专利名称：：抗菌素10381v，w，x，y，z1，z2，pre-b和t的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，Pre-b和t，它们是从微生物Streptomycesarginensis发酵啤酒的粗提取物中分离出来的。三种含硫多肽抗菌素，硫霉素I，II和III的分离，纯制，物理化学及生物学特性见下列文献所述J.Antibiotics，22(1)12—22(1969)，TetrahedronLett.，29(12)1401—4(1988)。该文中公开了改良的多肽抗菌素硫霉素I的结构。同时也提出了结构相关的抗菌素berninamycinA的结构修正。TetrahedronLett.，(31)2791—4(1978)中公开了硫霉素I的甲醇解产物。TetrahedronLett.，(9)735—6(1977)中公开了硫霉素I的酸性水解产品。化学文摘(ChemicalAbstracts)73(1)2666c(日本专利45006880)公开了经StreptomycesVirdochromogenesVarSulfomycini培养物来制备硫霉素I的方法。美国专利4,007,090中公开并要求了新颖的，通过微生物烬灰绿色链霉菌发酵制备硫霉素I的方法。ChemicalAbstracts73(17)86558e(JapanesePatent45017588)中公开了经培养StreptomycesViridochromogenesVarSufomycini来制备硫霉素II和III的方法，它们的紫外吸收和抗菌谱与硫霉素I的相似。J.Antibiotics，45(11)1809—1811(1992)及欧洲专利申请0274873(1988年7月20日出版)公开了A10255，一种硫肽抗菌复合物，它含有一个环肽核及氨基酸侧链。J.Antibiotics，42(10)1465—9(1089)中公开了噻噁霉素、一种肽类抗菌素的分离及特性。1988年1月14日出版的InternationalPublicationNlumberWO88/00200中描述了10381b抗菌复合物的制备和性质。根据此文献，10381b抗菌复合物是经用营养培养基中微生物Streptormycesarginensis而发酵制得的，该文献还进一步阐述了在10381b复合物中含有一组至少包括有5种主要对抗革兰氏阳性菌的抗菌素，并且它们与所报告过的硫霉素族抗菌素有着相类似的物理特性。10381b复合物中的主要成份称作10381b2和10381b3。在这两种成份中，已将10381b2分离出来，其获得的量及纯度足够用以确定其生物活性和化学特性。10381b2的结构被设想与来自绿色产色链霉菌的肽类抗菌素硫霉素I是相同的，这点已得到证实。10381b抗菌复合物具有对抗革兰氏阳性菌的抗菌活性，因而它们可用于保障供食用动物的生长，如家禽，猪和牛。然而该文献未讲授或公开分离和鉴定10381b抗菌复合物中其它组份的方法，特别是本发明中的抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2pre—b及t。在InternationalPublicationNumberWO86/05785(1986年10月9日)以及A.D.Argoudelis等，TheJournalofAntibiotics，XL(6)750—760(1987年6月)文献上描述了Arginomycin(抗菌素10381a1)的生产方法和性质。专利申请者未看到过在此领域里的参考文献能或提出本发明的抗菌素1038IV，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b和t。本发明具体提供了式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它们的药理学上可接受的盐；饲料组合物，它包括动物饲料和式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX，或它们间的任何组合；动物用复合剂，它包括式I，II，III，IV，V-，VI，VII，或IX，或它们间的任何组合，以及合适的惰性载体；以及促进动物生长的方法，它包括给动物服用有效剂量的式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它们间的任何组合。测定，分离和鉴别这些抗菌素是困难和意想不到的，需要超出抗菌素行业常规的技术。另外这些抗菌素具有意想不到的优点，例如抗菌素10381Y与10381b2相比具有更强的抗菌活性。从微生物Streptomycesarginensis啤酒发酵的粗提取物中，已分离出基本上纯的抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t。这些化合物的独特的结构也已给出。在10381b抗菌复合物中，抗菌素10381Y的生物活性比起其它组分来要强些，详见下文所述。天然存在的微生物，Streptomycesarginensis可以用来制备本发明中的抗菌素。因而，该微生物有可能以其自然存在的状态来制备这些抗菌素。本发明所涉及的这些抗菌素不包括在自然界中可能有的，或肯定存在的任何组分，本发明提供了生产和分离这些抗菌素的方法，且所得的这些抗菌素有实用价值如用于药理学及其它抗菌目的，以及兽用。在下面文字中当提到“10381b组份”时，其含义与前文中提到的10382b2组份是一致的。抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t是从S.arginensis培养物获得的。