专利名称：用于预防和治疗病毒诱发肿瘤的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗病毒诱发的肿瘤的预防剂和治疗剂，特别是涉及到来源于曲霉属的发酵提取物组合物，这些组合物可用作预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤如乳头状瘤病毒诱发的肿瘤的表面用药物。
发明的
背景技术：
在哺乳动物中诱发肿瘤的病毒非常多。确实，现在已发现六十八种以上都能单独诱发肿瘤形成的人类乳头状瘤病毒。其中一些与良性肿瘤，比如寻常疣有关，而其它的则与感染哺乳动物的口腔以及生殖器粘膜发育不良和癌的病源物密切相关。另外一些能诱发肿瘤的病毒包括各种RNA病毒和疱疹病毒。
近来，还发现免疫系统功能低下如获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的个体易受人类乳头状瘤病毒感染从而引起全身生长肿瘤，给患者造成精神和身体上的巨大痛苦。
治疗病毒诱发的肿瘤常用的方法包括以下任何一种方法(1)外科手术(激光或手术)；(2)利用有机酸如冰醋酸和/或水杨酸将肿瘤“烧”掉；(3)将一种由基瘤制成的抗肿瘤疫苗小范围地注射到肿瘤中；(4)应用药物治疗[例如鬼臼树脂；干扰素和5-氟-2，4-(1H，3H)-嘧啶-酮；2-4-双氧-5-氟嘧啶。也即是氟尿嘧啶或5-FU]来除去肿瘤。
然而目前一般使用的对去除病毒诱发的肿瘤有效的治疗方法仍存在以下一种或多种缺陷(1)它们会损伤健康未感染组织；(2)会造成疤痕和外貌损伤；(3)可引起用此治疗的哺乳动物不适；和(4)它们并不能损伤在周围组织残留的潜在病毒的DNA。而且，采用这些治疗方法，患者会出现严重的全身副作用，肿瘤去除不完全和肿瘤的经常性复发。
人们也已知使用光疗法可去除喉部乳头状肿瘤。这种光疗法在抑制约50％的肿瘤生长的同时，也会造成至少六周的全身的皮肤光敏感性和其它微小的反应。而且，尽管这种技术取得了明显成功，而潜伏病毒的DNA仍然是残留在周围组织。
美国纸件专利No.5,073,630公开了一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫刺激特性的聚合镁酐和蛋白磷酰亚油酸铵。这种抗病毒剂是由一种曲霉属选择系的无细胞滤过物制备成的。但是那种化合物不溶于水且分子量大(316,000道尔顿)。而且，该化合物的重新获得仍有困难。
由此可见仍需要能预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的组合物，该组合物不会损伤健康的未感染的组织，不会导致严重的全身副作用，也不会给用此治疗的哺乳动物造成疤痕或外貌损伤和/或不适，且可损伤在周围组织中残留的潜伏病毒的DNA，这样可减少肿瘤的去除不完全和经常性复发。进一步来说，还需要制备这种预防和治疗的组合物的方法以及用这种组合物预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的使用方法。发明概述本发明的一个主要目的就是提供用于预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的组合物，该组合物既不会损伤健康的未受感染的组织，也不会对用此治疗的哺乳动物造成严重的全身副作用、疤痕、外貌损伤或不适，而且还能损伤在周围组织残留的潜伏病毒的DNA，从而减少了肿瘤的去除不完全和肿瘤经常性复发。
本发明的另一个主要目的是提供用于预防和治疗哺乳动物中病毒诱发肿瘤的组合物的简便、易行的制备方法。
本发明还有一个主要目的是提供预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的方法，这些方法既不会损伤健康的未感染的组织，也不会对用该方法治疗的哺乳动物造成严重的全身副作用，疤痕，外貌损伤或者不适，而且还能损伤在周围组织残留的潜伏病毒的DNA，这样就减少了肿瘤的去除不完全和经常性复发。
根据本发明所述，本文公开了用于预防和治疗哺乳动物中病毒诱发肿瘤的组合物。这些组合物既不会损伤健康的未受感染的组织，也不会对用该组合物治疗的哺乳动物引起严重的系统副作用、疤痕形成、外貌损伤或不适。而且，这些组合物会损伤在周围组织残留的潜伏病毒的DNA，从而减少了肿瘤的去除不完全和经常性复发。
这些预防和治疗的组合物优选表面使用。
本发明的预防和治疗组合物优选发酵提取物/和或其衍生物。这些发酵提取物的更好优选是一种曲霉属发酵提取物。优选的曲霉属发酵提取物是一种黑曲霉属发酵提取物。特别优选黑曲霉1.2 AN29和黑曲霉1.2 AN39发酵提取物。
本发明的组合物另外还优选含有药剂上可接受的载体的发酵提取物和/或其衍生物。
本发明的优选组合物包括浓缩的发酵提取物。如需要的话，这些提取物可进行冻干处理。
这些发酵提取物特别优选无细胞的全部粗提物。而且，这些无细胞的全部粗提物通过分子量截止为10000的膜超滤，这样得到保留物为10000分子量的渗透物。
如需要，本发明的组合物可以是酶组合物，这些组合物可以是本发明所公开的发酵提取物的衍生物，和/或来源于这些发酵提取物。
本发明的一个特别之处在于，本发明所述的曲霉属发酵提取物(和/或其衍生物)是用来制备预防和治疗哺乳动物中病毒所诱发的肿瘤的组合物。更优选地，曲霉属发酵提取物(和/或其衍生物)是用来制备哺乳动物所需的表面使用的预防和治疗组合物。
另外根据本发明所描述的，本文公开了制备本发明预防和治疗组合物的方法。这些方法包括在合适的培养基上培养曲霉属菌种。这种培养基优选固体表面培养基。这些方法还包括用水从培养基中提取细胞外的化合物，这样便得到液体的发酵提取物。这些方法还包括过滤所得到的液体发酵提取物，以去除其中的细胞生物质和孢子，这样得到一种液体发酵提取物。最后，若需要，所公开的方法包括冷冻所得的液体发酵提取物直至使用为止。优选在约4℃时进行这种冷冻。
另一个特别优选之外是，发酵提取物可通过冷冻干燥而浓缩。经这种冷冻干燥而得的冻干粉末(发酵提取物的)可在室温下用干燥剂储存直至使用。
