抗肿瘤药与mri造影剂共传递白蛋白纳米粒及其制备方法

抗肿瘤药与mri造影剂共传递白蛋白纳米粒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒及其制备方法，还提供一种包含MRI造影剂的白蛋白纳米粒载体，通过药物与载体间的静电吸附和配位作用，以及载体自身氨基酸残基的交联实现载药。本发明还公开了药物与造影剂共传递白蛋白纳米粒的最优制备工艺及其在肿瘤诊疗结合方面的作用。本发明的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，能够提高细胞对药物的摄取率，并减少耐药细胞对药物的外排，进而逆转耐药性，实现药物的高效传递；药物与造影剂共传递白蛋白纳米粒具备优秀的T1加权成像能力，为肿瘤的诊疗结合提供了一种有效手段。
【专利说明】
抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，以及包含该载体的MRI造影剂与药物组合物，属于药物载体技术领域。
【背景技术】
[0002]肿瘤的化学疗法在近半个世纪以来已取得很多重大成果，成为治疗肿瘤的方法之一，是常见肿瘤综合治疗中不可缺少的重要手段。然而治疗过程中伴随的毒副作用及多药耐药性极大地阻碍了化疗药物的临床应用。纳米药物传递系统可以通过规避或降低耐药肿瘤细胞的排外作用而实现耐药性的逆转。与其他载体材料相比，白蛋白(BSA)具有无毒、低抗原性、可生物降解等优点，并且其结构中的氨基酸残基提供了丰富的载药位点;此外，BSA化学结构会随PH变化发生可逆性改变，为pH响应性药物释放提供了可能。因此BSA可用于制备纳米药物传递系统，实现药物的安全高效传递。
[0003]肿瘤组织内氧供通常无法满足肿瘤细胞代谢需求，因此大部分肿瘤均处于缺氧微环境中。肿瘤的缺氧微环境对增强肿瘤侵袭性和耐药性有着不可忽略的重要作用。在缺氧状态下，肿瘤细胞内的缺氧诱导因子-1 (HIF-1)活化，与缺氧应答元件结合，进而促进包括多药耐药基因(MDR1)在内的下游基因的表达；同时，活化的HIF-1会促进细胞从有氧代谢向无氧代谢的转换，增加肿瘤微环境中的活性氧簇(R0S)，降低pH。因此，调节肿瘤缺氧微环境可以作为逆转肿瘤耐药性的一种手段。
[0004]在酸性环境中，二氧化锰(MnO2)能与过氧化物反应，在产生氧气的同时，被还原为锰离子。上述反应可用于调节肿瘤缺氧微环境，同时实现肿瘤微环境响应性MRI造影。MnO2弛豫效率(ri)低，无法用作MRI造影剂;被还原为锰离子后，其顺磁中心(锰离子)与水分子间距离减小，η增加，T1加权成像能力增加。锰是生理必需微量元素，安全无毒。因此，MnO2可用于替代目前临床上常用的钆类造影剂，用于肿瘤微环境响应性磁共振成像(MRI)造影。
[0005]综上，本发明拟利用BSA稳定MnO2胶体纳米粒，构建可实现肿瘤微环境响应性MRI造影的药物载体;并通过去溶剂化-化学交联法包载模型药物阿霉素(DOX)，制备抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒BMDN。本发明探讨了BSA对MnO2和DOX包载率对载体体系理化性质的影响，期待借助白蛋白纳米粒的特性高效传递药物，逆转耐药性，并在肿瘤细胞中实现响应性MRI造影。

【发明内容】

[0006]目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0007]技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，其特征在于:所述MRI造影剂为MnO2胶体纳米粒，抗肿瘤药为蒽环类抗癌药;是以白蛋白为载体骨架，通过静电相互作用及配位作用稳定MnO2胶体纳米粒，随后通过去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药，制成的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0008]所述抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒载药量为I% - 20.00 %，粒径为30 - 300 nm，表面电势为-50 - O mV。
[0009]作为优选方案，所述抗肿瘤药为阿霉素D0X。
[0010]上述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，如下:
以氧化还原法制备MnO2胶体纳米粒，随后将一定浓度的白蛋白BSA溶液与MnO2胶体纳米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮气保护，搅拌6 - 24小时，制得BSA-MnO2溶液；
BSA-MnO2溶液与抗肿瘤药以一定比例混合，搅拌状态下滴加无水乙醇，并加入交联剂，4 - 30 °C下搅拌6 - 24小时，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0011]具体包括以下步骤:
