专利名称：一种治疗肿瘤的方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肿瘤的方法。
背景技术：
正常细胞的增殖是通过原致癌基因(proto-oncogene)与肿瘤抑制基因(tumor-suppressor)之间的平衡来控制的，前者促进细胞生长，后者抑制细胞生长。基因组的遗传变异，是由于那些控制细胞信号翻译的细胞分子发生了突变，例如增强了原致癌基因的表达或抑制了肿瘤抑制基因的表达，这样的遗传变异可以导致肿瘤的发生。已经证明，这些信号的翻译从根本上影响了细胞的生长和分化，而这些信号错误的翻译则导致肿瘤形成。
现在已经证明，原致癌基因Ras的遗传变异与30％的人类肿瘤有关(Wiessmuller，L.and Wittinghofer，F.(1994)，Cellular Signaling6(3)247-267；Barbacid，M.(1987)A Rev.Biochem.56，779-827)。Ras对某些人类肿瘤的发病机理起着重要的作用。Ras本身的活跃性突变可以在许多类型的人类肿瘤中检查到，如它的过量表达在胰腺癌中占80％，在结肠直肠癌中占40-50％，在肺癌中占15-24％，在甲状腺癌中占50％，在骨髓性白血病中占30％等(Millis，NE et al.(1995)Cancer Res.551444；Chaubert，P.et al.(1994)，Am.J.Path.144767；Bos，J.(1989)Cancer Res.494682)。Ras的活化可以通过有丝分裂的上游信号因子尤其是酪氨酸受体激酶(RTKs)来证实。这些上游因子如果增强或过度表达，最终会造成Ras的信号活性转变而导致Ras活性的提高。例如PDGF在某些肿瘤中的过量表达、c-erbB-2/neu在乳腺癌中的过量表达等，都会导致Ras活性的提高(Levitzki，A.(1994)Eur.J.Biochem.2261；James，P.W.，et al.(1994)Oncogene 93601；Bos，J.(1989)Cancer Res.494682)。
现有的肿瘤治疗方法包括手术、化疗和放疗。手术是治疗早期癌症的基本手段，但对许多肿瘤来讲，手术并不能将其完全切除。另外，肿瘤的转移性生长可能会阻止手术疗法对癌症的彻底治愈。化疗是指应用一些抗肿瘤的活性物质如烷基化合物、抗代谢物和抗肿瘤抗生素等治疗癌症。化疗的使用常常由于其严重的副作用而受到限制，如恶心呕吐、骨髓生长抑制、肾功能损伤及中枢神经损伤等。正常细胞在受到放射线处理后的自我修复能力强于肿瘤细胞，放疗法利用这一特点来治疗癌症。但是由于肿瘤周边组织的敏感性，放疗不能用于治疗多种肿瘤。另外，某些肿瘤已证实对放疗法有抗性，这取决于细胞内致癌基因和抗致癌基因的情况(Lee.J.M.et al.(1993)PNAS905742-5746；Lowe.S.W.et al.(1994)Science，266807-810；Raybaud-Diogene.H.et al.(1997)J.Clin.Oncology，15(3)1030-1038)。由于目前使用的治疗癌症的方法都存在一些缺欠，因此仍需要找到一种能适用于多种癌症的治疗方法。
发明内容
为克服现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种副作用小、适用于多种癌症的治疗方法。
本发明涉及一种使用呼肠孤病毒治疗肿瘤的方法。呼肠孤病毒用于治疗Ras信号传递系统中的一个成分(上游或下游)被活化的肿瘤，呼肠孤病毒可以导致肿瘤细胞溶解。呼肠孤病毒可以单次使用或多次使用；可用于治疗实体肿瘤或血液肿瘤。呼肠孤病毒的使用方法包括对实体肿瘤采用直接注射法，或对血液肿瘤采用静脉注射法。本发明提供了一种有效的肿瘤治疗方法，该方法没有其它肿瘤治疗方法带来的副作用。因为呼肠孤病毒已知与任何疾病无关联，所以关于该病毒的针对性使用是安全的。