一个特别优选之处是，在保留物冷冻之前发酵提取物可通过分子量截止为10000的截断膜进一步超滤。这种分子量为10000的超滤保留物的干燥固体含量为7.6％(w/v)。如需要，可再将保留物经脱水而浓缩。
较为优选地，本发明所公开的方法是用来制备表面使用的预防和治疗组合物。
根据本发明所述进一步可知，本文公开了预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的方法。这些方法的使用既不会损伤健康的未受感染的组织，也不会对用此方法治疗的哺乳动物造成严重的全身副作用、疤痕、外貌损伤或不适。而且，这些方法的使用会损伤在周围组织残留的潜伏病毒的DNA，这样便减少了肿瘤的去除不完全和经常性复发。这些方法包括制备含药剂上可接受的载体的发酵提取物和/或其衍生物，以便得到预防和/或治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的组合物。这些方法还包括对需要的哺乳动物给予治疗有效量的组合物。在预防时，可将这些药物用在需要这种预防方法的哺乳动物的体表，或者，在治疗时，将这些药物直接用在需要治疗的哺乳动物的病毒诱发的肿瘤部位。这些使用方法优选表面用药。
较为优选地，制备本发明的预防和治疗组合物包括制备一种发酵提取物，尤其是曲霉属的发酵提取物。更为优选地，此方法包括提供一种黑曲霉的发酵提取物。最好的优选是，这种方法包括制备黑曲霉1.2 AN29或1.2 AN39的发酵提取物。
若需要，本方法还包括制备发酵提取物的衍生物。
如需要，本方法还包括通过分子量截止为10000的膜对无细胞全黑曲霉发酵提取物进行超滤和回收分子量为10000的超滤残留物。如进一步需要，此方法还可包括蒸发浓缩残留物。
如果需要，本方法还可包括冰冻干燥发酵提取物，这样提取物被浓缩而得到粉末，可将冻干粉末在室温下使用干燥剂储存。
本发明的一个特别之处在于，所公开的是用于预防和治疗哺乳动物中EB病毒诱发的肿瘤的表面用防治组合物和其使用方法。
本发明的另一个特别之处是，文本公开了用于预防和治疗哺乳动物中棉尾兔乳头状瘤病毒诱发的肿瘤的表面用防治组合物和其使用方法。
本发明还有一个特别之处是，本发明所公开的是用于预防和治疗哺乳动物中乳头状瘤病毒诱发的肿瘤的表面用防治组合物及其使用方法。
一旦看了下面附有实施例的发明时，本发明这些和另外的目的和优点就显而易见了。
优选的具体说明本发明包含用于防治哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的表面用防治组合物。这些组合物是从发酵提取物和/或其衍生物中制成的。然后可将这些发酵提取物和其衍生物与药剂上可接受的载体相混合从而制成本发明的治疗组合物。
“发酵提取物”一词是指提取物的环境，特别是发酵环境，这种环境是已用一种适当微生物的培养物进行了接种，并且其中的微生物已经培养(成熟的)。
当“衍生物”和“来源于”用于指发酵提取物时，意思是指从发酵提取物中得到的(衍生或分离的)组合物或组分，如特殊的酶或酶的组合。顺便说明一下，有一种衍生物是经浓缩或过滤的发酵提取物。“衍生物”和“源于”同样可用于指与那些发酵提取物的组合物或组分是等同的，且已证明它们具有与发酵提取物相同的预防和治疗作用组合物和混合物。顺便说明一下，这一定义包括从发酵提取物中分离出的(如果需要，经纯化的)发酵提取物组分本身(如其活性剂)。再顺便说明一下，这种定义还包括模拟活性剂构建成(如，合成)的组合物或混合物，具有本发明的发酵提取物的预防和治疗作用。
更为特别的，本文所公开的发酵提取物及其衍生物是用一种适当微生物的培养物接种的表面发酵的水提物(或这种水提物的衍生物)。
发酵提取物优选曲霉属发酵提取物，更好的优选是黑曲霉发酵提取物。最佳的优选是黑曲霉1.2 AN29发酵提取物和黑曲霉1.2 AN39发酵提取物。
特别优选的是，发酵提取物为分子量10000的超滤残留物[干燥固体含量为7.6％(w/v)]。残留物可经蒸发而浓缩。
特别是已发现接种有黑曲霉培养基的表面发酵的水提物对于预防和消除哺乳动物疣起作用。
药剂上可接受的载体可以是本领域技术人员所熟知的任何载体。这种载体优选亲水物质，以便能协助防治组合物穿入皮肤。这些载体包括以下，但并不局限于此，如水性薄荷醇溶液，水，丙二醇，羊毛脂，丁醇，无水醇，异丙醇，二甲基亚砜，乳酸乙醚和其混合物。这种载体的另一个例子是众所周知的“VEHICLEN”，此组合物包括乙醇、异丙醇、纯净水、LAURETH-4(一种表面活性剂)和丙二醇。
用于制备本发明的防治组合物的发酵提取物(和/或其衍生物)和药剂上可接受的载体的准确用量优选浓度约为1％(w/v)至15％(w/v)的冻干发酵提取物(或其衍生物)。特别优选浓度约为8％的冻干发酵提取物。
预防和治疗的组合物可根据需要制备来用于被预防的哺乳动物的部位的表面，或需要治疗的哺乳动物所患的肿瘤比如疣的部位的表面。这些成分包括液体组合物，如油膏、搽剂和酊剂的组合物。由于乳膏、肥皂和凝胶能使防治组合物与皮肤和/或肿瘤有充足的时间保持接触，所以可作为特别优选。
虽然还不是非常明确，但一般认为本发明组合物的作用方式实际上并不一定是直接抗病毒或抗肿瘤。相反，可以认为本发明所公开的组合物的作用方式可能是刺激全身免疫系统的结果。细胞介导的应答可能对AN-1抗原很重要，这种抗原能诱发影响肿瘤生长的非特异性免疫应答。在这方面上，我们认为本发明的组合物可能是一种免疫增强剂。事实上，前面的研究已表明细胞介导的应答很可能对乳头状瘤病毒诱发的良性肿瘤和前期癌的消退起作用。
我们还认为发酵提取物的活性成分的分子量约在1000道尔顿至10000道尔顿至之间。而且发现发酵提取物的活性成分的分子量更特别接受10000道尔顿。
本发明的防治组合物对于预防和治疗病毒诱发的肿瘤例如那些由人类乳头状瘤病毒(HPV)、棉尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)、马乳头状瘤病毒(EPV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)引起的肿瘤是有效的。