该微生物的分类学和生长方面的描述见InternationalPublicationNumberWO88/00200(1988年1月14日出版)。10381b抗菌复合物的发酵和发现方面的描述也可参见该文献。10381b抗菌复合物的较可取的制备方法见下文制备法1和2中所述，其中制备法2更为可取。一组突变体，其每一个与母体菌株Streptomycesarginensis相比都具有增高的效价，可用于10381b复合物组份的制备。采用标准的变异和选择技术可制备这些新的菌株。变异方法包括化学变异法，用N-甲基-N’-亚硝基胍[Delic等人，(1970)，Mutat.Res.9167]，用亚硝酸[Crueger及Crueger(1984)，BiotechnologyATextbookofIndustrialMicrobiology，P.16，SinouerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA]，以及用紫外光照射[Thrum(1984)BiotechnologyofIndus-trialAntibiotics(Vandamme，ed.)，MarcelDekker，NewYork，pp.373—374]。选择技术包括简单的再分离菌株的方法，即弧立的菌落的选择，特殊菌落的形态学选择，以及对组份类似物的耐受性选择，虽然10381b复合物是生物合成途径中的产物[Crueger及Crueger(1984)，BiotechnologyATextbookofIndustrialMicrobiology，pp.24—25，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA]。这些菌株是有用的，因为它们能产生更多的10381b复合物。这意味着用较少量的培养物就能得到分离组份所需的物质。该突变和选择对10381b复合物中组份的比例没有明显的改变。从10381b抗菌复合物(它含有已知的10381b组份以及作为本发明的一部分所鉴定出的组份)粗品中分离出这些抗菌素是通过在反相—HPLC柱上经层析分离来实现的。可取的起始物为二次发酵的10381b抗菌复合物粗品，因为其中富含本发明的组份。另外一种得到富含本发明组份的方法是对已有的啤酒提取物进行第二次提取。可取的层析柱为ZorbaxC8，5μm，流动相为水—四氢呋喃(THF)-乙腈(ACN)(60∶27∶3)，其它的柱，如，WatersDeltaPakC18也可用，但分离效果不佳。可调整流动相，从而得到不同的保留时间(也影响分离)。较可取的制备10381b组份的方法见下文实例6中所述。通常，本发明的抗菌素(包括大量纯的抗菌素10381y)可用Wa-tersDeltaPakC18柱(50×300mm)以水-THF-ACN(60∶27∶3)作流动相，经多次层析来制备用WatersDeltaPrep3000，每次加工约32mg，经164次层析可加工约5.2g10381b抗菌复合物粗品。可形成组份10381b和10381x等的洗脱液汇合部份，并制成不同纯度的产品。将10381y第一部份浓缩至80—150ml，并在同一层析柱上用同样的流动相，重复层析。另一种改变的方法是将大约2升的最终汇合部分的10381y洗脱液浓缩至约600ml水浓缩物，用60ml二氯甲烷提取，提取物被蒸干，将残留物溶于流动相中进行第二次层析。该改变的方法(针对10381y洗脱液最终汇合部份)导致较小的加料量，得到较好的层析分离结果，从而经过下列步骤后得到18mg层析纯的10381y将10381y汇合部分浓缩为水溶液，用1/10体积的二氯甲烷提取，将该提取液浓缩成为1ml左右的浆，加入3ml正庚烷完成重结晶，对该方法的更详细描述详见下列实例2。最纯的抗菌素10381y可经Zorbax5C8柱两次层析而得到，流动相采用水-四氢呋喃-乙腈，详见实例3所述。另外在下列表IA和IB中给出了本发明抗菌素10381v，W，X，Y，Z1，Z2，pre—b及t的分析HPLC保留时间。本发明抗菌素的结构是用核磁共振(NMR)和质谱(MS)来测定的。例如，应用该实验分析出抗菌素10381y是InternationalPubli-cationNumberWO88/00200中10382b2组份减去两个末端的脱氢丙氨酸残基。因此，在下列结构式图中，抗菌素10381y被确定为式IV化合物，且10382b2组分被确定为式VIII化合物(与硫霉素I相同)。另外在下列结构式图中，式I化合物为抗菌素10381v；式II化合物为抗菌素10381W，式III化合物为抗菌素10381x；式IV化合物为抗菌素10381y，同上所述；式V化合物为抗菌素10381Z1；式VI化合物为抗菌素10381Z2；式VII化合物为抗菌素10381pre—b；式IX化合物为抗菌素t。在抗菌素式I—VII及IX中含有几个不对称碳原子，此点对本专业人员而言是显而易见的。这些化合物的所有对映和立体异构体均包括在本发明的范围内。本发明还提供了式I—VII和IX化合物的药理学上可接受的盐。药理学可接受的盐系指那些在药物化学家眼中与母体化合物在配方，稳定性，病人的适用性和生物利用度等性质方面相当的那些盐。本发明的所有化合物可用作抗菌素，且可用于治疗一些细菌感染和/或防止或减少一些微生物在各种环境中的生长。例如，已发现在对抗许多微生物方面，抗菌素10381y的生物活性是10381b复合物或10381b组份的两倍左右。在下列表III中，应用体外最小抑制浓度(MIC)测定法(详见下文实例5所述)，对10381b中三个主要组份(b，x及Y)与10381b复合物进行了比较。用该测定方法测定了化合物对一些类型厌氧菌的抑制的能力，这些厌氧菌通常对家禽，猪，牛等的内脏有抑制作用。