在磁共振成像中用作造影剂的纳米粒子的制作方法

专利名称：在磁共振成像中用作造影剂的纳米粒子的制作方法
在磁共振成像中用作造影剂的纳米粒子
本发明涉及纳米粒子(nanoscale particle)及其制备方法，所述纳米粒子 由以下组成具有惰性基质的核； 一种或多种共价鍵合的有机配合刑，其 中鍵合有一种或多种具有未成对电子的金属离子；及任选的一种或多种共 ^j^t合于所述，核表面的生物分子'
由于其最优的信号转导作用(因7个未成对电子而具有强顺磁性，Tl 缩短)，故釓(Gd)被用于MRI(磁共振成像).由于7个未成对电子对，轧可 诱导强电磁交变场，其影响相邻水质子自旋的方式使得它们的驰豫时间缩短.
静脉内施用轧盐溶液具有急性毒性作用.该毒性作用尤其影响平滑肌 和橫B、线粒体功能及凝血，因此，已经尝试去寻找降低这种金属的毒 性而不损害其顺磁性能即迁至磁场的趋势的方法。达到这个目标的最佳方 法是螯合，其已导致含4Uit影刑的工业化生产，
为此，使用配合物形成常数非常高的配合剂.这些配合剂的实例为 DOTA和DTPA,
DOTA DTPA 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸 二亚乙基三胺五乙酸
迄今最穗定的市售钆螯合配合物是大环钆特酸(gadoteric acid)(Gd-DOTA;市售可得，例如Guerbet的DOTAREM ). ^J1札特酸 作为MRI造影刑时，解离且由此释放毒性钆离子(LD邻约O.lmniol kg")的 风险非常低.与在酸性胃液中释放半衰期穗定性(在标准化模型0.1摩尔
4
HC1溶液中测定)的范围从几秒至几小时的其他配合物相比，本文的钆特酸 的半衰期超过一个月。钆与内源性金属离子如铜或锌的交换也显著低于 1%，而在其他配合物中可高达35%。
钆完全被有机酸DOTA包围，且位于螯合分子的中心，如同在洞穴中， 如X-射线晶体研究所示。因此，钆的毒性几乎被完全掩盖，而使它可用作 MRI造影剂的顺磁性能得以保留。
MRI中造影剂的使用能增加器官显示的信息价值。正常情况下，静脉 内注射10至15ml(0.2ml/Kg体重)的造影剂。所用含钆造影剂导致驰豫时 间缩短，由此导致所生成影像中的信号增强。
基于过渡元素锰、铁或铜的造影剂仅用于特定问题的情形，特别是涉 及到肝的情形。
顺磁性配合物如钆特酸具有亲水性，故不能通过血脑屏障。其静脉内 注射后，发生迅速血管分布，继而间质分布；未观察到对于某种器官的优 选性。所述配合物在几小时内借助肾小球过滤以原形经由肾脏排泄。钆特 酸在3小时后被清除75%。所述药代动力学使Gd成为造影剂，其尤其适 用于诊断发生在肿瘤、水肿、坏死和缺血情况下的细胞外液的运动。
