专利名称：用水解酶手性合成叔醇类的制作方法
技术领域：
本发明涉及手性拆分叔醇类的方法以及用于该方法中的新化合物。
某些叔醇类是药物和农业化学品领域(outlets)的有用的化合物，例如在GB1529818，EP-B-15756，EP-B-44605，EP-B-61835，EP-B-131684，EP-A-47594，GB2064520和EPA-472392中所公开的化合物。这些化合物通常具有一个旋光手性中心，并且拆分这些化合物可导致一些益处，例如旋光异构体中的一种活性更大或毒性更低。
欧洲专利申请EPA-472392公开了化合物(+)-2-(2，4-二氟苯基)-1-[3-[(E)-4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)苯乙烯基]-1H-1，2，4-三唑-1-基]-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇，该化合物具有抗真菌活性，并且在治疗人和其他动物的真菌感染中有价值。还公开了该化合物的制备中间体。
EPA-472392公开了两种制备旋光的式(A)环氧化物的方法 由EPA-472392的方法1至4所代表的第一种方法是一种化学合成法。方法4是用叔丁基过氧化氢在有机溶剂例如二氯甲烷中在四醇钛例如四异丙醇钛或四丁醇钛和酒石酸二烷基酯的存在下对2-(2，4-二氟苯基)烯丙基醇的不对称氧化反应。
EPA-472392的方法(i)至(iv)代表了第二种方法。方法(iii)涉及1-乙酰氧基-2-(2，4-二氟苯基-2，3-环氧丙烷的酶催不对称酯水解反应，该反应是采用水解酶例如酯酶或脂酶在缓冲溶液中或在缓冲溶液与有机溶剂例如二异丙醚、乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺的混合物中进行。在该方法中，(+)-形式进行了选择性酯水解反应，并得到了(+)-2-(2，4-二氟苯基)-2，3-环氧丙醇。(-)-1-乙酰氧基-2-(2，4-二氟苯基)-2，3-环氧丙烷不进行酯水解反应，并以高的旋光纯度从反应液体中回收。在方法(iv)中，从方法(iii)回收的(-)-1-乙酰氧基-2-(2，4-二氟苯基)-2，3-环氧丙烷用碱例如氢氧化钾或氢氧化钠进行正常的酯水解反应，得到(-)-2-(2，4-二氟苯基)-2，3-环氧丙醇。
采用不同方法可以将(+)和(-)形式的2-(2，4-二氟苯基)-2，3-环氧丙醇都转化成(+)-2-(2，4-二氟苯基)-1-[3-[(E)-4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)苯乙烯基]-1H-1，2，4-三唑-1-基]-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇。该方法的缺点在于环氧化物是一种反应活性基团，它易于水解和被亲核试剂进攻，例如被酶上的氨基所进攻。这会导致酶的全部或部分失活。
本发明人已发现，通过用酶催化拆分酯或二醇，接着对相应的被拆分的环氧化物进行化学步骤，上述方法可以加以改进。
因此，按照本发明的第一方面，提供了制备旋光的式(I)化合物的方法 其中R和R1独立地为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-C4烷基杂环，所述每个基团任选被取代，条件是R和R1不相同，并且*是一旋光手性中心；该方法包含(a)用水解酶处理外消旋的式(II)化合物 其中R和R1如前所定义，且R2为烷基、芳基或芳烷基，它们各自任选被取代；或(b)用水解酶在酰基给体的存在下处理外消旋的式(III)化合物 其中R和P1如前所定义并且将(a)和/或(b)的旋光产物转化成旋光的式(I)化合物。
若R和R1中的任何一个为芳基，则优选其为苯基或取代的苯基。
若R和R1中的任何一个为芳烷基，则其优选为苄基或取代的苄基。
若R或R1为环烷基，则其优选为C3-7环烷基，特别是环丙基、环戊基或环己基。
若R或R1为烷基、链烯基、炔基、烷氧基或烷氧基烷基，则其优选含有最多达10个碳原子，特别是1-6个碳原子。
若R或R1为杂环基或-C1-C4烷基杂环基，该杂环优选选自1，2，4-三唑、1，3，4-三唑、咪唑、嘧啶、吡嗪、噁唑或吡唑。所述杂环可以被取代，例如由氨基、氧、SO2R4或OR4(其中R为氢)、C1-6烷基或苯基取代。若R1为-C1-C4-烷基杂环，则烷基优选为甲基或乙基。