制备本发明的防治组合物首先是制备适合的生长培养基。优选固体表面培养基。根据其中培养的微生物的不同，所使用的培养基也不同，这对于本领域的技术人员来说完全能够确定。如果所培养的是一种曲霉属，则优选的培养基包括7.9％(w/w)SOLKA FLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麦外壳；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜浆；0.39％(w/w)KH2P04；13ppm ZnSO4和60％(w/w)水。
然后将培养基灭菌、冷却并在其上接种需要培养的特定的曲霉属种孢子。接种和混合后，将培养基移至深约0.75英寸的多孔金属盘中。然后将这些金属盘放在30℃-32℃的高湿度的环境中孵育约72小时，这期间曲霉属菌种得到了培养。再在水(水提物中)搅拌几小时后回收(提取)到内含物，这样便得到液体的发酵提取物。然后再将液体发酵提取物过滤(通过末端滤器)以去除提取物中的细胞生物质、孢子和其它不溶物。
如果需要，液体的滤过提取物便可照此使用，或者将其进一步处理，如进行浓缩，以便制备其适合的衍生物。
这种进一步处理的例子包括通过分子量截止为10000的膜的发酵提取物的超滤过程，以便获得10000MW-UF的残留物。这种残留物可含有7.6％(w/w)的干燥固体组合物。再处理的另一例子是通过蒸发而浓缩(如，2.5倍)。在这种情况下，发现不论是无细胞的发酵粗提物还是分子量为10000(或任意大小)的残留物均可通过蒸发而被浓缩。
如果不需立即使用，这种液体滤过提取物(和/或其衍生物)最好在4℃冷冻，直至使用。
若需长期储存，可将这种液体滤过提取物(或其衍生物)进行真空浓缩，然后澄清滤液，将滤液(或其衍生物)冰冻干燥。由此得到的冻干粉末可在室温用干燥剂储存直至使用。
所得到的发酵提取物(或其衍生物)的冻干粉末极易溶于水。当需要用时，可将冻干粉末重新溶解在液体比如水中，和/或药剂上可接受的载体中。
本发明的预防和治疗组合可用于防治哺乳动物中病毒诱发的肿瘤。这些方法包括给需要治疗的哺乳动物使用治疗有效量的防治组合物，该组合物在药剂上可接受的载体中含有曲霉属发酵提取物(或其衍生物)。
“治疗有效量”一词意思是指对于防止或减缓新的或现存病毒诱发可疑的肿瘤生长的预防或治疗的有效剂量。
防治组合物的准确用量是指薄薄地覆盖在所需的哺乳动物(患病)的皮肤表面(如病毒诱发的肿瘤所在部位)的本发明表面用的防治组合物的必需用量。
防治组合物可以按本领域技术人员所熟知的任何适当的方式给药。这些方式包括皮下或静脉内注射。给药优选表面给药，例如，根据需要，辅以眼用滴管、多孔涂药器(如纱布，药签或布，卷顶涂药器)、刷子或任意其它的适当用具，将药涂在皮肤或肿瘤(或其所需的患处)的表面。
如果需要，可在感染之前用防治组合物来防治初期感染。我们发现当感染后不久使用防治组合物，或用于现有的肿瘤时，防治组合物具有显著抑制肿瘤的能力。还观察到只要肿瘤存在，每天至少要用这种组合物一至两次。但是，使用的具体次数可根据需要增多和/或减少，这对于本领域技术熟练人员来说是完全能确定的。应该注意防止皮肤对这些组合物反应的发展，但不管怎样，我们发现任何这种反应最终均会消失，而对所试验的物种没有任何损害。
因此为了描述本发明的防治组合物和其制备方法以及它们的使用方法，现在给出下面的实施例，这些实施例仅仅是举例说明，而不是也不应被视为对本发明的限制。
实施例1黑曲霉1.2 AN39发酵提取物的制备首先，制备适合的生长培养基，该培养基由7.9％(w/w)SOLKAFLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麦壳；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜浆；0.39％(w/w)KH2PO4；13ppm ZnSO4；和60％(w/w)水组成。
然后将培养基灭菌、冷却并接种黑曲霉1.2 AN39孢子，该孢子按照布达佩斯条约1992年7月30日以登记号21126保藏在农业研究所培养物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。
经接种和混合后，将培养基移至深约0.75英寸的多孔金属盘中。然后将这些盘放在30℃至32℃的高湿度(水分足)的环境中孵育约72小时，以制备所需的黑曲霉1.2 AN39培养物。再在水(水提物)中搅拌数小时收获到培养物，随后过滤(通过末端滤器)以去除细胞生物质、孢子和其它不溶物。
再将滤液真空浓缩，接着澄清滤液。所得的组合物为黑曲霉1.2AN39发酵提取物，称之为“AN-1”。
然后将一部分液体滤过提取物冰冻干燥制成AN-1发酵提取物粉末。这种发酵提取物的冻干粉末可在室温下使用干燥剂储存直至使用。
实施例2黑曲霉1.2 AN29发酵提取物的制备黑曲霉1.2 AN29发酵提取物按实施例1所述黑曲霉1.2 AN39发酵提取物的相同制备方法制备，不同之处是用黑曲霉1.2 AN29孢子接种冷却了的灭菌培养基，这种黑曲霉1.2 AN29孢子按照布达佩斯条约的规定于1993年9月7日以登记号21139保藏在农业研究所培养物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。把这种组合物称之为“AN-2”。
然后将一部分液体滤过提取物冰冻干燥制成AN-1发酵提取物粉末。再将这种发酵提取物的冻干粉末在室温下用干燥剂储存直至使用。
实施例3黑曲霉发酵提取物的体外治疗指数评价本发明酶组合物的体外抗EB病毒(EBV)和疱疹型病毒的功效是为了证实本发明的治疗组合物在体内的潜在作用。
抗病毒剂的药效的评断标准是通过比较细胞毒性的半数有效量与抗病毒的半数有效量的比率。这种比率就是“体外治疗指数”或“选择性指数”。对于危急病症，抗病毒剂的选择指数必须大于100才表明如(1)中所述的动物实验中对病毒抑制的有效作用。