在表III中，明显表示出“Y峰”或抗菌素10381y与单独的b和X峰物质或10381b复合物相比，活性更强(更低的MIC值)，特别是对抗梭状芽胞杆菌属和链霉菌属，它们与鸡和猪的生长抑制有关，而这些组份对瘤胃厌氧菌如M.elsdenii和S.ruminantium(它们是反刍动物微生物区系所必需的组份)等对抗活性较低，因此，除用限促进单胃动物如家禽和猪的生长之外，还可用于促进反刍动物，如牛的生长。下列表IV中给出了10381b组份中的一些组份和复合物的其它生物活性数据。这些生物活性数据是用下列所述实例5中的体外最小抑制浓度测定法来测定的。组份X，b和Y的生物活性数据见表IV中，表IV与表III的相当结果稍有不同。当比较个别的体外抗菌鉴定之间的实验结果时，这样的差别是常见的，特别是对不同批的抗菌素进行测试。除这些差异之外(以及除X组份对抗P10831C1菌株时结果不同之外)，两种测定方法之间的结果是一致的，且表明至少在体外实验中，组份Y是最具活性的，组份b作为单个组份次之。组份pre-b，V及W，等组份，象组份X那样活性大大地降低。本发明的抗菌素也可用于促进反刍动物的生长，如，牛和羊，及非反刍动物，单胃动物，如家禽(例如，小鸡和火鸡)和猪的生长。用本发明的抗菌素促进动物，如家禽，猪和牛的生长时，所需的剂量及给药方式均是兽医专业人员所熟悉的常规方法。典型地，在饲养时，给动物喂本发明抗菌素，从而促进其生长。例如，较可取地可用抗菌素10381y制成粉末或颗粒状，将其制成含有合适的惰性载体，如大豆粉，米糠或石灰石的混合剂，并加到饲料中。对小鸡而言，能促进其生长的抗菌素10381y的有效量为约0.5—11mg/kg饲料，较可取的为约1—2mg/kg饲料，最可取的为1—1.5mg/kg饲料。对牛而言，10381y抗菌素的促生长的有效量为约1—55mg/kg饲料左右，较可取的为约2—6mg/kg饲料，最可取的为约2—3mg/kg饲料。无需进一步详述，本领域的专业人员可用前述的方法完满地再现本发明。下列详细的例子描述了如何制备各种化合物和/或如何实施本发明的各个步骤，这些实例仅仅是要说明本发明而无意于限制本发明。本领域内的专业人员将会及时意识到反应过程中来自反应物或来自反应条件和技术方面的各种可能出现的变化。制备1，10381b抗菌素复合物的分离用NaOH将来自S.arginensis发酵的全啤酒的pH调节至10。然后用2×0.5体积的乙酸乙酯提取，用HPLC检测提取完全与否。合并提取物，浓缩(旋转蒸馏器，真空，40℃水溶)至0.4倍于啤酒的体积(部份10381b复合物可沉淀出来)。在搅拌下，慢慢加入1体积庚烷，使之沉降数分钟，再加1滴庚烷检查一下沉淀是否完全。如有需要可向浆内加入更多的庚烷。将混合物冷却至4℃，过滤或离心分离出沉淀。用庚烷洗涤，干燥(40℃/真空)至恒重，HPLC分析。制备210381b抗菌素复合物的分离(参考流程图A)用1体积乙酸乙酯(PH大约为7.5)对来自S.arginensis发酵的全啤酒进行提取。生成的乙酸乙酯提取物浓缩至30g/l。向其中加入2体积庚烷，冷却至-20℃，用时2小时。离心，倾析，用庚烷洗涤，再次离心，倾析，最后干燥，得粗品10381b复合物。实例1抗菌素10381y的制备(小量)小量的不纯的10381y可经柱层析(Zorbax5C8)制备，以水-乙腈(ACN)(55∶45)作流动相，步骤如下将得自上述制备1和2中的20mg粗品10381b复合物(经HPLC检测含有85％10381b成份，以及未知数量的10381y成分)溶于1.0ml流动相水—乙腈(ACN)(55∶45)中；注入100μl的该溶液经21×250mmZorbax5C8柱进行层析，流动相8ml/min；收集含有10381y峰(RT＝17min)的洗脱物，合并。将其冷冻，有机溶剂从冰上倾析出来并蒸发；加入800μl正庚烷后，残渣经100μl甲醇和300μl二甲醚重结晶。按照这一步骤，得到纯度57％的1.5mg10381y。实例210381x，10381y(大量)，10381b以及其它较少的10381成份的分离A.DeltaPrep3000的制备制备层析在WatersDeltaPrep3000制备层析系统上进行，使用WatersDelta-PakC18径向压缩柱体(50×300mm，15μm颗粒，100A的孔径)。DeltaPrep3000层析系统可使洗脱液流经PharmaciaLKBBrommamodel2238UVICORDSIIUV检测器(254nm处吸收)，它连接着PharmaciaLKBBromma型2210，二通道条形图记录仪和WatersMAXIMA820电子层析数据收集系统，层析运转条件为层析柱的径向压力是600psi，且流速为35ml/min其结果是在层析过程中该系统产生350psi的回压。B.柱上加料物质的制备加料物质的制备是将按上述制备1和2中所述相类似的方法制备出的500mg10381b复合物粗品溶解于31.25ml如下混合液中(乙腈(ACN)-milli-Q-水(水)-二甲基甲酰胺(DMF)(25∶5∶1.25))。用旋转混合器和超声波助溶。该溶液保存于4℃下过夜，期间有黑色物沉淀出来。用Beckman型J2—21离心机在5000rpm下对该混合物离心15分钟，用HPLC分析固体颗粒，发现其中10381b组份小于1mg。倾出清洁的进料液，并在4℃下保存至须层析时。该清洁的溶液中固体成分按下列方法测定，将1ml溶液置于铝盘中，缓缓灌入氮气，用蒸汽加热板加热蒸发，直至溶剂蒸完，而后将该盘再置于用蒸汽加热的真空塔中10分钟，再称重该盘子。在本实验中，测得固体重量为16mg/ml。C.制备流动相可采用水-ACN-四氢呋喃(THF)(比例为60∶3∶27)的流动相，然而，也可采用比例为68∶3.3∶28.7或任何类似比例的流动相。当采用第一种比例时，用10ml/min的流速在1分钟内装样品，而后用35ml/min的流量洗脱50分钟。