特别优选的杂环是1，2，4-三唑和咪唑。
R优选为任选取代的芳基或任选取代的芳烷基，且R1为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-C4烷基杂环，所述基团各自任选被取代，条件是R和R1不相同。
若R和R1中的一个或全是被取代的，则取代基优选选自卤素、优选氯、氟或溴；烷基，优选C1-6烷基，特别是甲基、乙基、丙基和丁基(其正、异、仲和叔形式)；烷氧基、优选C1-6烷氧基，特别是甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基；卤代烷基，优选C1-6卤代烷基，尤其是被氯或氟取代的C1-6卤代烷基，特别是三氰甲基和五氟乙基卤代烷氧基，优选C1-6卤代烷氧基尤其是被氯或氟取代的C1-6卤代烷氧基，特别是三氟甲氧基氰基硝基氨基羟基磺酰基和苯基。可以有一个或多个取代基，在被取代时，优选可具有1-3个取代基。
尤其优选的R基团是由一个或多个卤素取代的苯基，特别是4-氯、4-氟、2，4-二氯和2，4-二氟苯基。
水解酶可以是脂酶、酯酶、磷酸酯酶、酰胺酶、肽酶、硫酸酯酶、腈水解酶或糖苷酶。所述酶可以从微生物培养物或由植物或动物中获得。所述酶的优选实例是猪胰腺脂酶和由粘稠色素杆菌(Chromobacterium viscosum)得到的脂酶。所述酶是可商购的，或者可以由本领域已知的方法制备。
酶催化拆分可以按以下任何一条路线进行(1)在含水反应介质中的水解反应；(2)在含有可混溶的有机溶剂的含水介质中的水解反应；(3)在水/有机两相反应介质中的水解反应；(4)在有机反应介质中的酯化反应；(5)在有机反应介质中的酯基转移反应。
应该懂得，由于旋光形式的命名原则，环氧化物的构型的确定取决于不对称中心上的取代基的性质。在下面所给出的一般和具体实施例中，环氧化物的两种形式是(R)-(+)和(S)-(-)，而二醇和酯的两种形式是(R)-(-)和(S)-(+)。还应该懂得，由下面具体实施例所说明的系统可以通过选择适宜的酯或二醇来提供环氧化物的两种构型。
当本发明方法按路线(1)至(3)中任何一个进行时，可概括为下列一般反应顺序 其中式(II)和(III)化合物是(R)-(-)和(S)-(+)对映体的外清旋混合物。将式(II)化合物的外消旋混合物用水解酶，例如猪胰腺脂酶处理。水解酶特异性地将不需要的(S)-(+)酯转化成相应的式(III)的(S)-(+)二醇。也可能形成少量的式(III)的(R)-(-)二醇。这种转化使得式(II)的(R)-(-)酯不含有不需要的式(II)的(S)-(+)酯。式(III)的(S)-(+)二醇可以进行分离，或者丢弃之，或者被转化或部分转化成富集(R)-(-)二醇的式(III)化合物、或外消旋化得到外消旋二醇。
反应顺序(1)至(3)可以更具体地采用(+)-2-(2，4-二氟苯基)-1-[3-[(E)-4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)苯乙烯基]-1H-1，2，4-三唑-1-基]-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇和2-(2，4-二氟苯基)-1，3-二(1，2，4-三唑-1-基)-2-丙醇(药用杀真菌剂，俗名叫氟康唑)的三唑环氧化物中间体来说明 若本发明方法按(4)和(5)进行时，可以总结为下列一般反应顺序 其中式(III)化合物是(R)-(-)和(S)-(+)对映体的外消旋混合物。将该外消旋混合物用水解酶例如猪胰腺脂酶、在酰基给体例如链烯基酯(例如乙烯基酰化产物，特别是乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯或苯甲酸乙烯酯，或者例如乙酸异丙烯酯或丁酸异丙烯酯)、或烷基酯(例如乙酸乙酯)或式RCO2H的酸(其中R为烷基、优选C1-6烷基，例如乙酸、丙酸和丁酸)存在下进行处理。
水解酶将不需要的(S)-(+)二醇特异性地转化成相应的式(II)的(S)-(+)酯。也可能形成少量的式(II)的(R)-(-)酯。这种转化使得式(III)的(R)-(-)二醇不含有不需要的式(III)的(S)-(+)二醇，也可以将式(II)的酯分离，或者丢弃，或者水解并转化或部分转化或外消旋化成式(II)的(R)-(-)二醇或外消旋二醇。