本文所述的评估是通过Raji细胞与通常称为P3HR-1的EBV病毒细胞系的双重感染来进行的。P3HR-1是一种标准的实验室EBV菌株。双重感染后，便可测定培养物中的早期抗原。1.人类包皮成纤维细胞的制备在包皮环切术后尽可能获得新生儿的包皮，并在补加有(每mlDMEM)50μg万古霉素、3μg二性霉素B、100单位青霉素和25μg庆大霉素的Dulbecco基本必需培养基(DMEM)(GIBCO BRL，LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland U.S.A.)中于37℃放置4小时。
然后取出培养基，将包皮切成小碎片，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(GIBCO BRL)重复冲洗，这样可去掉钙和镁，洗到不再看见红细胞为止。
接着用0.25％(w/v)胰蛋白酶对组织进行胰蛋白酶作用，在CO2孵育器中持续搅拌15分钟。在这15分钟的后期，组织被沉在瓶底。再将含细胞的上清液经无菌干酪布注入含DMEM和10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，USA)的第二个瓶中。每次过滤细胞后，用含少量DMEM的血清冲洗干酪布。再将新鲜的胰蛋白酶加入上述的包皮碎片中，重复上述过程直到没有细胞为止。
整个受胰蛋白酶作用的过程中，第二个瓶(含培养基和受胰蛋白酶作用的细胞)是放在冰中的。
然后将第二瓶中的含细胞的培养基以大约1000RPM(约100g)于4℃离心10分钟(所需要的最小离心力是使细胞形成小球而不对细胞产生损伤)。去掉上清液，并将细胞再悬浮于约50ml的含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中。
之后细胞置于适当数量的25cm2的组织培养瓶中。将细胞保留在50μg/ml DMEM万古霉素和3μg/ml DMEM二性霉素B中于37℃下约72小时，直至细胞传代融合。然后对细胞进行如上所述的传代培养，但使用大瓶和新鲜培养基。这一过程还需重复两次直至得到四个传代。2.EBV的筛选试验A.病毒根据(12)所述过程，所使用的传染性EBV原型是来源于P3HR-1细胞系(按登记号VR 603从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)的上清液的病毒。这种细胞系产生非转化病毒，该病毒在初期感染或B细胞双重感染后可导致早期抗原(EA)的形成。B.细胞系Raji(按照登记号CCL86从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)是含有60EBV基因组/细胞的伯基特淋巴瘤细胞系，曾用作筛选对EBV早期抗原(EA)表达的抗病毒活性的原始细胞。
所有的病毒细胞系(P3HR-1和Raji病毒细胞系)均保留在RPMI-1640培养基(GIBCO BRL)中，培养基中补加有10％(v/v)胎牛血清、2.05mN/ml L-谷氨酰胺培养基和25μg/ml庆大霉素培养基。每周两次用新鲜培养基替代培养基体积的一半，并将细胞浓度调至(12)所述的3×105/ml。然后将细胞在37℃下含5％(v/v)CO2的湿润(90％)环境中保留至使用。3.用单克隆抗体的免疫荧光试验如(12)所述用EBV的P3HR-1菌株感染Raji细胞。于37℃被动吸收45分钟后加入上述实施例1中所得的组合物，并用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)冲洗细胞培养物。之后将培养物放在RPMI-1640培养基(上述的)于37℃孵育两天，以产生病毒基因表达。48小时的孵育完成后，按(12)所述用血细胞计数器计算每个标本的细胞数，然后将其点在有弓形体病的玻片(BellcoGlass Co.，U.S.A.)孔中并风干。
然后按(12)所述将针对扩散的早期抗原EA(D)(DuPont，U.S.A.)产生的单克隆抗体(由Dr.Gary Pearson，GeorgetownUniversity，U.S.A.无偿提供)加入玻片孔中的Raji细胞中。再加入荧光素共轭山羊抗鼠IgG抗体(Fisher Scientific，U.S.A.)，按(12)所述的步骤，用荧光显微镜肉眼计算玻片孔中荧光阳性细胞的数目。然后计算并比较含EA(D)的培养物中细胞的总数，如(12)所述，EBV的早期抗原表达在不显示荧光的Raji细胞中被抑制了。
4.体外细胞毒性AN-1的体外细胞毒性在上述得到的人类包皮成纤维细胞中测定，随后把在(13)所述的条件和技术做如下改变实验前24小时，将低传代人类包皮成纤维细胞固定在有96孔、浓度为每孔2.5×104细胞的组织培养皿(8×12平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)中。细胞置于含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，U.S.A.)的0.1ml DMEM中。然后将细胞放在CO2孵育器中于37℃孵育24小时。再吸出培养基并将100μl含2％(v/v)胎牛血清的DMEM加入除第一排的八个孔之外的其它孔中。将上述实施例1所得到的冻干发酵提取物(AN-1)溶解在含2％(v/v)胎牛血清的DMEM中直至浓度为100μg/ml。再将125微升AN-1分别加入第一排的每个孔中，并用Cetus液体处理器(Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.)将全部现存的孔移去25μl，用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM按1∶5连续稀释AN-1，使孔中的AN-1浓度范围为100μg/ml到0.03μg/ml，再将培养皿放在CO2孵育器中于37℃孵育7天。然后吸去含AN-1溶液的无细胞培养基，并在每孔中加入Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的0.01％(v/v)的中性红200μl。将此置于CO2孵育器中于37℃孵育1小时。去掉染料，用Nunc平皿清洗器(Nunc，Inc.，U.S.A.)冲洗细胞。撤去Dulbecco磷酸盐缓冲盐水冲洗后，每孔中加入50％(v/v)EtOH/1％(v/v)冰醋酸(水中)200μl。通过在轨道混合器上转动15分钟使内含物混合。然后，用平皿读数器(Beckman Instruments Inc.，U.S.A.)于550nm读出每孔的光密度。