Gd-DOTA的耐受性非常好。因此，两项超过5000例患者的研究已经 显示副作用发生率在0.84%-0.97%之间。两项研究中较大型的那项研究 (CailK 1991)中，4169例患者只有8例出现恶心，5例出现呕吐，这些副作 用的总发生率为0.31%。在所有患者的不到0.15%中，出现发热、头痛、 不适感、皮疹及口腔气味不良。就钆特酸而言，系统性渗透作用也可忽略。 Gd-DOTA浓度明显增加的唯一器官是肾脏，这可能归因于药代动力学。 然而，对肌酐清除率少于60ml/min的肾功能不全患者的耐受性研究显示 Gd-DOTA对重要参数或肾功能绝对没有副作用。与Gd-DOTA-BMA相比 较，Gd-DOTA没有引起假低钙血症。对肾功能不全患者的建议监测+采 取所有措施预防肾功能不全(水化、剂量限制、风险/利益评估)。由于所有 这些原因，钆特酸,皮批准作为MRI造影剂不仅用于成年人，而且用于儿童 和嬰儿。
含钆(III)的纳米粒子为公众所知已有几年，其较单独配合的钆(III)离子 具有优势，这在作为诊断造影剂的应用中非常重要
一与单独钆配合物相比，多个配合的釓(III)离子堆积在球表面，在磁 共振成像中产生显著更强的信号。这使得能够降低造影剂的剂量，或者通 过提高信噪比以相同剂量获得更强的信号。
C. Platas画lglesias等人，Chem. Eur. J. 2002， 8， No.22， 5121-5131 "具有 很高驰豫性的沸石GdNaY纳米粒子用作磁共振成像造影剂"公开了加载 Gd"的沸石NaY纳米粒子，其中钆仅通过库仑力键合，即非共价键合。由 于该Y沸石的孔径只有1 ，3nm ，强烈地阻碍了自由质子与周围组织的交换。
WO 00/30688(Bracco)描述了取代的聚羧酸类配体分子和相应的金属 配合物，如Gd-DTPA和Gd-DOTA衍生物，用作MRI的造影剂。
WO 2004/009134(Bracco)描述了作为MRI造影剂的钆螯合配合物，其被细胞所包围。
WO 96/09840(Nycomed)描述了包含粒状材料的诊断剂，其粒子包含具 有诊断活性、基本上水不溶性的金属氧化物(氧化铁)的结晶材料，和聚离 子性包衣剂(如壳聚糖、透明质酸、软骨素)。
WO 04/083902(Georgia Tech Research Corp.)描述了磁性纳米粒子(如 钆螯合物)，其具有生物相容性包衣(如磷脂-聚乙二醇)，可携带生物分子如 核酸、抗体等。
WO 03/082105(Barnes Jewish Hospital)描述了 Gd-DTPA-PE和 Gd-GTPA-BOA螯合配合物，其被脂质/表面活性剂包衣所包围。 本发明的目的是制备能避免上述化合物缺点的新型造影剂。 令人惊讶的是，通过使用高纯度二氧化硅作为共价键合的锎系配合物 (优选钆配合物)的载体，已经实现上述目的。二氧化硅在患者体内具有极 其良好的耐受性，因此远远优于其他很多现有技术中的材料。这方面的实 例尤其参见以下文献Jain， T.K.; Roy， I.; Dee， T.K.; Maitra， A,N.，J Am。Chem.Soc.1998， 120， 11092-11095、 Shimada， M.; Shoji， N，; Takahashi,A.,Anticancer Res. 1995， 15， 109-115和Lal， M.; Levy, L.; Kim， K.S.; He， G.S.