具体实施例方式
本发明属于治疗人类肿瘤的方法，即通过呼肠孤病毒治疗肿瘤。呼肠孤病毒(reovirus)的名字是呼吸道肠道孤病毒的简称，顾名思义，该病毒存在于呼吸道和肠道中，并与目前已知任何疾病无关联(Sabin，A.B.(1959)，Science 130966)。哺乳动物呼肠孤病毒有三种类型类型1，又称Lang或T1L；类型2，又称Jones；类型3，又称Dearing，Abney或T3D。这三种类型可通过中和和抑制红血球凝聚素实验很容易的鉴别开来(Sabin，A.B.(1959)，Science 130966；Fields，B.N.et al.(1996)，Fundamental Virology，3rd Edition，Lippincott-Raven；Rosen，L.(1960)Am.J.Hyg.71242；Stanley，N.F.(1967)Br.Med.Bull.23150)。
尽管呼肠孤病毒与目前已知任何疾病并无关联，但随着年龄的增长，到成年时许多人体内都有这种病毒。例如，在小于5岁的儿童体内约占25％；在20-30岁的人群中约占50％(Jackson G.G.andMuldoon R.L.(1973)J.Infect.Dis.128811；Stanley N.F.(1974)InComparative Diagnosis of Viral Diseases，edited by E.Kurstak andK.Kurstak，385-421，Academic Press，New York)。
对哺乳动物呼肠孤病毒来说，其细胞表面识别信号是硅铝酸(Armstrong，G.D.et al.(1984)，Virology 13837；Gentsch，J.R.K.and Pacitti，A.F.(1985)，J.Virol.56356；Paul R.W.et al.(1989)Virology 172382-385)。由于硅铝酸在自然界中广泛存在，呼肠孤病毒能有效地与多种细胞系结合，因而可以针对多种不同组织器官。但是呼肠孤病毒对不同细胞系感染的敏感性却有很大不同。
申请人发现，一旦位于Ras信号传递系统中的某个基因被转化，细胞对抗呼肠孤病毒的感染则由抵抗型转变为接受型。对呼肠孤病毒感染的“抵抗型细胞”意味着病毒感染细胞后并没有导致病毒的生产及繁殖。而“接受型细胞”是指那些病毒感染细胞后引起细胞病变，病毒蛋白质合成，从而造成病毒生产并繁殖的细胞。细胞对呼肠孤病毒感染的抵抗发生在基因转译水平上而不是在转录早期，因为虽然病毒进行了转录，但病毒蛋白并没有表达。在抵抗型细胞内病毒基因的转录与一个大约65kDa的细胞蛋白的磷酸化有关。该蛋白被证实为双链RNA活化蛋白激酶(PKR)，在接受型细胞内没有观察到该蛋白磷酸化的现象。PKR的磷酸化阻止了病毒基因的转译。当使用PKR抑制剂氨基嘌呤抑制该磷酸化过程时，在未转化细胞内的病毒蛋白质合成水平得到大幅度增强。另外，在组合性严重免疫缺欠型小鼠(SCID)模型的左、右后腰肋植入肿瘤，向右侧肿瘤中直接注射呼肠孤病毒，可以明显缩小肿瘤的大小。同时观察到，左侧肿瘤虽没有直接注射抗呼肠孤病毒，其肿瘤的大小也明显缩小，这说明呼肠孤病毒的细胞溶解能力是系统的并不是局部的。
这些实验结果证明，呼肠孤病毒利用宿主细胞的Ras信号传递系统来抑制PKR，从而达到繁殖的目的。对未转化细胞(即呼肠孤病毒抵抗型细胞)和EGFR、Sos、或ras基因转化的细胞(即呼肠孤病毒接受型细胞)来讲，病毒的接合、内在化、去包膜及早期病毒基因转录都是正常进行的，但在未转化细胞中，早期转录过程中生成的二级结构激活了PKR的磷酸化，从而使其活化，导致了翻译启示因子elF-2-alpha的磷酸化，因此抑制了病毒基因的翻译。而在EGFR、Sos、或ras基因转化的细胞中，PKR的磷酸化过程被Ras或其下游的某个因子所抑制，因而容许病毒基因的翻译得以继续进行。Ras或其下游的某个因子所起的作用可以通过2-氨基嘌呤(2-AP)阻碍PKR的磷酸化来模拟，即在未转化细胞中加入2-氨基嘌呤(2-AP)可以促进病毒基因的翻译，从而增强呼肠孤病毒的感染作用。