对每个实验系统中经用100μg/ml AN-1处理的人类包皮成纤维细胞(通常为静止细胞)的视觉检验显示没有毒性。
AN-1的细胞毒性也已在人类包皮成纤维细胞增殖实验(迅速生长的人类包皮成纤维细胞)中测定。迅速生长的人类包皮成纤维细胞的细胞增殖实验已经完成。实验前24小时，将人类包皮成纤维细胞(上述所得的)以每孔含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中含有2.5×104个细胞的浓度种在有6个孔的组织培养皿中(有2×3平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)。在实验的当天，按1∶5的增量在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中连续稀释，使每个孔中AN-1的浓度范围在100μg/ml-0.03μg/ml。然后从细胞中吸去培养基，并在每个孔中加入2ml AN-1浓缩物。随后将细胞置CO2孵育器中于37℃孵育72小时。去除溶液中含AN-1的无细胞培养基并用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞(单层细胞)。再经抽吸去除Dulbecco磷酸盐缓冲盐水。在每个孔中加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶并孵育直至细胞开始从平皿孔的底部分离。用力来回吸取细胞-培养基混合物以使细胞悬液分散，将0.2ml混合物加入9.8ml稀释了的ISOTON III(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)中，用Coulter计数器(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)计算细胞数。对每个样本的三个复制孔计数三次。
用这种比较严格的毒性实验发现AN-1在100μg/ml时没有毒性。AN-1在100μg/ml(IC50大于100μg)时对未转染(无EBV)的Raji伯基特淋巴瘤细胞系也没有毒。如(12)中85页所述该方法是用于AN-1对未转染(无EBV)Raji伯基特淋巴瘤细胞的毒性测定的。5.结果这些筛选结果如下所述，其中EC50(50％有效浓度)是抑制50％病毒的细胞病原性所需的浓度；IC50(50％抑制浓度)是抑制50％细胞增殖所需的浓度；和S.I.代表“选择指数”。SI＝IC50/EC50。(1)。
当检测AN-1对Raji细胞(～60EBV Copies/细胞)中EB病毒(EBV)的早期抗原(EA)表达的抗病毒活性时，所得的选择指数(SI)大于137(IC50＞100μg/ml÷EC500.73μg/ml)，如下EBV(RAJI细胞)免疫荧光法-微克(MCG)/mlEC50＝0.73；IC50＞100；SI＞137由于RAJI细胞中AN-1的选择指数大于100(＞137)，表明在哺乳动物试验中对病毒的抑制有效。
无环鸟苷(对多种疱疹病毒具有抑制活性的一种抗病毒标准物)的EC50为4.9μg(ACV EC504.9)。因而，AN-1的粗样本的药效超过无环鸟苷的6.71倍。可以预测出，经纯化后，AN-1组合物的特殊活性还会增加。
抗病毒剂AN-1的粗制品在体外100μg/ml时，对I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人类巨细胞病毒或水痘带状疱疹病毒均无抑制作用。
实施例4黑曲霉发酵提取物用作表面治疗剂使用NIH(国家健康研究所)的棉尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)的兔模型体系能在兔中找到与疾病相关的人类乳头状瘤病毒的体内研究的最佳动物模型体系。这种体系以前是用来检验测定病毒剂的。
CRPV是中西部棉尾兔天然特有的，它能诱发皮肤乳头状瘤，其中约25％进一步形成侵害性癌。将CRPV注射在家兔的皮肤上会不断地形成疣。因此，CRPV兔模型体系可用于检验不同的抗病毒剂的阻止或减缓疣生长的功效。
在NIH的CRPV一兔模型体系中进行上述实施例1中所得到的无细胞冻干发酵粗提物(AN-1)的治疗作用的对比试验。该试验的第一步是比较动物肿瘤的存在和大小，这些试验动物或者a)仅接受50％(v/v)甘油的局部治疗(第1组)；或b)接受含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油的治疗(第2组)；或c)开始九周根本不进行治疗，感染了CRPV后再用含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油治疗。这样，将第2组(预防作用)和第3组(治疗作用)与第1组和对照组进行比较，可以研究本发明的组合物的预防和治疗作用。方法和技术1.病毒的制备从野兔的肿瘤中分离出CRPV并用(2)中所述的标准方法进行制备，得到不含细胞残渣的10％(w/v)棉尾兔疣的匀浆。经不断稀释滴定病毒，并在家养雄性荷兰兔身上划痕，如(3)中所述，这样约3-4周后形成疣。然后用等密度CsCl密度梯度将一部分该病毒纯化，如(4)中所述产生纯化病毒颗粒。
之后将切除的肿瘤放在液氮中冷冻，用研钵和研棒将其研碎，如(4)所述便制成10％(w/v)的悬浮液。按(2)所述再将病毒的上清液用于43g/100ml、32g/100ml和27g/100ml的速度分级梯度，并在18℃以70,000g(在SW27转子中)离心2小时，这些在(2)中进行了描述。收集病毒带，透析48小时，稀释并用CsCl使密度达到1.34g/ml，这些也在(2)中进行了描述。再将病毒绑在SW50.1转子中以100,000g于18℃下离心40小时，收集并透析，这些在(2)中作了进一步描述。2.实验记录按(2)所述用纯化的CRPV病毒颗粒(上述所得的)对两只兔(C1和C2)进行免疫接种。