Wang, X.; Min， Y.H.; Pakatchi， S.; Prasad, P.N.， C7^附.2000， 12， 2632-2639。
因此，本发明涉及納米粒子，其由以下组成具有惰性基质的核；一 种或多种共价键合的有机配合剂，其中键合有具有未成对电子的金属离子； 及任选的一种或多种共价键合于所述核表面的生物分子。
此外，本发明涉及纳米粒子，其由以下组成具有惰性基质的核；任 选的一种或多种共价键合于所述核表面的生物分子；及一种或多种有机配 合剂，其经由连接体共价键合于所述核表面，且其中键合有具有未成对电 子的金属离子。
具有惰性基质的核或栽体优选由二氧化硅、二氧化钛、氧化铝或二氧 化锆组成。特别优选二氧化硅。单分散二氧化硅粒子通过已知方法(参见 EP 0216278)、经水解四烷氧硅烷而制备。此处单分散粒子的平均粒径为 10至500nm、优选30至300nm。然而，原则上，也可使用聚合物如聚苯 乙烯晶格(lattices)。
此外，在第一步骤中可能用二氧化硅薄层包衣其他纳米粒子。可能通 过本领域技术人员已知的溶胶-凝胶方法、以简单的方式进行包衣。为此， 将纳米粒子悬浮于乙醇/水溶液中，加入硅酸酯如原硅酸四乙酯(TEOS)。 硅酸酯的水解通过加入氨水溶液启动，如果必要，在升高的温度进行。沉 淀的二氧化硅优选沉积在悬浮液中的纳米粒子上。根据待包衣纳米粒子的 已知量和已知平均直径，通过所用硅酸酯的量可非常精确地调整层的厚度。
通过以粒子直径>约50nm超滤或离心，可分离或纯化经包衣的纳米粒子。
所用金属离子优选镧系元素的顺磁性离子。特别优选使用钆(m)离子。
所用有机配合剂优选为低聚羧酸或聚羧酸(polycarboxylate)类化合物。 特别优选^f吏用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或1，4，7，10-四氮杂环十二烷 -1，4，7，10-四乙酸(DOTA)。
金属螯合配合物经由连接体、优选经由硅烷共价键合于载体表面。优 选的连接体为3-氨基-丙基三乙氧基硅烷(APTES)。
经由铜催化的叠氮化物(azidene)和炔经的偶极1，3-环加成反应即所谓 的Huisgen反应制备金属螯合配合物是特别有利的。本领域技术人员已知 的这种反应在非常温和的条件下、以优异产率生成稳定的1，2，3-三唑，并以 简单的方式使非常复杂分子的合成变得容易。因此，最近该反应以术语"点 击化学(Click chemistry)"已经再次吸引人们越来越多的兴趣，这反映在大 量的出版物中(参见BrSse等人，Angew. Chem. 2005， 117， 5336; Kolb， Finn 和Sharpless, Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021)。
令人惊讶的是，已经发现上述Huisgen反应也可有利地用于纳米粒 子表面的功能化。这意味着"点击化学"也可用于纳米粒子上的非均相固 相反应。
因此，本发明进一步涉及制备纳米粒子的方法，该方法包括以下方法 步骤
a) 通过湿法化学(wet-chemical)方法制备纳米粒子，优选由二氧化 硅、二氧化钛、氧化铝和/或二氧化锆制备，
b) 用闺代硅烷的单分子层包衣所述纳米粒子，
c) 使所述纳米粒子与含叠氮基团的试剂反应，得到被叠氮基团功能 化的纳米粒子，
d) 制备一种或多种有机配合剂，其含有一种或多种胺和一种或多种 聚羧酸、聚羧酸酐、聚碳酰氯或聚羧酸酯，
e) 用来自镧系的金属离子加载一种或多种配合剂，
f) 使步骤c)的经叠氮基团功能化的纳米粒子与步骤e)的加载有金 属离子的有机配合剂反应。
所用卣代硅烷优选例如3-氯丙基-三乙氧基硅烷。