(I )BSA-Mn02溶液的制备:搅拌状态下，以恒定速率将Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮气保护在4 - 30 °C下反应1- 4小时，得MnO2胶体纳米粒溶液;搅拌状态下向MnO2胶体纳米粒溶液中滴入BSA溶液，氮气保护下4 - 30 °C反应6 - 24小时，以纯水透析纯化，得稳定的褐色胶体溶液，S卩BSA-MnO2溶液；
(2 )去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药:按照一定比例将抗肿瘤药溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，随后滴加一定体积的无水乙醇，4 - 30 °C搅拌10 - 60分钟后，加入交联剂，密封4 - 30 °C下搅拌6 - 24小时，减压蒸馏除去乙醇，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0012]作为优选方案，所述MnO2胶体纳米粒溶液由0.03- 0.3 mg/mL的Na2S2O3溶液和
0.08-0.8 mg/mL的KMnO4溶液按照体积比1:1 _ 10:1混合后反应制得。
[0013]作为优选方案，反应中，按照每毫克MnO2加入10 - 50 mg BSA的比例加入BSA溶液。
[0014]作为优选方案，所述抗肿瘤药的加入量为抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒载药量的1- 40 %。
[0015]按照无水乙醇:纯水体积比为1:1加入无水乙醇，交联剂使用量为每毫克BSA加入
0.07 - 0.40 yL质量浓度为25 %的戊二醛。
[0016]本发明还提供上述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒在制备诊疗肿瘤药物中的用途。
[0017]有益效果:本发明提供的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，与现有技术相比，具有以下优点:
(1)同时包载并传递抗癌药和MRI造影剂，并实现肿瘤微环境响应性造影及药物释放；能够实现对肿瘤的诊疗结合；
(2)通过多种途径逆转细胞的耐药性，包括通过白蛋白与细胞表面受体的相互作用提高药物的细胞摄取，规避耐药细胞的外排作用，及抑制肿瘤多药耐药基因的表达等；
(3)可以药物的pH响应性释放，并通过多种机制逆转肿瘤的耐药性，避免药物对于正常组织的毒性；
(4)使用安全无毒的锰作为造影剂:MnO2在提供造影剂的同时，还可以调节肿瘤缺氧微环境，从而进一步逆转肿瘤耐药性。
【附图说明】
[0018]图1是抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒BMDN的形态学表征；
图2是BMDN pH响应性释放药物表征图；
图3是BMDN对多药耐药细胞MCF-7/ADR耐药性的逆转；
图4A是BMDN在多药耐药细胞MCF-7/ADR中的摄取情况；
图4B是游离DOX在多药耐药细胞MCF-7/ADR中的摄取情况；
图5是BMDN抑制多药耐药细胞MCF-7/ADR药物外排的量化表征；
图6是BMDN对多药耐药细胞MCF-7/ADR耐药基因表达的影响；
图7是BMDN在多药耐药细胞MCF-7/ADR中的T1W权成像。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
[°02°] 一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，所述MRI造影剂为Μηθ2胶体纳米粒，抗肿瘤药为蒽环类抗癌药;是以白蛋白为载体骨架，通过静电相互作用及配位作用稳定MnO2胶体纳米粒，随后通过去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药，制成的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。以下实施例中，抗肿瘤药以阿霉素DOX为例，蒽环类抗癌药的化学结构和药理作用相似，不再一一列举。
[0021]所述抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒载药量为I% - 20.00 %，粒径为30 - 300 nm，表面电势为-50 - O mV。
[0022]上述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法如下:
以氧化还原法制备MnO2胶体纳米粒，随后将一定浓度的白蛋白BSA溶液与MnO2胶体纳米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮气保护，搅拌6 - 24小时，制得BSA-MnO2溶液；