基于上述发明，申请人发明了治疗人类肿瘤的新方法。本发明所述的方法，即使用呼肠孤病毒来治疗人类个体的肿瘤。所使用的人类呼肠孤病毒包括类型1，又称Lang或T1L；类型2，又称Jones；类型3，又称Dearing，Abney或T3D和其他类型。其首选对象是类型3，又称Dearing。也可以选择非人类哺乳动物呼肠孤病毒，如非人类灵长类中的狒狒呼肠孤病毒、马的呼肠孤病毒、犬类的呼肠孤病毒，也可以是非哺乳动物呼肠孤病毒，如鸟类呼肠孤病毒。也包括不同血清型或不同类型呼肠孤病毒之间的组合应用。由于呼肠孤病毒是自然存在的，它可以从自然界中分离出来，但不可以在实验室有意对其加以修饰。例如，呼肠孤病毒可以从病人身上分离纯化出来。如果需要的话，呼肠孤病毒可以用化学或生物化学方法加以预处理，如在使用以前用胰蛋白酶处理，这样的处理可以去掉病毒的外膜，因而得到更好的病毒感染效果。
所治疗的肿瘤可以是实体肿瘤，如肉瘤或癌症，也可以是血液系统肿瘤，如淋巴瘤或白血病。肿瘤是组织的非正常生长，通常形成明显的肿块，这是由于肿瘤细胞的生长速度明显快于正常组织的生长所致。与正常组织相比，肿瘤部分或全部缺失组织结构和功能协调性。这里提到的肿瘤，又可称为癌症，它包括了血液系统肿瘤和实体肿瘤。至少有些肿瘤细胞的Ras基因(或Ras信号传递系统中的某个成员)存在突变，造成Ras基因活跃。该过程或者是直接的，如由Ras基因的活跃性突变所造成；或者是间接的，如由Ras传递系统上游某个成员的活化所造成。传递系统上游某个成员的活化包括表皮生长因子受体(EGFR)或Sos。这里所说的“与Ras有关联的肿瘤”是指那些Ras基因活跃、Ras基因上游成员活跃，或Ras信号传递系统某一成员活跃的肿瘤。特别适合本发明提出的肿瘤治疗方法的肿瘤是胰腺癌，因为胰腺癌中普遍存在有Ras活跃现象。适合本治疗方法的其他肿瘤还包括乳腺癌、脑癌(神经胶质瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、膀胱癌和白血病。
呼肠孤病毒用于治疗肿瘤时通常使用合适的生理学载体，如磷酸盐缓冲液(PBS)。“用于治疗肿瘤”是指使呼肠孤病毒接触肿瘤细胞的使用方式。呼肠孤病毒的使用途径、配方或载体取决于肿瘤的位置和种类。概括起来，对于实体肿瘤，采用将呼肠孤病毒直接注射入瘤体的方式；对于血液系统肿瘤，则采用静脉注射法或血管内注射法。对那些不容易接近的体内肿瘤如转移了的肿瘤或脑癌，呼肠孤病毒可以通过哺乳动物体内系统传输的方式达到病灶，例如膜内、静脉或肌肉注射。另外，直接注射在单一实体肿瘤中的呼肠孤病毒也可以通过系统传输到达体内已转移的病灶。呼肠孤病毒也可以通过皮下注射、腹膜内注射、外用(针对皮肤癌)、口服(针对口腔或食道癌)、直肠给药(针对结肠直肠癌)、阴道给药(针对子宫癌或阴道癌)、鼻腔给药或吸入喷雾法给药(针对肺癌)等方式使用。
实施例实验一、细胞转染实验(cell transfection)为进一步证明活跃的Ras信号传递系统与呼肠孤病毒感染及杀死癌细胞的关系，我们选用了小鼠NIH-3T3细胞进行细胞转染实验，NIH-3T3细胞表面含有少量的表皮生长因子受体(EGFR)并对EGF不起促细胞分裂反应，不含有活跃的Ras信号传递系统，从而能抵抗呼肠孤病毒的感染。我们选择了H-Ras和R-Ras两种致癌基因进行细胞转染实验，使这两种基因在NIH-3T3细胞中表达。实验结果表明，Ras基因转染后的NIH-3T3细胞对呼肠孤病毒的感染由不敏感变为极其敏感，从而进一步证明Ras基因与呼肠孤病毒有直接的联系。