所用炔胺可以是所有已知的炔胺，优选使用炔丙胺或6-氨基-l-己炔。 使其与适合于配合物形成的聚羧酸、聚羧酸酐、聚碳酰氯或含有良好离去 基团的聚羧酸酯反应。曱酰胺由已知的方法合成。
作为聚羧酸， -使DOTA和DTPA或其4汙生物(例如Li盐)优选与相应
的胺反应。应确保在反应期间，聚羧酸的仅一个羧酸功能团与胺反应(l:l 批)。例如，DTPA二酐与炔丙胺的反应通过已知的Schotten-Baumann方 法进行。
生物分子如酶、肽/蛋白质、受体配体或抗体，可另外共价键合于纳米 粒子。其特异性偶联于患者体内的靶组织使成像和随后的诊断简单化。 纳米粒子可进一步用葡聚糖或聚乙二醇包衣以提高生物相容性。
本发明进一 步涉及纳米粒子作为磁共振成像造影剂的用途。根据本发 明的粒子可用作磁共振成像的造影剂，因为排列在表面上的金属离子能够 与周围的质子如组织液的质子相互作用。
以下实施例用来更详细地解释而非本发明。
实施例1
表面键合有Gd(m)、平均粒径为250nm的单分散二氧化硅粒子的制备 1.1制备单分散二氧化硅粒子
如EP 0216278 Bl所述、通过在水/乙醇/氨介质中水解四烷氧基硅烷制 备单分散二氧化硅粒子，其中首先制备原始粒子的溶胶，随后通过连续计 量加入四烷氧基硅烷以控制反应程度，使所得Si02粒子达到所需粒子大 小。
1.2用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)功能化
将在第一步骤中制得的10g二氧化硅粒子悬浮于20ml2-丙醇中。随后 滴加用5ml 2-丙醇稀释的0.25ml APTES，将混合物用回流冷凝器在80°C 搅拌2小时。
借助离心4几以4000min"将悬浮液用2-丙醇洗涤8次，直至借助茚三 酮的点滴试验在洗液中检测不到APTES。
1.3用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)形成酰胺
将25ml 二甲基亚砜(DMSO)加至在第二步骤中用APTES功能化的二 氧化硅粒子，将2-丙醇在旋转蒸发仪中真空蒸出。随后将0.58g二亚乙基 三胺五乙酸二酐(DTPA-ca)加至该悬浮液中，将混合物在150。C搅拌2小时。
冷却至室温后，将反应产物倾至200ml 0.1NTRIS緩沖液(pH7.0)，用去离 子水在离心机中洗涤多次。
1.4加载釓(m)离子
将o.486g无水氯化钆(m)加至在第三步骤中得到的悬浮液，将混合物
在室温搅拌8小时。随后利用离心机、用去离子水洗涤该悬浮液，直至借 助硝酸银溶液在水洗液中检测不到氯化物。然后将反应产物冷冻干燥。 表征
将经干燥的加载钆的二氧化硅粒子溶解于稀氢氟酸中，通过ICP-MS 检测钆含量。在样品中发现0.13%的钆。
将二氧化硅粒子样品再次用去离子水充分洗涤(3x)，干燥后，通过 ICP-MS重新分析。检测到钆含量为0.14%。略微较高的钆含量可以解释 为干燥的程度不同或检测方法的局限性。然而，关键的因素是重复洗涤 二氧化硅粒子并没有减少钆的含量，即显然钆非常坚固地共价键合于无孔 二氧化硅粒子的表面。用1N盐酸处理的情况下也获得了相同的结果。
实施例2
表面键合有Gd(m)、平均粒径为90nm的单分散二氧化硅粒子的制备 1.1粒子的制备
如EP 0216278 Bl的实施例4所述。 1.2粒子的功能化
将在第一步骤中制得的10g二氧化硅粒子悬浮于20ml2-丙醇中。随后 滴加用5ml 2-丙醇稀释的0.50ml APTES，将混合物用回流冷凝器在80。C 搅拌2小时。
借助离心4几以4000min"将悬浮液用2-丙醇洗涤8次，直至借助茚三 酮的点滴试验在洗液中检测不到APTES。
1.3用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)形成酰胺