使三组中的每七只兔均感染上上述所得到的CRPV。用50μl现有病毒的1∶4稀释液(约32ID50单位)感染每只兔背部的八个部位(左边四处和右边四处)。如(3)所述，用划痕法进行这种感染。
一周后，开始表面治疗。用100μl的50％(v/v)甘油去离子水每天两次给第1组(对照组)的样本进行治疗。用100μl含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油去离子水每天两次给第2组的样本进行治疗。第3组的样本用100μl与治疗第2组样本相同的组合物每天治疗两次，但这种治疗是在感染后的第九周初才开始的，此时大多数的感染灶都已长出了肿瘤。每组的治疗均持续两月。
通过用特殊方法接触感染的肿瘤部位并用一种“橡皮淀帚”使这种接触保持约5秒从而使治疗引进.这样来实现这些治疗方法。3.细胞的DNA的分离从第2部分三个小组的各个样本中取出肿瘤、切碎并用蛋白酶处理(消化)，这些在(5)中进行了描述。然后在冷却的消化物中加入氯化钾和乙醇，以分别沉淀其中的蛋白络合物和所有细胞的核酸，这些也在(5)中进行了描述。用十二烷基硫酸钠-蛋白酶消化，苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀后，再用核糖核酸酶A处理去除RNA。4.放射性标记的CRPV DNA的制备从上述第3部分的分离的DNA中得到CRPV DNA，并根据(2)所述将其分子克隆到pBR322(Clontech Laboratories，U.S.A.)中。如(2)所述，在适用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱适当的DNA带后，用EcoRI处理，从质粒载体中去除克隆化的CRPV DNA。根据(6)所述再经切口平移用32p-dCTP对CRPV DNA进行放射性标记。通常获得约3×108cpm/μg的比活。5.DNA分析如(5)所述在严格条件下进行DNA滤膜杂交。根据(5)所述从上述第三部分中由蛋白酶和洗涤剂、酚和氯仿分离的DNA中提取细胞的DNA，随后用基因扩增(TM)(Perkin-Elmer，U.S.A.)和来源于CRPV E6开放读框的寡聚体引物通过聚合酶链反应(PCR)进行分析。引物所用的序列为5′-GAACTGCCTGCCACGCTCGC-3′序列标识号15′-CGCCTGGCCCTAGGTCAAC-3′.序列标识号2循环35次后，杂交到放射性标记CRPV DNA探针上之后，扩增0.5μg细胞DNA可能会在初始样本中测得少于1fg的CRPV DNA。见(3)。6.血清试验从第二部分中的每个样本中抽取外周血用于CRPV毒性蛋白的体液抗体中酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。根据(7)中所述，将上述本实施例第1部分的纯化病毒颗粒与弗氏完全和不完全佐剂结合以产生抗-CRPV血清。如(7)所述在标准的酶联免疫吸附测定试验中使用10ng纯化的毒粒蛋白，发现这些血清具有7.7×104-4.7×105的效价。这些血清在酶联免疫吸附测定试验中是作为阳性对照[如(7)所述]以检测试验动物中的体液CRPV抗体。用1mg冻干粉末(上述实施例1所得)作为抗原测定血清对黑曲霉发酵提取物(AN-1)的反应性。在两组试验中，对来源于感染前的和研究结束时的兔子的血清进行了分析。效价至少增加4倍的对比结果表明有显著性意义。7.统计分析采用(8)所述的卡方试验法检验有疣或无疣的单个样本组与对照组对比的显著性。用(9)、(10)和(11)中所述的FisherExact Test评定血清抗体效应的差异性。用(9)-(11)所述的方法使用Fisher Exact Test计算“P值”。这儿所使用的，P值是指概率指数。我们认为等于或小于0.05的概率指数(P)具有显著性意义，表明这种结果随机出现的机会少于5％。8.结果A.临床观察后面讨论的临床观察的结果总结如下表1所示表1表面使用黑曲霉发酵提取物对CRPV所引起的疣的生长和去除作用的临床观察感染部位重量/肿瘤数
开始治疗后八周，在第1组(未使用任何组合物)的动物中96％的肿瘤感染部位和没有接受任何治疗的第3组中动物的94％的中观察到了肿瘤。相比之下，在第2组动物中仅有80％观察到了肿瘤。第2组是用组合物进行预防处理的组，且是直至此时使用任何组合物的唯一的样本。因而，可以发现，在CRPV感染的一周内开始延长表面用药一段时间，八周后与对照组相比肿瘤数减少了17％。又过了九周后(没有继续治疗)，与对照组相比发现样本的肿瘤数减少了43％。
肿瘤的17％和43％减少证实了本发明的组合物的预防作用。
对于第3组的样本(用组合物进行治疗的组)，发现当对有现存肿瘤(CRPV感染后九周出现)的样本表面反复使用AN-1时，大约八周后，这些样本比对照组样本减少了24％的肿瘤(第3组样本肿瘤感染部位的百分比为57％，P＞0.05)。这24％的肿瘤减少证实了本发明的组合物的治疗功效。
总之，该试验证实了本发明的组合物对防治病毒诱发肿瘤的预防和治疗作用。
1)皮肤反应试验中发现使用AN-1几周后每组有几个样本出现“皮炎”(红的、凹凸不平的表面)，这种皮炎开始仅在用药的附近出现。然而，随着实验的进行，我们发现皮炎会有更大范围地扩展。
所观察到的皮炎使人想起退行性疣患者身上所见的皮肤发红和瘙痒。
由于样本以前或持续暴露于黑曲霉抗原，人们怀疑样本可能曾经有过迟发型变态反应。如所观察到的这种迟发型超敏反应是一种细胞免疫应答。动物的尸体剖检发现对大多数器官没有不适的副作用。在一些用AN-1治疗的动物的肿瘤部位，表皮被中等量淋巴细胞和小量巨噬及浆细胞浸润。在与超敏反应有关的无乳头状瘤病毒感染的小结处可见到同样的浸润。