BSA-MnO2溶液与抗肿瘤药以一定比例混合，搅拌状态下滴加无水乙醇，并加入交联剂，4 - 30 °C下搅拌6 - 24小时，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0023]具体包括以下步骤:
(I )BSA-Mn02溶液的制备:搅拌状态下，以恒定速率将Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮气保护在4 - 30 °C下反应1- 4小时，得MnO2胶体纳米粒溶液;搅拌状态下向MnO2胶体纳米粒溶液中滴入BSA溶液，氮气保护下4 - 30 °C反应6 - 24小时，以纯水透析纯化，得稳定的褐色胶体溶液，S卩BSA-MnO2溶液；
(2 )去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药:按照一定比例将抗肿瘤药溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，随后滴加一定体积的无水乙醇，4 - 30 °C搅拌10 - 60分钟后，加入交联剂，密封4 - 30 °C下搅拌6 - 24小时，减压蒸馏除去乙醇，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。
[0024]实施例1: BMDN的制备
配制0.3 mg/mL的Na2S2O3溶液和0.8 mg/mL的KMnO4溶液，在搅拌状态下以恒流栗将20mL Na2S2O3溶液滴入10 mL KMnO4溶液中，在氮气保护下，室温搅拌I小时。向反应液中滴加
7.5mL的BSA(25 mg/mL)，氮气保护下室温搅拌12小时。所得产物以纯水透析4次，每次半小时。
[0025]搅拌状态下按照理论载药量10 °M_D0X溶液(5 mg/mL)滴加到BSA-MnO2溶液中，随后立即将I倍体积的无水乙醇滴加到上述溶液中。搅拌15分钟后，向体系内加入0.25 %戊二醛，(每毫克BSA加入0.367此戊二醛)，将反应瓶密封，室温条件下继续搅拌12小时。减压蒸馏除去乙醇，以纯水透析4小时，所得产物即为BMDN ο使用高分辨率透射电镜观察BMDN的形态学特征，结果如图1所示。
[0026]实施例2:BMDN pH响应性释放药物
取1.5 mL BMDN溶液于透析袋中，扎紧袋口，浸没于盛有28.5 mL磷酸盐缓冲溶液(pH5.0或7.4)的锥形瓶中。随后将锥形瓶置于恒温摇床中，37 0C ,120 rpm震荡。在特定时间点取3 mL释放介质测定479 nm处的吸光度，并补充3 mL新鲜磷酸盐缓冲溶液。根据标准曲线计算释放介质中DOX的浓度，从而计算释放度并绘制释放曲线，结果如图2所示。
[0027]实施例3: BMDN对多药耐药细胞MCF-7/ADR耐药性的逆转
MCF-7/ADR细胞接96孔板，每孔I X 14个细胞，培养24小时。以不加血清的培养基配制不同浓度的BMDN溶液(D0X分别为I，5，10，20，40，50，60 yg/mL)，以同浓度的游离DOX作为对照组。接板24小时后，吸去培养基，向孔中加入配好的样品，每孔100此，每个样品设三个副孔。仅加入100此无血清培养基的细胞作为空白对照。继续培养24小时后，避光条件下向孔中加入20 yL MTT，放入恒温摇床，37 0C , 100 rpm继续培养4小时。取出细胞板，吸走培养基，每孔加入150 yL DMS0，以恒温摇床摇晃10分钟后，放入全波长酶标读数仪测定各孔在560 nm处的吸光度，计算细胞生存率。结果如图3所示。
[0028]实施例4: BMDN促进多药耐药细胞MCF-7/ADR药物摄取
MCF-7/ADR细胞接共聚焦皿，细胞数量为I X 15个，培养24小时。吸走培养基，每皿加Al mL含有BMDN(D0X的浓度为60 yg/mL)的无血清培养基，分别培养2，4，8，12小时，同浓度的游离DOX用作对照组。随后将培养基吸走，用PBS清洗细胞3次，按照试剂盒说明书用LysoTracker Green给细胞的溶酶体染色I小时；用I3BS清洗细胞3次后，以I mL 4 %多聚甲醛处理20分钟，吸走，用PBS清洗细胞I次；按照试剂盒说明书用DAPI给细胞核染色20分钟；用I3BS清洗3次，随后以50 %(v/v)的甘油缓冲液浸润样品，用激光共聚焦显微镜拍照，BMDN和游离DOX在细胞中的摄取情况分别如图4A和图4B所示。
[0029]实施例5: BMDN抑制多药耐药细胞MCF-7/ADR药物外排
MCF-7/ADR细胞接12孔板，每孔I X 15个细胞，培养24小时。吸走培养基，每孔加入ImL含BMDN(D0X浓度为20 yg/mL)的无血清培养基，以同浓度的游离DOX作对照组，培养4小时后，换新鲜的不含血清的培养基继续培养I，2，4小时，各外排时间设2个副孔。收集细胞于
1.5mL EP管中，以流式细胞仪检测经过不同时间外排后细胞中DOX的荧光强度，计算药物在细胞中的蓄积量，结果如图5所示。
[0030]实施例6:BMDN对多药耐药细胞MCF-7/ADR耐药基因表达的影响