将25ml 二甲基亚砜(DMSO)加至在第二步骤中用APTES功能化的二 氧化硅粒子，将2-丙醇在旋转蒸发仪中真空蒸出。随后将1.0g二亚乙基三
胺五乙酸二酐(DTPA-ca)加至该悬浮液中，将混合物在150。C搅拌2小时。 冷却至室温后，将反应产物倾至200ml0.1NTRIS緩冲液(pH7.0)，用去离 子水在离心机中洗涤多次。
1.4加载釓(m)离子
将i.og无水氯化轧(m)加至在第三步骤中得到的悬浮液，将混合物在
室温搅拌8小时。随后利用离心机、用去离子水洗涤该悬浮液，直至借助
硝酸银溶液在水洗液中检测不到氯化物。然后将反应产物冷冻干燥。
表征
将经干燥的加载钆的二氧化硅粒子溶解于稀氢氟酸中，通过ICP-MS 检测釓含量。
在样品中发现0.2%的札。与实施例1制备的粒子相比较，较高的钆含 量可以解释为较小的粒子具有较高的表面积/容积比。经计算，约1200 个钆离子加载于一个卯nm粒子的表面。
实施例3
表面键合有Gd(m)、平均粒径为250nm的单分散二氧化硅粒子的制备 3.1制备二氧化硅纳米粒子
在室温将16.7ml原硅酸四乙酯加至41.5ml软化水与lllml乙醇的混 合物中，通过搅拌制备均相溶液。随后加入26ml 25%重量的氨溶液，将 混合物再剧烈搅拌15秒，然后静置1小时。加入氨溶液后约1分钟，从溶 液的混浊可》见察到连续缩合得到二氧化硅纳米粒子。该反应混合物不经处 理，而是直接用于下一反应步骤。
3.2与卣代硅烷反应
将在第一步骤中制得的纳米粒子用卣代硅烷的单分子层包衣。为此， 将80]nl 3-氯丙基-四乙氧基硅烷加至第一步骤的反应混合物中，将该混合物 在8(TC搅拌5小时。随后离心出粒子，用软化水洗涤直至中性。
3.3制备表面键合的叠氮化物
将在第二步骤中制得且经洗涤的纳米粒子悬浮于50ml软化水中，加
入66mg叠氮化钠，将该混合物在5(TC搅拌24小时。卣素氯通过亲核取代 被拟卣素叠氮基所替代。在离心机中从起始材料分离含叠氮基的納米粒子， 用软化水洗涤，以水性悬浮液保存。
3.4通过DTPA 二酐与炔丙胺的反应(Scho"en Baumann方法)制备炔 烃(聚羧酸单炔酰胺)
将0.19g(lmmo1) 1-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC)(Aldrich) 、 0.15g(1.5mmol)三乙胺(Merck)和2ml 二甲基甲酰胺 (Merck)加至0.Wg(lmmol)二亚乙基三胺-l/7-四(乙酸叔丁基酯)-4-乙酸 (Macrocyclics公司的Article B-365)。在室温剧烈搅拌10分钟后，加入 0.06g(lmmol)炔丙胺。
将该反应混合物在室温再搅拌8小时。通过薄层色语法监测反应。将 反应混合物加至10ml 二氯甲烷中，用20ml 0.1摩尔盐酸振摇洗涤3次， 再用20ml饱和NaHC03水溶液洗涤3次。最后将混合物用饱和氯化钠水 溶液振摇洗涂，用无7jC琉酸钠千燥。在旋转蒸发仪中蒸出二氯曱烷，将油 状残渣加至4ml四氢呋喃/乙醇(容积比l:l)中。将lml水和0.1g(4.4mmo1) 氢氧化锂加至该混合物中，以裂除酯保护基团。将水解混合物搅拌过夜， 在旋转蒸发仪中蒸发至干。将反应产物加至10ml水中，用l摩尔盐酸调 整pH至7。
3.5用札(m)离子加载配合剂
将10ml 0.1摩尔氯化轧(m)溶液(-lmmol)加至笫四步骤制得的二亚乙 基三胺五乙酸4-炔丙酰胺的锂盐溶液中，将混合物搅拌30分钟。
3.6制备用配合剂分子修饰的纳米粒子(Huisgen反应)
借助TRIS緩冲液将第三步骤制得的、用叠氮基功能化的纳米粒子悬 浮液调整至中性pH。将预先计算量的聚羧酸单炔酰胺(由第五步骤)滴加至 含有50mg氯化铜(I)的纳米粒子悬浮液中。在室温搅拌16小时后，将反 应终止。离心出粒子，用0.1摩尔盐酸剧烈洗涤3次，最后用软化水洗涤。