当采用第二种比例时，由于完成层析b组份的需要，故要洗脱60至70分钟。除了水-ACN-THF流动相之外，也可采用含有乙酸铵-ACN的流动相。然而，经证实该流动相效率低。采用大量UV规格的四氢呋喃(THF)将是十分昂贵的，也可采用非色谱规格的THF(Burdick&Jackson)作为流动相。其它成份同上所述。HPLC跟踪表明在UV规格及非色谱规格THF之间，在本实验条件中无明显的差异，非色谱规格的THF不影响10381b组份在254nm处的吸收，先前的实验已证实非色谱规格ACN同样对220nm以上的UV吸收无干扰作用。D.样品收集和汇合部份的形成以每30秒一份的柱流出速度，在PharmaciaLKBBromma型2211SuperRac馏份收集器上收集柱层析洗脱液，用条形图记录作为指导，形成含有V，W，X，Y，Z1，Z2及pre-b组份的汇合馏份。1)组份10381x及10381b的制备方法分别收集并合并组份10381x及10381b2到4升为止。然后将合并液置于Buchi型RE-121旋转蒸发器于40℃水浴中，近40托压力下蒸除有机溶剂。将旋转蒸发器的冷凝装置置于4℃下的冷冻循环浴(EndocalRTE—5B)中。将每一汇合部份浓缩至原体积的1/5，在这期间有沉淀形成。将浓缩物在4℃下放置过夜。第二天分别离心，条件为在BeckmanJ2—21冷冻离心机上，5000rpm离心20分钟，并用JA10离心头。将上清液倾倒至分开的汇合部份中。沉淀物小团用上清液少许(几毫升)重新制成浆状物，然后将其转移至50ml无菌一次性离心管中。每次得到4升汇合的洗脱液，按上述操作将沉淀小团加到上述管中，当管的大约1/2充满后，在BeckmanJ2—21冷冻离心机(带有JA—14头和50ml采集杯)中，于5000rpm离心20分钟。将上清液加到原先的上清汇合液中。用数毫升milli-Q-水(足以使小团成浆)洗涤沉淀小团，然后在5000rpm离心20分钟，再将上清液倾至前面所述的上清汇合液中。用VirtisUnitrapII冷冻干燥机干燥经洗涤的沉淀小团。在本实验中，用HPLC测定上清液，发现仅少量的10381b和10381x组份，且它们的纯度低于沉淀产物，故将其弃去。2)“Y”峰汇合部份的制备方法将“Y”峰馏份汇集到2升后，将该汇合部份置于旋转蒸发器上，同前操作x—和b—汇合部份时一样。然后再次层析。将y—浓缩液装到DeltaPrep制备层析器上的体积，在每一批操作中可以变化，但一般都在80—150ml之间，这取决于可得到产品的总量。同上所述来收集馏份，再将含有x—和b—组份的馏份分别加回到它们各自的汇合部份中。汇集含有Y纯组份的馏份，在旋转蒸发器中，在40℃浴温，40托压力下，浓缩成水溶液，用2×0.1体积的二氯甲烷提取，根据纯度(HPLC)汇集提取液，浓缩，转移至20ml小瓶中，蒸发，用少量丙酮和3倍量庚烷进行结晶。将浆状物离心，倾出上清液，用庚烷洗涤结晶，在约40托/30℃下干燥。对10381y组份层析所得的最后2升汇合部份，可采用如下改进的方法将汇合部份浓缩成水溶液，用1/10体积的二氯甲烷提取2次；合并提取液，再浓缩至小体积，将其转移到20ml称重的闪蒸小瓶中，在室温下用经滤净的氮气将其吹干，将干燥物再溶于5ml流动相中，水-ACN-THF(68∶3.3∶28.7)，进行第二次层析，汇集Y-馏份，并按上述操作方法加工。在本实验中得到97％纯度的10381y。为了分析起始物洗脱液和10381y的纯化，采用了Whatman5—C8柱，0.01MPH5.5磷酸钠-ACN(55∶45)，流速1ml/min，在248nm处检测。然而，用Nucleosil5—C18柱，0.01mPH5.5磷酸钠-ACN-THF(60∶3∶27)，流速1ml/min，在248nm处检测，能更好地将组份10381b从组份10381y分离出来。E.结论在本实验中加工约5.2g的10381b抗菌素复合物粗品，采用DoltaPrep3000经180次循环操作，包括16次10381y的二次层析，结果得到下列组份的总产量约1484mg10381b，约379mg10381x及约50mg10381y。实例3制备抗菌素10381y(纯品)采用Zorbax5C8及水—四氢呋喃—乙腈流动相进行双层析可得到最纯的10381y，详见如下用水—四氢呋喃—乙腈流动相，将一支21×250ml的Zorbax5C8柱平衡，将200μl含有100mg/ml10381b复合物粗品的DMF溶液(该粗品中含有9.5％的10381y，并且采用上述制备1和2中所述方法制得的)注射到柱上，并以8ml/min的速度展开；收集合有10381y的洗脱液；在再次注射加料前，用80％含水乙腈溶液洗涤层析柱15分钟(当过夜时，应将层析柱保存在该溶液中)。将一系列分离的10381y洗脱液汇集起来，浓缩为水溶液，并用二氯甲烷提取；蒸发提取物，将残余物再溶于二甲基甲酰胺中进行二次层析。再次浓缩10381y洗脱液，并用二氯甲烷提取；将提取物浓缩成为浆状物，加入正庚烷使结晶完全。少量的(用该方法难以分离)可改用蒸发提取液的办法，并冷冻干燥正丁醇溶液中的残余物来分离。在本实验中，从300mg10381b复合物粗品中得到6.5mg层析纯的10381y。在下列表IA中给出了本发明10381组份的分析HPLC保留时间(实验条件为用4.6×250mmZorbax5C8柱，1ml/min水-THF-ACN(60∶27∶3)。实例4测定抗菌素10381y(式IV)和其它10381抗菌素的结构用NMR(核磁共振)谱和质谱法来测定抗菌素10381y的结构。NMR的标准鉴定方法是用相关性光谱学(COSY)确定所有的H—H之间的相互关系，并用杂核相关光谱学(HETCOR)实验将这些信息转移到碳骨架上。