw更优选0.96-1.00，最优选0.97-1.00。由于本发明方法能用中等的温度生产耐贮存的产品，故本发明方法尤其适用于高温下品质会损害其品质的产品，例如当在防腐处理常用温度下加热时不稳定或发生不希望的结构变化或形成杂味的产品。可用本发明方法的化妆品例子有膏霜、洗液、补品、牙膏、口红、明胶、香波及其它头发用品。洗涤用品的例子有液体系统，如液态织物洗涤剂、家用清洗剂、磨料、织物整理剂和(半)固洗涤剂，如膏和肥皂条。本发明方法优选用来提供耐贮存的食料。适宜的食品例子是涂沫食品，特别是无脂肪或极低脂肪的涂沫食品，佐料，乳制和非乳制奶油，顶端装饰，加工干酪，馅饼，半硬干酪，沙司，甜糊，人造奶油，冰淇淋，肉和鱼制品，bavarois，焙烤和面团制品，蔬菜，水果，汤，乳制品，饮料。该方法特别用来提供环境稳定的沙司，汤和佐料。在步骤(a)和(b)之前、之中或之后，该食用产品优选装入适宜的包装袋中备用。如果在步骤(a)和(b)之前包装则不需要无菌灌装，因为该包装品还要经步骤(a)和(b)杀菌。但该产品如果在步骤(a)和(b)之中或之后进行灌装则优选采用无菌灌装条件。本发明将由以下实施例来说明。实施例1说明在压力处理前加入乳链菌肽对枯草杆菌的作用。枯草杆菌孢子的制备在BHI中于30℃下将枯草杆菌培养过夜。合适的等分试样被划线在加有0.04mg/LMgCl2的琼脂皿上(琼脂平皿计数(Difco))。该琼脂于30℃恒温培养3-5天。形成孢子的培养物(＞30％孢子)用无菌蒸馏水洗涤一次收集。压力处理所用孢子浓度为5ml蒸馏水中106-107/ml。这些孢子于35℃经200mPa高压处理180分钟，然后在85℃下巴氏杀菌5分钟。高压处理前加入了许多不同浓度(0-100ppm)的乳链菌肽。处理后孢子分散于琼脂中并于30℃恒温培养5天，之后计数。结果表示成对数减少因子。结果与下列所得对数减少因子进行比较，当；(a)没有压力处理和巴氏杀菌(b)没有压力处理，即只进行巴氏杀菌(c)只有压力处理，即不进行巴氏杀菌结果列于列1。比较例A说明在压力处理前加入溶菌酶(不是膜毁坏剂)对枯草杆菌的作用。重复实施例1，不同之处是在高压处理前加入许多不同浓度(0-200ppm)的溶菌酶代替乳链菌肽。结果列入表2，表示成对数减少因子。实施例2说明在本方法不同阶段加入乳链菌肽或pediocin对肉毒梭状芽孢杆菌的作用。肉毒梭状芽孢杆菌孢子的制备使用A型肉毒梭状芽孢杆菌菌株ZK3，62A，VII，B型肉毒梭状芽孢杆菌菌株2345，bolusalba，6。将等量的孢子混合在一起得到混合体。表1表2分解蛋白质的肉毒梭状芽孢杆菌孢子形成约0.1ml熟肉汤(Difco)培养体接种到10ml液体TPGS培养基中并于30℃恒温培养24小时。TPGS培养基胰胨(Difco)5％细菌胨(Difco)0.5％葡萄糖0.2％可溶淀粉0.2％半胱氨酸0.05％pH6.8于120℃灭菌15分钟(min)。全部培养体接种到1000mlTPGS中，该TPGS再倒在琼脂相上。两相培养体于30℃无氧培养5-7天。琼脂相肉抽提物(Liebig)1.67％细菌胨(Difco)1％胰胨(Difco)1％明胶(GelatineDelft)1％琼脂2％于120℃灭菌15min。当出现足够的孢子时(显微观察为10-70％)，孢子由收集液相获得。孢子悬浮液用蒸馏水洗涤3次，每次于约5℃按12000g重复进行离心分离10分钟。洗涤后将孢子放入超声浴中处理以得到疏松的孢子。经处理的悬浮液于80℃加热10分钟以去除肉毒梭菌毒素和/或营养细胞并菌落计数。非分解蛋白质的肉毒梭状芽孢杆菌孢子形成按所述的分解蛋白质的肉毒梭状芽孢杆菌的形成方法形成孢子，但该处理过的悬浮液于60℃加热30分钟以去除肉毒梭菌毒素和/或营养细胞并菌落计数。孢子的菌落计数在胨(0.1％)和生理盐水(0.85％)溶液中进行稀释。分解蛋白质孢子在含TSA，半胱氨酸和蛋黄(0.05g/ml)的倾注皿中计数。于30℃恒温培养3-5天。非分解蛋白质孢子在含TPG和蛋黄的倾注皿中菌落计数。处理在高压处理(于45℃200MPa处理180min)，巴氏杀菌(方案(i)-85℃持续5min；方案(ii)-95℃持续10min)之前或在压力处理和巴氏杀菌之后加入35ppm乳链菌肽或300ppmPediocin。肉毒梭状芽孢杆菌接种到CMM(熟肉培养基，Difco)中至最终浓度107/ml，作高压处理及巴氏杀菌。在Tryticase胨葡萄糖(TPG)中回收(以对肉毒梭状芽孢杆菌进行菌落计数)。TPG琼脂皿在30℃下无氧培养5天。结果表示成对数减少因子，列于表3。表3实施例3说明在干酪中乳链菌肽和高压处理对肉毒梭状芽孢杆菌的作用。肉毒梭状芽孢杆菌混合体按实施例2所述进行制备。