2)疣的消退感染后112天，各组均出现一些肿瘤消退。此时，第1组感染部位肿瘤的百分比为75％。所以，有25％肿瘤消退。由于用发酵提取物进行治疗，第3组的样本的肿瘤中另外有24％疣消退。但是，第3组中一些已消退的肿瘤是用AN-1治疗前消退的肿瘤，这取决于中间肿瘤大小的测量。B.血清的观察用酶联免疫吸附测定试验检测各样本的试验前血清和试验后血清对CRPV和AN-1抗原的反应性的血清试验如表2所示。C1和C2分别代表对照样本#1和对照样本#2，它们是作为此酶联免疫吸附测定试验的对照
表2用CRPV和AN-1抗原的酶联免疫吸附测定试验的结果每只动物血清的效价
将血清按1∶10稀释，然后再稀释两倍。将阳性对照的血清按1∶10稀释后再稀释六倍。效价为稀释度的倒数。当490毫微米时的吸收率为0.1或更大时是最后稀释的终点。四倍或更多的增加可认为有显著性意义。对照组包括用上述(3)中的纯化CRPV病毒颗粒免疫接种过的样本。
上述表2的结果表明，第3组有5只动物对CRPV抗原产生显著的血清学阳性反应(后/前之比等于或大于4)，相反第1组仅有1只样本有此反应。按照Fisher Exact Test，第1组样本(未使用任何本发明的组合物)与第3组样本(使用本发明的组合物治疗)对CRPV抗原的反应的差异具有显著性意义(P＝0.05)。
还观察到第3组有4只样本对AN-1抗原有血清学阳性反应，相比第1组只有1只样本有此反应。虽然这似乎进一步表明本发明组合物的功效，但从统计学来说，这一比例表明第1组和对照组动物的反应没有显著性差异。
尽管发现增强的抗原反应与所观察到的肿瘤生长或不生长没有关联，但通常在第2和3组中对一种抗原的反应的增加与对其它抗原的反应的增加是相等的。对疣消退的血清学反应的作用还不清楚。这些结果表明，全身的超敏反应，如通过皮肤反应所观察到的，可作为AN-1促进乳头状瘤消退的途径。C.分子检测本试验中，如(3)所述的PCR-杂交分析是在三组样本的肿瘤阴性部位进行的，目的是检测在每个CRPV诱发的肿瘤中CRPV的实际存在。研究表明第1组有23％(3/13)之多的试验部位有CRPV DNA，相比，第2组仅有6.5％(2/31)的试验部位，第3组有9.5％(2/21)的试验部位(见表3)。与此相比，在作为阳性对照的肿瘤样本中有76％发现CRPV DNA。
表3PCR DNA分析的结果<
1如(3)所述，取出感染部位以得到总DNA，用PCR扩增证明CRPVDNA的存在并用Southern Blot Analysis进行分析。对三个研究组的第一组所有肿瘤阴性部位进行检验。仅对每组肿瘤阳性部位的代表性抽样进行了检验。2CRPV DNA阳性数与检测数之比(％)。这是本表中原始材料的总结。3原始材料如下兔子数CRPV DNA阳性的感染部位兔模型体系中的这些结果似乎表明在人类以及其它哺乳动物中达到预防和治疗的目的时本发明组合物的功效。
实施例5黑曲霉发酵提取物用作表面治疗剂对鼻部长有疣型肿瘤的两匹马均进行两周治疗。用棉纱布将上述实施例1所得到的液体滤过发酵提取组合物(冰冻干燥前)涂在每只马鼻子一侧疣的表面上。作为对照，用棉纱布将灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)涂在每只马鼻子另一侧疣的表面上。1.实验记录治疗是这样进行的，将30ml溶液(PBS对照组合物)置于数层纱布上，再轻敷在疣上直至吸收。每次治疗期间重复两次，以使患处吸收。治疗在第0、1、2、3、7和14天进行。观测在第0、1、2、3、7、14、21和30天进行。2.结果大约治疗开始后第7天，用组合物进行治疗的一侧鼻中的疣外观上开始改变(变得较白，而另外的为粉红色外观)。
到第21天，发现敷有PBS的一侧疣变得更大，似乎数量增多了。这些疣为粉红色且生存能力很强。用组合物治疗的一侧的疣依然存在，但它们的大小和数量没有增长。另外，它们外表为白色且很硬。
到第30天，与第20天对比没有什么改变。3.结论本发明的组合物对疣具有治疗作用。用PBS处理的疣变得更大且扩散了，表明在这两种处理的初始时疣仍未成熟。因此，第30天时用PBS处理和用组合物治疗的疣在外观上的差异是有显著性意义的。
实施例6黑曲霉发酵提取物用作表面治疗剂用于体内研究人类乳头状瘤病毒相关疾病的另一个极好的动物模型体系是重度联合免疫缺损(SCID)小鼠。
重度联合免疫缺损小鼠是从别的动物中移植细胞的嵌合动物。这类重度联合免疫缺损小鼠几乎很少有移植物抗宿主疾病。由于移植重度联合免疫缺损小鼠的引进细胞支持感染，所以重度联合免疫缺损小鼠是检验治疗和预防组合物的一种有吸引力的模型。参考Milman，G.，and D′Souza，P.，ASM News(1990)Vol.56，No.12 at 639-642，可以得到重度联合免疫缺损小鼠的全部说明，其内容也包括在本文中。
此模型包括用棉尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)对已移植到重度联合免疫缺损小鼠的背部的新西兰白(NZW)兔耳的皮肤进行感染。然后判断潜在的抗乳头状瘤病毒治疗对抑制疣生长的能力。由于重度联合免疫缺损小鼠在免疫学上为T和B细胞功能缺损，所以这种模型用来检验本发明的防治组合物(黑曲霉发酵提取物AN-1)的功效时不考虑任何这些免疫因素的介入。
上述实施例1所得的关于冻干无细胞发酵粗提物(AN-1)的治疗作用的对照试验是按以下所述进行的
材料和方法CRPV原料病毒原料是通过研磨棉尾兔疣得到10％(v/v)的组织匀浆，再将其离心以去除细胞残渣而制成。上清液贮存于-70℃直至使用。
新西兰白兔皮肤的移植和感染将新西兰白兔耳皮肤移植到麻醉的小鼠的背部两侧并进行数周的治疗。然后用27G的针(100×)划痕并在擦伤的组织处放5μl的未稀释的CRPV培养物，这样使两侧腹的组织受感染。
混合物的制备所有的混合物均在水乳膏中制备，得到最终浓度达8％(w/v)并加有10％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)的冻干提取物。将400mg混合物加入4.1g乳膏中并搅拌15分钟。为了帮助溶解将混合物置于56℃水浴1小时。最后，加入0.5ml DNSO并再搅拌该混合物。在治疗之间将混合物在4℃下储存。