在高度不饱和分子中(如10381y)就产生了困难，原因是有大量非质子化的碳原子在序列中出现断裂现象。这种情况下，可采用低灵敏度的相互反应，例如核极化效应(NOE)和远程C—H相关性被用来跨接许多孤立的自旋体系。这些实验的应用和分析导致鉴定抗菌素10381y为10381b减去2个末端脱氢丙氨酸残基。因此，测得抗菌素10381y为式IV化合物，即是52-去[1-[[[1-(氨基羰基)乙烯基]氨基]羰基]乙烯基]-硫霉素I，见下列结构图。分子中所有1H和13C共振的完整结果见下列表II。采用类似方法，得到其它组份的1H共振，详见下列数据式I抗菌素10381v8.14，8.46，8.29/7.84，8.81，9.86，5.60／5.65，6.41/5.73，9.15，9.89，6.51，1.78，2.58，8.43，6.43，8.50，3.29，9.40，6.25，4.48，1.21，5.36，2.55，4.37，8.10，4.16，1.10，5.18，8.47.式VII抗菌素10381Pre—b7.49/7.91，5.63/6.10，9.10，5.71/5.71，10.03，6.52/5.94，10.48，8.24，8.48，8.64，9.97，5.57/5.53，6.49/5.76，9.21，9.71，6.57，1.76，2.62，8.21，4.73-4.84，8.75，9.50，6.27，4.49-4.58，1.20，4.95，2.54，4.49-4.58，8.10，4.18-4.27，1.13，5.23，8.42.式VI抗菌素10381z27.50/7.91，5.64/6.10，9.09，5.72/5.72，10.04，6.53/5.94，10.48，8.24，8.47，8.66，9.88，5.62/5.53，6.49/5.73，9.22，9.71，6.56，1.77，2.55，8.23，4.76，8.78，9.46，6.44，1.77，2.62，4.59，8.07，4.25，1.12，5.17，8.44.式III抗菌素10381x7.50/7.91，5.66/6.12，9.09，5.70/5.75，10.12，6.67/5.96，10.49，8.20，8.56，5.02，8.25，1.49，2.59，8.25，5.42，8.15，1.60，4.18/4.57，8.85，2.53，4.37，8.03，2.17，1.04，1.05，8.37.式II抗菌素10381w7.67/8.15，5.81/6.57，10.69，8.20，8.53，5.01，8.24，1.48，2.66，8.24，5.43，8.16，1.60，4.18/4.56，8.70，2.53，4.37，8.04，2.17，1.00，1.00，8.38.式IX抗菌素10381t8.01/7.82，8.49，8.13，2.53，5.02，1.49，8.19，8.23，5.43，1.60，8.15，2.53，4.55/4.20，8.86，4.38，2.18，0.96，0.96，7.90，8.36.采用电子喷射离子化，且在m/l1130.0处呈显离子。获得10381y(相应子M＋Na+加成物)的质谱数据，测得的平均质量为1107.0amu，它与具有C48H46O14N14S2分子式的分子量是一致的(计算得到的平均分子量＝1107.1)。采用上述类似的方法，得到如下所述的本发明中其它的10381b抗菌素的结构和平均质量式I化合物为抗菌素10381v(1037.7amu)；式II化合物为抗菌素10381W(815.7amu)；式III化合物为抗菌素10381x(953.9amu)；式IV化合物为抗菌素10381y，同上说明；式V化合物为抗菌素10381Z1(1201.5amu)；式VI化合物为抗菌素10381Z2(1185.7amu)；式VII化合物为抗菌素10381pre—b(1215.1amu)且式IX化合物为抗菌素10381t(746.2amu)。实例5抗菌素10381B组份的最小抑制浓度的测定用下述体外MIC(最小抑制浓度)测定法来比较10381b组份与10381复合物之间的生物活性。该测定方法衡量了化合物抑制某些厌氧菌生长的能力，这些厌氧菌通常对家禽，猪和牛的内脏产生抑制作用。I.化合物的制备用10％V/V乙醇/水将待测物制成2mg/ml的溶液。将该溶液稀释为1mg/1ml，并进一步稀释成为一系列10—2倍的稀释液。在每一浓度下，将等分试样置于无菌的陪替氏培养皿中，每个平皿中加入9体积的融化的琼脂，混合后使其在室温下固化。将平皿转移到Coy箱中，使之干燥并用无氧大气饱和。II.接种物的制备用于MIC测试的微生物(菌类)被接种到肉汤培养基中，使用前于39℃培养18—24小时。将培养物稀释到与0.5MacFarland硫酸钡标准液的混浊度相等，除了对猪的分离物P108—3C1，P105—1C3和P105—1C4(被稀释1∶1)而外。所有的接种和稀释均在厌氧室中进行，并使用肉汤培养基，并通过丁基橡胶塞用注射器转移。将新鲜制备和稀释的培养物装于Steers氏复制装置的小池内，该装置可分配每32种培养物，每种约10μl预先接种到琼脂平皿的表面。接种1小时后，接种物已被吸收，将培养皿插入，在38—39℃培养48小时。从培养室中取出培养皿，测定被试化合物的NIC。MIC值为能阻止被试微生物(菌)在琼脂平皿上可检出的生长所需的化合物最低浓度。对有些化合物测试时，在生长和非生长之间，难以在两者之间划分出明显的界线。于是，被试化合物的MIC可考虑将浓度稀释，该浓度或能产生模模糊糊的生长，或在测试区域内有3—5个个别的菌落。因此，每一组被试平皿对32种被试微生物(菌)的每一种将产生个别的MIC值。III.结论在表III中，使用上述分析方法，对下列抗菌素进行比较10381b复合物，10381b组份，10381x组份和10381y组份。