借助ICP-MS检测粒子的钆含量为0.3%。
权利要求
1、纳米粒子，其由以下组成-具有惰性基质的核，-一种或多种共价键合的有机配合剂，其中键合有一种或多种具有未成对电子的金属离子，和-任选的一种或多种共价键合于所述核表面的生物分子。
2、 纳米粒子，其由以下组成 -具有惰性基质的核，-任选的一种或多种共价键合于所述核表面的生物分子，和 -一种或多种有机配合剂，其经由连接体共价键合于所述核表面，且其中 键合有具有未成对电子的金属离子。
3、 根据权利要求1和/或2的纳米粒子，其特征在于所述核由二氧 化硅、二氧化钛、氧化铝和/或二氧化锆组成。
4、 根据权利要求3的纳米粒子，其特征在于所述核由二氧化硅组成。
5、 根据权利要求l至4的一项或多项的纳米粒子，其特征在于它们 平均粒径为10-500nm、优选30-300nm且为单分散粒子。
6、 根据权利要求1至5的一项或多项的纳米粒子，其特征在于所述 金属离子选自镧系元素。
7、 根据权利要求l至6的一项或多项的納米粒子，其特征在于所述金属离子为轧(m)离子。
8、 根据^5l利要求l至7的一项或多项的納米粒子，其特征在于所述 有机配合剂选自低聚羧酸或聚羧酸类。
9、 根据权利要求8的纳米粒子，其特征在于所述有机配合剂为二亚 乙基三胺五乙酸(DTPA)或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸 (DOTA)。
10、 根据权利要求l至9的一项或多项的纳米粒子，其特征在于所 用共价键合的生物分子为酶、肽/蛋白质、受体配体或抗体。
11、 根据权利要求2的纳米粒子，其特征在于所用连接体为硅烷。
12、 根据权利要求ll的纳米粒子，其特征在于所用连接体为3-氨基 丙基三乙氧基珪烷(APTES)。
13、 制备纳米粒子的方法，其包括以下方法步骤a) 通过湿法化学方法制备纳米粒子，优选由二氧化硅、二氧化钬、氧化铝和/或二氧化锆制备， b )用卣代^:烷的单分子层包衣所述纳米粒子，c) 使所述纳米粒子与含叠氮基团的试剂反应，以获得用叠氮基团功 能化的纳米粒子，d) 制备一种或多种有机配合剂，其含有一种或多种胺和一种或多种 聚羧酸、聚羧酸酐、聚碳酰氯或聚羧酸酯，e) 用来自镧系的金属离子加载一种或多种配合剂，f) 使步骤c)的用叠氮基团功能化的纳米粒子与步骤e)的加载有金属离子的 一种或多种有机配合剂反应。
14、 根据权利要求13的方法，其特征在于在步骤d)中由有机配合 剂如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)或二亚乙基三胺五 乙酸(DTP A)或其衍生物和相应的炔胺制备聚羧酸单炔酰胺。
15、 根据权利要求13和/或14的方法，其特征在于步骤d)中所用的 炔胺为炔丙胺或6-氨基-l-己炔。
16、 根据权利要求13至15的一项或多项的方法，其特征在于步骤e)中所用的金属离子为钆(m)离子。
17、 根据权利要求1至12的一项或多项的纳米粒子作为磁共振成像造 影剂的用途。
全文摘要
本发明涉及磁共振成像中用作造影剂的纳米粒子。所述纳米粒子由以下组成具有惰性基质的核；一种或数种共价键合的有机配合剂，其中键合有一种或多种具有未成对电子的金属离子；及一种或多种任选的共价键合于所述核表面的生物分子。本发明还公开了制备所述纳米粒子的方法。
文档编号A61K49/18GK101340900SQ200680041311
公开日2009年1月7日 申请日期2006年10月17日 优先权日2005年11月10日
发明者A·库贝尔贝克, H·施尔克 申请人:默克专利有限公司