损伤的治疗感染(PI)后3天开始在CRPV感染的移植物的左右两侧每天两次进行表面治疗，持续到感染(PI)后第6周。每个治疗组有5只小鼠，每组感染移植物为10只。
功效的判断用下述的损伤记分法从第2周至第8周每周判断治疗功效分数 临床表现0无明显的感染1感染部位的皮肤增厚2小而分散的乳头状瘤3大而分散的乳头状瘤4半融合的乳头状瘤5融合的乳头状瘤6稠密的角蛋白角质为了数据的分析，将治疗组移植物的损伤分数加在一起进行平均。确定曲线以下的面积(AUC)，对于未进行治疗的对照组动物则计算每次处理的曲线以下面积的减少百分比。
结果结果总结于下面表4中
表4
在这一模型中，一般认为曲线以下面积减少大于未治疗动物的20％则有显著性差异，可能表明有效的治疗作用。使用无细胞的黑曲霉粗提物(AN-1)曲线以下面积的减少为21.1％。因此，可以看到当在这种模型中实验时，使用AN-1发酵提取物能使疣的生长明显减少。
在没有脱离本发明的基本构思的情况下可进行许多改进。因此，对于本领域技术人员来说都清楚除了在本文中特别加以描述的以外，在所附的权利要求范围内，本发明是能够实施的。参考文献(1)Takeshima，H.，Antiviral Agents.In The Search forBioactive Compounds from Microorganisms，Omura，S.，ed.，Springer-Verlag，N.Y.，N.Y.(1992)at page 50.(2)Watts，S.，et al.，(1983)Virology 125 at 127-138.(3)Ostrow，R.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 99-113.(4)Ostrow，R.，et al.，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 at1634-1638.(5)Manias，D.，et al.，(1989)Cancer Res.49 at 2514-2519.(6)Ostrow，R.，et al.，(1981)Virology，108 at 21-27.(7)Poindexter，N.，and Schlieverr，P.，(1985)J.of Infect.Dis.151 at 65-72.(8)Dowdy，S.，and Wearden，S.，Chi-Square Distributions InStatistics for Research，J.Wiley & Sons，Inc.，N.Y.，N.Y.(1983)at 97-124.(9)Latscha，R.，(1955)Biometrika 40 at 74-86.(10)Finney，D.J.，(1948)Biometrika 35 at 145-156.(11)Fisher，R.A.，Statistical Methods for Research Workers，14thed.，Hafner，N.Y.，N.Y.(1973).(12)Lidin，B.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 79-89.(13)Korba，B.E.and J.L.Gerin(1992)Antiviral Res.19，55-70.
权利要求
1.一种用于预防和治疗哺乳动物中病毒诱发肿瘤的防治组合物，它由药剂上可接受的载体和曲霉属发酵提取物或其衍生物组成。
2.权利要求1所述的防治组合物，其中曲霉属发酵提取物为黑曲霉发酵提取物。
3.权利要求2所述的防治组合物，其中黑曲霉发酵提取物为黑曲霉1.2 AN29发酵提取物。
4.权利要求2所述的防治组合物，其中黑曲霉发酵提取物为黑曲霉1.2 AN39发酵提取物。
5.曲霉属发酵提取物用于制造预防和治疗哺乳动物中病毒诱发的肿瘤的防治组合物。
6.权利要求5所述的用途，其中曲霉属发酵提取物用于制造预防和治疗的表面用的组合物。
7.一种用于制备预防和治疗哺乳动物中病毒诱发肿瘤的防治组合物的方法，该方法包括的步骤有在适当的培养基上培养曲霉属菌种，用水从培养基中提取细胞外的混合物，以便得到液体发酵提取物，过滤所得的液体发酵提取物，以去除其中的细胞生物质和孢子，由此便制成防治组合物。
8.权利要求7所述的方法，其中培养的步骤包括在适当的固体表面培养基上培养曲霉属菌种。
9.权利要求7所述的方法，还包括冷冻液体发酵提取物直至其使用的步骤。
10.权利要求7所述的方法，其中培养曲霉属菌种的步骤包括在适当的培养基上培养黑曲霉。
11.权利要求10所述的方法，其中黑曲霉为黑曲霉1.2 AN29。
12.权利要求10所述的方法，其中黑曲霉为黑曲霉1.2 AN39。
13.预防和治疗哺乳动物中病毒诱发肿瘤的方法包括给需要治疗的哺乳动物使用治疗有效量的防治组合物，该组合物包括曲霉属发酵提取物或其衍生物和药剂上可接受的载体。
14.权利要求13所述的方法，其中治疗有效量是在所需哺乳动物的体表，比如病毒诱发的肿瘤部位上表面用药。
15.权利要求13所述的方法，其中曲霉属发酵提取物为黑曲霉发酵提取物。
16.权利要求13所述的方法，其中黑曲霉发酵提取物为黑曲霉1.2 AN29发酵提取物。
17.权利要求13所述的方法，其中黑曲霉发酵提取物为黑曲霉1.2 AN39发酵提取物。
18.权利要求13所述的方法，其中病毒诱发的肿瘤为乳头状瘤病毒诱发的肿瘤。
19.一种黑曲霉1.2 AN29发酵提取物及其衍生物。
20.一种黑曲霉1.2 AN39发酵提取物及其衍生物。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗病毒诱发肿瘤的防治剂，特别是来源于曲霉属发酵提取物的组合物，及其应用、直接使用或制备成一种药剂来防治哺乳动物中病毒诱发的肿瘤。这些肿瘤包括乳头状瘤病毒诱发的肿瘤。该组合物是表面给药的。
文档编号C12R1/685GK1134671SQ94194047
公开日1996年10月30日 申请日期1994年9月16日 优先权日1993年9月27日
发明者E·W·博耶, R·L·查尔斯 申请人:索尔维酶有限公司