虽然组份间确实的活性差别随个别被试微生物而变化，但从表III看来是清楚的“Y峰”或抗菌素10381y始终是更具有活性的(较低的MIC值)，比起个别的b和x组份或1038lb复合物来，特别是对梭状芽胞杆菌和链球菌种，已有报导这些菌种与在鸡和猪体内的生长抑制有联系，而对瘤胃厌氧菌如M.elsdenii和S.ruminantium(它们是反刍动物微生物区系的必需成分)保留着较低的活性，因此建议，其除了可用作单胃动物，如家禽或猪的生长促进剂外，还可用作反刍动物的生长促进剂。表IV列出了某些10381b组份和复合物的其它生物活性数据，这些数据是用上述分析方法获得的。表IV中所述的本研究所发现的成分X，b，及y的生物活性数据与表III中所列的相当的结果稍有不同，这种差异在比较多次体外抗菌分析结果时是常见的，特别是当测试不同批号的抗菌素时更为常见。除了这些不同(以及X组份抗P1083C1菌株所获得的不一致的结果)外，这两种分析结果是一致的，并且可看出至少在体外，组份Y的活性是最强的，组份b的活性属于各个组份之第二位。组份pre—b，V和W，象组份x一样活性大大降低。实例610381b组份x，Y，W，V，PRE—B，Z1，Z2和T的分离和纯化10381b复合物是经Streptomycesarginensis在营养增养基中发酵而成的，粗品可采用乙酸乙酯提取，浓缩并用庚烷沉淀而得。获得的产品然后再于下列各种载体上进行层析10381x，32mg粗品10381b复合物于WatersDelta—Prep(填装有Delta—PakC18柱)系统上进行层析，流动相为水-ACN-THF(67∶3∶30)，流速35ml/min。层析结果用Pharmacia2238UVICORDSIIUV检测器检验，波长254nm，分出组份10381b，10381x和其它少量组份。合并10381x洗脱液，储存于4℃下。当已收集有多于50mg的化合物时，浓缩上述合并液至水浆状并离心。将含有少量10381b的上清液倾析出去，将固体小团转移至小瓶中并冷冻干燥。物理性质如下经HPLC分析，此物纯度＞90％，含痕量10381b，10381y和未知极性杂质。如果用于MS和NMR的话，不需进行二次层析纯化。10381y。此化合物可用与10381x相同的层析方法分离得到。然而，由于10381y洗脱液的纯度低于10381x，因此先将其浓缩至水溶液，并用2×0.1体积的CH2Cl2提取，合并提取液，蒸发；再溶于流动相中进行第二次层析。新的洗脱液再次合并，浓缩至水溶液，用CH2Cl2提取。提取物连续用0.2体积水洗涤，合并并蒸发。残渣(43mg)转移至闪烁计数小瓶中，在带有3ml正庚烷作反相溶剂的1mlCH2Cl2中重结晶。所得浆状物离心，用移液管移去上清液，结晶用1ml庚烷洗涤。物理性质如下HPLC检查结果，所得的35mg10381y的纯度为98％。10381W，此化合物的分离和纯化可采用与10381y相同的两次层析法。由第二次层析所获得的固体(34mg)的纯度要比相应的10381y馏分低，原因是在粗品复合物中，含有比10381y量少的。10381W。因此，由层析柱上脱落的大量其它物质污染了这些固体，使其结晶困难。将它们先溶于1.5ml甲醇＋1.5ml丙酮中，滤除蜡状物(其中仅含痕量10381W，由HPLC检查得)，使用2ml正庚烷＋0.1ml甲苯(避免形成两相)，然后沉淀生成终产品10381W。物理性质如下得3.3mg74％纯度的10381W。10381v，此化合物的分离方法同10381W，采用两次层析法，并对合适的洗脱馏分进行提取。蒸发溶剂后获得的固体的纯度足以使之从ml丙酮(含2ml正庚烷)中重结晶出来。离心浆状物，移去上清液，残渣用庚烷洗涤并干燥。物理性质如下所得19mg10381v的纯度为82％。10381pre—b，此化合物可从含18％10381pre—b的粗品中获得，方法是通过单次层析(21×250mmZorbax(7μ)C8柱上，洗脱液水-ACN-THF(70∶3∶27)。将400mg起始物溶于8mlDMF中，分4次流过柱，洗脱液以相对低的流速(8ml/min)流动。合并含10381pre—b馏分(约1.2升)，浓缩至约300ml水溶液，经冷冻干燥后得终产品10381pre—b。物理性质如下所得的11.5mg10381pre—b产品为层析产品。10381Z1。此产品的制备采用PrepPakC18柱进行单次层析。含10381Z1的终洗涤脱液合并，浓缩至500ml含26mg10381Z1的水溶液(用HPLC，假设其与10381b具相同的响应因子)。用CH2Cl2提取，仅有痕量此化合物，改用乙酸乙酯分别在PH＝6和pH＝9时提取，仅有一点改善，将部份提取的水溶液冷冻干燥。物理性质如下所得的23mg10381Z1的纯度为91％。10381Z2。此产品可用与产品10381Z1相同的层析方法从10381Z2洗脱液中分离出来。将洗脱液浓缩至470ml水溶液，生成的沉淀经离心和冷冻干燥分离。物理性质如下所得的16mg10381Z2的纯度为80％。10381t。此化合物从复合物中分离出来，然后用上述分离10381y相同的方法进行两次层析纯化将30mg该产品置于WatersDeltaPrep(填装有DeltaPakC18柱)系统上，以水-ACN-THF(67∶3∶30)作流动相，流速35ml/min。合并含10381t的洗脱部份，储存于4℃，直至收集到足够的洗脱液(1升洗脱液大约含5mg)，然后浓缩水溶液，用CH2Cl2提取。合并提取液并蒸发；将残渣溶于DMF中，以21×250mmZorbaxC8柱进行层析，流动相为水-ACN-THF(70∶3∶27)，流速8ml/min。含几乎是纯10381t的洗脱液，合并并蒸发得最终固体产品1038t。