MCF-7/ADR细胞接6孔板，每孔3 X 15个细胞，培养24小时。吸走培养基，加入I mL含有BMDN(D0X浓度为20 yg/mL)的无血清培养基，以同浓度的游离DOX溶液及BSA-MnO2溶液作为对照组，仅以无血清培养基处理的细胞作为空白对照组，每组设2个副孔。给药后细胞于三气培养箱培养24小时。随后按照蛋白印迹法操作，定性半定量研究BMDN对MCF-7/ADR细胞中HIF-1a及MDRl表达量的影响，结果如图6所示。[0031 ] 实施例7: BMDN在多药耐药细胞MCF-7/ADR中的T1加权成像能力
将细胞接种在6孔板，每孔3 X 15个细胞，培养24 h后，分别加入含有不同浓度BMDN的培养基培养4小时。以PBS将细胞表面纳米粒洗掉之后，消化并收集细胞，将细转移到EP管内进行MRI，T1W权成像结果如图7所示。
[0032]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，其特征在于:所述MRI造影剂为MnO2胶体纳米粒，抗肿瘤药为蒽环类抗癌药;是以白蛋白为载体骨架，通过静电相互作用及配位作用稳定MnO2胶体纳米粒，随后通过去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药，制成的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，其特征在于:所述抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒载药量为1.00 % - 20.00 %，粒径为30 -.300 nm，表面电势为-50 - O mV。3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒，其特征在于:所述抗肿瘤药为阿霉素D0X。4.根据权利要求1- 3任一项所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，如下: 以氧化还原法制备Μηθ2胶体纳米粒，随后将一定浓度的白蛋白BSA溶液与Μηθ2胶体纳米粒溶液混合，4 - 30 °(:下通入氮气保护，搅拌6 - 24小时，制得BSA-MnO2溶液； BSA-MnO2溶液与抗肿瘤药以一定比例混合，搅拌状态下滴加无水乙醇，并加入交联剂，4-30 °C下搅拌6 - 24小时，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤: (I )BSA-Mn02溶液的制备:搅拌状态下，以恒定速率将Na2S2O3溶液滴入KMnO4溶液中，氮气保护在4 - 30 °C下反应1- 4小时，得MnO2胶体纳米粒溶液;搅拌状态下向MnO2胶体纳米粒溶液中滴入BSA溶液，氮气保护下4 - 30 °C反应6 - 24小时，以纯水透析纯化，得稳定的褐色胶体溶液，S卩BSA-MnO2溶液； (2)去溶剂化-化学交联法包载抗肿瘤药:按照一定比例将抗肿瘤药溶液滴加到BSA-MnO2溶液中，随后滴加一定体积的无水乙醇，4 - 30 °C搅拌10 - 60分钟后，加入交联剂，密封4 - 30 °C条件下搅拌6 - 24小时，减压蒸馏除去乙醇，透析纯化后即得抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒。6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于:所述Μηθ2胶体纳米粒溶液由0.03 - 0.3 mg/mL的Na2S203溶液和0.08 - 0.8 mg/mL的KMnO4溶液按照体积比1:1 - 10:1混合后反应制得。7.根据权利要求5所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于:反应中，按照每毫克MnO2加入10 - 50 mg BSA的比例加入BSA溶液。8.根据权利要求5所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于:所述抗肿瘤药的加入量为抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒载药量的1-.40 %。9.根据权利要求1所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于:按照无水乙醇:纯水体积比为1:1加入无水乙醇，交联剂使用量为每毫克BSA加入.0.07 - 0.40 yL质量浓度为25 %的戊二醛。10.根据权利要求1-3任一项所述的抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒在制备诊疗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】A61K47/48GK105879045SQ201610228149
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】姜虎林, 张美 , 邢磊
【申请人】中国药科大学