处理肉毒梭状芽孢杆菌混合体的孢子混入有下述配方的干酪中；干酪配方重量％脱脂奶粉12.2乳蛋白浓缩物4.0黄油39.0盐1.1焦磷酸钠0.2柠檬酸钠二水合物0.4水43.1最终孢子浓度是107/ml。Nisaplin按0.05重量％的量加入到干酪中(相当于10mg/kg纯乳链菌肽)。该干酪经过按表4详列的许多不同的压力处理180分钟，然后于80℃巴氏杀菌处理10分钟。结果表示成对数减少因子，列于表4中。表4</tables>实施例4说明压力和乳链菌肽对肉毒梭状芽孢杆菌的作用按实施例2所述制备肉毒梭状芽孢杆菌混合体。处理肉毒梭状芽孢杆菌混合体的孢子加入到熟肉培养基(CMM，Difco)中至最终浓度为107/ml。CMM含0，10，35ppm乳链菌肽。接种到CMM的三个不同品种经过如表5所述的不同压力处理。压力处理后，接种的CMM品种经过以下巴氏杀菌方案之一处理(np)没有巴氏杀菌(i)85℃持续5min(ii)95℃持续10min在TPG中用与CMM中相同量的乳链菌肽进行回收。结果表示成对数减少因子，列于表5中。表5实施例6说明在压力处理/巴氏灭菌两步处理之后乳链菌肽对枯草杆菌的作用。枯草杆菌孢子按实施例1进行制备。使用的孢子浓度是5ml蒸馏水中106-107/ml。在压力处理和/或巴氏杀菌处理之前加入35ppm浓度的乳链菌肽。压力处理是200MPa，35℃持续180min。巴氏杀菌处理是80℃持续5min。结果表示成对数减少因子，列于表7中。表7实施例7表明巴氏杀菌和压力处理使营养细胞失活的对比。枯草杆菌孢子按实施例1所述进行制备。使用的孢子浓度是5ml蒸馏水中106-107/ml。孢子经过35℃60MPa高压处理30分钟，再进行以下之一(i)85℃巴氏杀菌5min或(ii)35℃400MPa压力处理10分钟。在高压处理(步骤(a))之前加入35ppm的乳链菌肽。处理后该孢子分散于琼脂中并于30℃恒温培养5天，然后计数。结果表示成对数减少因子，列于表8中。表8实施例8表明巴氏杀菌和压力处理使营养细胞失活的对比。肉毒梭状芽孢杆菌混合体按实施例2进行制备。肉毒梭状芽孢杆菌混合体的孢子加入到熟肉培养基(CMM，Difco)中至最终浓度为107/ml。该CMM含35ppm的乳链菌肽。孢子经过35℃60MPa高压处理30分钟，再进行以下之一(i)85℃巴氏杀菌5min或(ii)35℃400MPa压力处理10min。在TPG中加入35ppm乳链菌肽进行回收。结果表示成对数减少因子，列于表9中。权利要求1.一种制造耐贮存产品的方法，包括(a)在温度小于或等于60℃下将该产品经10-1000兆帕压力处理1分钟-10小时；以及(b)使该产品中的任何残留营养细胞失活；其特征在于在步骤(a)或步骤(b)之前或紧随步骤(b)之后向该产品中加入膜毁坏剂。2.如权利要求1的方法，其中该膜毁坏剂于步骤(a)之前加入。3.如权利要求1或2的方法，其中膜毁坏剂的量为10-1000ppm。4.如前述任一权利要求的方法，其中膜毁坏剂的量是15-300ppm。5.如前述任一权利要求的方法，其中膜毁坏剂的量是25-150ppm。6.如前述权利要求之任一权利要求的方法，其中该膜毁坏剂选自lantibiotics，假-无规合成肽类及其混合物。7.如前述任一权利要求的方法，其中膜毁坏剂是乳链菌肽。8.如前述任一权利要求的方法，其中步骤(a)中压力是50-400兆帕。9.如前述任一权利要求的方法，其中步骤(a)中温度是20-60℃。10.如前述任一权利要求的方法，其中步骤(b)中营养细胞通过热处理，反复热处理，压力处理，反复压力处理或其联合处理失活。11.如前述任一权利要求的方法，其中步骤(a)和(b)重复2-10次。12.如前述任一权利要求的方法，其中该产品的pH大于4.6。13.如前述任一权利要求的方法，其中该产品的水份活度大于0.93。14.如前述任一权利要求的方法，其中该产品选自食品、个人用品和洗涤用品。15.可由以下步骤得到的耐贮存产品(a)在温度小于或等于60℃下将该产品经10-1000兆帕压力处理1分钟-10小时；以及(b)使该产品中的任何残留营养细胞失活；其特征在于在步骤(a)或步骤(b)之前或紧随步骤(b)之后向该产品中加入膜毁坏剂。全文摘要一种制造耐贮存产品的方法，包括(a)，在低于或等于60℃的温度下使该产品经10-1000兆帕的压力处理1分钟-10小时；和(b)，使该产品中的任何残留营养细胞失活；其中，在步骤(a)或步骤(b)之前或紧随步骤(b)后向该产品中加入膜毁坏剂，如乳链菌肽。文档编号A23L3/00GK1135165SQ94194171公开日1996年11月6日申请日期1994年8月30日优先权日1993年9月24日发明者J·P·P·M·施梅特申请人:尤尼利弗公司