物理性质如下经HPLC检查，得4mg10381t固体。本发明中10381t组份的分析HPLC的保留时间(使用4.6×250mmZorbax5C8柱；流动相为水-THF-ACN(70∶27∶3)，流速为1ml/min)列于下列表IB中。更纯的10381t的制备方法如下以粗品10381b复合物作起始物，按下列方法分离1)以乙酸正丁酯提取全部啤酒，2)浓缩提取物，3)用庚烷沉淀10381复合物，4)用离心和干燥分离固体粗品。此物进一步干燥(至恒重)，用水(2ml/g固体)处理以除去约2％的极性杂质。将此上等产品作为起始物，用来从10381b和其它小量组份中层析分离出10381t。置于WatersDeltaPrep系统中的DeltaPakC18柱，用流动相(MP)水-THF-ACN(67∶3∶30)进行平衡，开始每批加样品32mg，然后为每批64mg，对该起始行进行层析，流动相流速35ml/min。共计有2g粗品10381b进行层析。合并含10381t的洗脱馏分，存于4℃下，直到它们达到每批500ml，共两批。这些洗脱液首先在真空蒸馏器中(约30托，45℃水浴)浓缩至水溶液，然后用3×0.1体积的CH2Cl2进行提取。提取物合并，分析，浓缩至干。将所得的含2.0和2.4mg10381t(HPLC)的固体与前面获得的，具相似纯度的样品合并。每批固体用几毫升CH2Cl2浸取并洗涤，直至没有活性物质为止。合并提取物，浓缩，转移到1.5ml管中并干燥。将从DeltaPak柱上大多数物质中游离出的固体重新溶于190μlDMF中进行第二次层析。此项分离在一个新的21×250mmZorbax7μmC8柱上进行，流动相为水-THF-ACN(70∶27∶3)。为了使展开过程中解吸物质对洗脱液的污染减低到最小程度，先用5mlMP-DMF(1∶1)和5mlDMF洗涤柱子。然后将起始物质，约10mg粗品10381t注入其中，并用MP(8ml/min)进行展开。本发明中的其它成分也可按类似上述方法进行操作，以获得更纯的产品。表IA10381b组分的分析HPLC保留时间在相同的HPLC系统中，相对于10381b组分保留时间的保留时间。表IB10381T组分的分析HPLC保留时间</tables>在相同的HPLC系统中，相对于10381b组分保留时间的保留时间。表II10381y在d6-DMSO中的NMR化学位移<p>表II(续)10381y在d6-DMSO中的NMR化学位移<>注a说明是可以互换的。b说明28，31和31’系列与42，45和45’系列是可以互换的。表III组份10381y，X和b的生物活性(最小抑菌浓度M.I.C.μg/ml)菌体菌株复合物10381x10381b10381yC.荚膜梭菌P1083C10.41.60.4＜0.2C.荚膜梭菌P1051C350.0＞100.050.012.5S.粪链球菌P1051C412.550.012.51.6S.牛链球菌JB13.125.03.10.4C.荚膜梭菌A83-RKP0.41.60.80.4C.荚膜梭菌A83-30.86.33.1＜0.2C.荚膜梭菌A82-13.150.03.10.8S.粪链球菌71A0150.0100.025.06.3C.荚膜梭菌71A021.66.31.6＜0.2C.荚膜梭菌RF1B040.43.10.4＜0.2S.粪链球菌CCS1-036.350.012.51.6C.荚膜梭菌CCS2-090.41.60.8＜0.2C.荚膜梭菌CCS1-113.150.06.30.8B.脆弱拟杆菌UC937050.0100.025.01.6C.荚膜梭菌UC94521.66.33.1＜0.2B.多形拟杆菌UC901425.050.012.5＜0.2E.迟缓真杆菌L-34NGNGNGNGB.fibrisolvens490.41.66.3＜0.2B.fibrisolvensD10.83.10.8＜0.2M.elsdeniiB159＞100.0＞100.0＞100.0＞100.0L.multiparus401.66.31.6＜0.2S.ruminantiumGA192＞100.0＞100.0＞100.0＞100.0S.ruminantiumGA3150.0＞130.0100.025.0R.amylophilusH18＞100.0＞100.0＞100.0100.0R.生黄瘤胃球菌FD10.86.31.6＜0.2R.生黄瘤胃球菌C940.83.10.86.3E.ruminantiumGA1950.83.10.46.3P.ruminicola118B＜0.20.2＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052100.0＞100.0100.025.0F.necrophorumFN4070100.0＞100.050.025.0S.hyodysenteriaeB204NTNTNTNTS.hyodysenteriae16-4NTNTNTNT说明NG＝未生长，NT＝未测试；所有的MIC值以质量为基础，未作纯度校正。表IV菌株菌体复合物xpre-bbyC.荚膜梭菌P1083C10.8100.25.01.60.8C.荚膜梭菌P1051C325.0＞100＞10012.56.3S.粪链球菌P1051C43.1＞100＞1003.10.8S.牛链球菌JB11.6＞10050.00.80.8C.荚膜梭菌A83-RKP0.450.01.60.8＜0.2C.荚膜梭菌A83-3＜0.225.01.6＜0.2＜0.2C.荚膜梭菌A82-112.5＞100＞10012.512.5S.粪链球菌71A0112.5＞100＞10012.56.3C.荚膜梭菌71A02＜0.2ntnt＜0.2＜0.2C.荚膜梭菌RF1B04＜0.250.01.6＜0.2＜0.2S.