实验二、呼肠孤病毒对脑癌的作用将人神经胶质瘤细胞株glioblastoma U87异种移植于免疫缺陷型SCID小鼠一侧腰部皮下，由于该肿瘤细胞表面过度表达血小板衍生生长因子受体PDGFR，因此该肿瘤细胞具有活跃的Ras信号传递系统。约两周后，肿瘤长成约0.3cm3时，将1.0×107PFUs的活病毒直接注射于肿块内，10只小鼠为一组；对照组的10只小鼠则用同等数量的经紫外线灭活的病毒注射于肿块内，然后观察肿瘤的生长情况。结果显示，四周后活病毒注射组小鼠体内的肿块全部缩小或消失，而对照组中无一肿块消退现象。组织学检查发现原肿块处未发现肿瘤细胞，基质细胞完好无损。免疫荧光染色未发现原肿块周围的肌肉组织中含有病毒蛋白。结果证明该呼肠孤病毒选择性地杀死了移植于小鼠体内的人神经胶质瘤细胞，造成肿块缩小达80％以上，肿瘤杀死作用仅发生在肿块本身，对周围的正常细胞组织无影响。
实验三、该呼肠孤病毒对浅表性膀胱癌的作用膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，目前最普通及最有效的治疗手段为卡介苗(BCG)灌注法。BCG的副作用较大，可引起肾结核和全身感染。为了证明该呼肠孤病毒对浅表性膀胱癌的疗效，我们将大白鼠(Fisher CDF344)分为7组，每组10只，将人膀胱癌细胞(Ar-27)种植于膀胱内。14天后将该呼肠孤病毒(三个不同剂量)或BCG(三个不同剂量)灌入大鼠膀胱内，另一组则灌入生理盐水。灌注方式为每周两次，共三周。然后观察肿瘤的生长情况和大鼠的生存率。结果显示该呼肠孤病毒的疗效明显优于BCG的疗效。经BCG治疗后，大鼠要么死于BCG的毒副作用(高剂量组)，要么死于肿瘤的发展(低剂量组)。相反，经该呼肠孤病毒治疗的大鼠均长期存活。免疫学检查未发现正常组织中存有病毒蛋白。
权利要求
1.一种治疗肿瘤的方法，所述肿瘤是与Ras相关联的肿瘤，治疗方法是使用有效剂量的天然呼肠孤病毒施于肿瘤，导致与Ras相关联的肿瘤细胞溶解。
2.如权利要求1所述的方法，其中，呼肠孤病毒可以是人类呼肠孤病毒，包括I型呼肠孤病毒、II型呼肠孤病毒、III型呼肠孤病毒；也可以是非人类呼肠孤病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其中，可同时使用一种类型以上的呼肠孤病毒，或同时使用一种种类以上的呼肠孤病毒。
4.如权利要求1所述的方法，其中，呼肠孤病毒可以是使用前经过预处理的。
5.如权利要求1所述的方法，其中，肿瘤可以是实体肿瘤，也可以是血液系统肿瘤。
6.如权利要求5所述的方法，其中，呼肠孤病毒可以通过直接注射实体肿瘤的方式施于，也可以通过静脉注射或腹膜内注射的方式施于。
7.如权利要求1所述的方法，其中，肿瘤可以是脑癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、膀胱癌和白血病。
8.如权利要求1所述的方法，其中，呼肠孤病毒的有效剂量为103到1012PFUs之间。
9.如权利要求1所述的方法，其中，呼肠孤病毒可以施于一次或施于多次。
10.如权利要求1所述的方法，其中，呼肠孤病毒可以用于治疗人类体内的单一肿瘤，也可以是转移性肿瘤。
全文摘要
本发明涉及一种使用呼肠孤病毒治疗肿瘤的方法。呼肠孤病毒用于治疗Ras信号传递系统中的一个成分(上游或下游)被活化的肿瘤，呼肠孤病毒可以导致肿瘤细胞溶解。呼肠孤病毒可以单次使用或多次使用；可用于治疗实体肿瘤或血液肿瘤。呼肠孤病毒的使用方法包括对实体肿瘤采用直接注射法，或对血液肿瘤采用静脉注射法。本发明提供了一种有效的肿瘤治疗方法，该方法没有其它肿瘤治疗方法带来的副作用。因为呼肠孤病毒已知与任何疾病无关联，所以关于该病毒的针对性使用是安全的。
文档编号A61P35/00GK1531972SQ0312137
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者李宏实 申请人:李宏实, 毛金武