粪链球菌CCS1-0312.5＞100＞1006.33.1C.荚膜梭菌CCS2-091.610050.00.8＜0.2C.荚膜梭菌CCS1-11＜0.2ntnt＜0.2＜0.2B.脆弱拟杆菌UC937025.0＞100＞10050.050.0C.荚膜梭菌UC94521.650.025.01.60.8B.多形拟杆菌UC901450.0＞100＞10025.050.0E.迟缓真杆菌L-34＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2B.fibrisolvens491.6＞10050.01.60.4B.fibrisolvensD10.4100.12.50.8＜0.2M.elsdeniiB159＞100＞100＞100＞100＞100L.multiparus403.1＞100＞1001.612.5S.ruminantiumGA1921.66.36.31.6＜0.2S.ruminantiumGA31nt6.350.00.8＜0.2R.amylophilusH181.625.0＞1001.6＜0.2R.生黄瘤胃球菌FD10.810025.01.60.4R.生黄瘤胃球菌C941.6＞10025.00.80.8E.ruminantiumGA19512.510012.512.50.8P.ruminicola118B＜0.212.5＜0.2＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052100.＞100＞100100.50.0F.necrophorumFN4070＞100＞100＞100100.50.0S.hyodysenteriaeB204＞100＞100＞100＞100＞100S.hyodysenteriae16-4＞100＞100＞100＞100＞100说明nt＝未测试表IV(续)菌体菌株vwC.荚膜梭菌P1083C1100＞100C.荚膜梭菌P1051C3100＞100S.粪链球菌P1051C4＞100＞100S.牛链球菌JB1＞100＞100C.荚膜梭菌A83-RKP1.6＞100C.荚膜梭菌A83-30.812.5C.荚膜梭菌A82-1＞100＞100S.粪链球菌71A01＞100＞100C.荚膜梭菌71A02ntntC.荚膜梭菌RF1B040.8100S.粪链球菌CCS1-03＞100＞100C.荚膜梭菌CCS1-09＞100＞100C.荚膜梭菌CCS1-11ntntB.脆弱拟杆菌UC9370＞100＞100C.荚膜梭菌UC94526.3＞100B.多形拟杆菌UC9014＞100＞100E.迟缓真杆菌L-3425.025.0B.fibrisolvens4950.0＞100B.fibrisolvensD125.0＞100M.elsdeniiB159＞100＞100L.multtiparus40＞100＞100S.ruminantiumGA19210012.5S.ruminantiumGA3125.01.6R.amylophilusH183.1＞100R.生黄瘤胃球菌FD125.0＞100R.生黄瘤胃球菌C9425.0100E.ruminantiumGA19512.525P.ruminicola118B＜0.2＜0.2F.necrophorumFN5052＞100＞100F.necrophorumFN4070100＞100S.hyodysenteriaeB204＞100＞100S.hyodysenteriae16-4＞100＞100说明nt＝未测试图示A结构式图结构式图(续)结构式图(续)结构式图(续)结构式图(续)结构式图(续)结构式图(续)结构式图(续)权利要求1.具式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX或其药理学上可接受的盐类。2.权利要求1中的式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物，不包括天然存在的。3.权利要求2中的I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物，其以必要纯的形式存在。4.权利要求1中的式IV化合物，其为52-脱[1-[[[1-(氨基羰基)乙烯基]氨基]羰基]乙烯基]硫霉素I。5.饲料组合物，其包含动物饲料和权利要求1中式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或其任意结合物。6.动物用复合剂，其包含权利要求1中具式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或它们的任意结合物以及合适的惰性载体。7.使用权利要求1中式I，II，III，IV，V，VI，VII或IX化合物或其任意结合物制备用于促进动物生长的药物。8.权利要求7的应用，其中的动物选自家禽，羊，牛以及猪。9.权利要求8的应用，其中的动物为鸡。10.权利要求9的应用，其中的化合物经口服给药，剂量约为每公斤饲料0.5～11mg。11.权利要求8的应用，其中的动物为猪。12.权利要求11的应用，其中的化合物经口服给药，剂量约为每公斤饲料1～55mg。全文摘要通过在水介质中对微生物Streptomyces.arginensis进行培养和分离，可以制得抗菌素10381V，W，X，Y，Z1，Z2，pre-b和t。抗菌素10381y的结构见下列式IV。这些抗菌素可以抑制被选择的菌种的生长，因而可以用作动物的生长促进剂。文档编号C12R1/465GK1130385SQ94193314公开日1996年9月4日申请日期1994年9月6日优先权日1993年9月10日发明者C·P·科尼尔,S·H·格罗得,H·F·梅尔申请人:厄普约翰公司