反应顺序(4)和(5)更具体地可以采用2-(2，4-二氯苯基)-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基]-己-2-醇(农业杀真菌剂，俗名hexaconazole)的三唑环氧化物中间体来说明 因此，酶催化反应可以既按上述的水解方向也可按下述酯化方向进行使式(III)的外消旋二醇与酰基给体例如链烯基酯(例如乙烯基酰化产物、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯或苯甲酸乙烯酯、或例如乙酸异丙烯酯、或丁酸异丙烯酯)、或烷基酯(例如乙酸乙酯)或式RCO2H的酸(其中R为烷基，优选C1-6烷基，例如乙酸、丙酸、丁酸)在水解酶的存在下发生反应。这种酯基转移途径提供的酯和二醇与通过水解途径用相同的酶催化上述反应所得的酯和二醇的构型相反。
在上述所有反应中，可以将不需要的对映体进行循环，以提高产率，并由此获得了更大的经济效益。在水解反应中，将(S)-二醇循环产生外消旋二醇，而在酯基转移反应中，将(S)-酯循环产生外消旋二醇。
(S)-酯的循环可以通过加入碱例如氢氧化钠的水溶液而将(S)-酯水解成(S)-二醇来进行。任选可将二醇在此阶段进行分离，即通过冷却溶液以结晶出产物，或可以将其保持在碱水溶液中。在两种情况中，(S)-二醇可以与任选取代的芳基或烷基磺酰卤(例如对甲苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、对溴苯磺酰氯、甲磺酰氯或三氟甲磺酰氯)、任选在相转移催化剂(其优选为烷基铵盐例如溴化四丁基铵)的存在下发生反应。反应产物是式(I)化合物，它基本上为(S)-对映体。产物是经一种中间体砜形成的，该中间体砜可以任选进行分离，这取决于所用的碱水溶液的浓度。
(S)-环氧化物(式(S)-(I))的水解是用酸的水溶液在0～100℃，优选10～80℃，尤其是20～70℃的温度下进行的。产物是式(III)的二醇，它由(R)和(S)对映体的混合物组成，二者的比率取决于所用的酸的水溶液的浓度、水解反应的温度和反应时间。例如，在温度为25℃及反应时间为24小时采用1.5M硫酸时产物中(R)与(S)对映体的百分率分别为73.5％和26.5％。在温度为65℃及反应时间为20分钟采用8.3M硫酸时产物中(R)与(S)对映体的百分率分别为53％和47％。
外消旋二醇的分离是通过碱化该酸性溶液，将二醇萃取到有机溶剂(例如甲苯)中、并浓缩和冷却溶液使二醇结晶来进行的。
(S)-二醇的循环可以通过与芳基或烷基磺酰卤(例如对甲苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、对溴苯磺酰氯、甲磺酰氯或三氟甲磺酰氯)在溶剂(例如甲苯、二甲苯、苯、吡啶、甲基异丁基酮或四氢呋喃)中与碱(例如烷基胺、优选三乙胺或吡啶或N，N-二甲基氨基吡啶)或碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)的水溶液的反应来进行的。依照所用的化学计量的碱，可以形成(S)-1-磺酰酯，或用过量碱，形成式(I)的(S)-环氧化物。优选使用过量的碱，形成(S)-环氧化物。当使用氢氧化钠水溶液作为碱时，可以使用相转移催化剂(例如溴化四丁基铵)加速反应。适宜的温度为-5℃～50℃，优选20～45℃，反应时间为0.25～24小时，优选0.5～1小时。然后按上面对来自(S)-酯的循环的(S)-环氧化物所述方法处理(S)-环氧化物。
酶催化反应(1)至(3)的一般条件是常规的。所述酶是可商购的，并且就按所得到的那样不用进一步处理即可用于反应混合物中，或者所述酶可以进行下述预处理将其溶于约pH7至pH7.5缓冲剂中，吸附到载体上，例如被动吸附到玻璃珠、砂子、硅藻土(例如Celite*)、活性炭、矾土(Al2O3)、硅胶、硅藻土或树脂(例如Amberlite*、Dowex*水、XAD*树脂)上。此外，所述酶可以共价吸附到载体上，例如聚苯乙烯、环氧树脂(例如Eupergit*)、塑料载体上。*是指商标或商品名。被吸附了的酶可以经冻冷干燥法干燥掉水，然后研磨成均匀的粉末。
使用适宜的缓冲剂来保持适当的pH，优选pH5-9，尤其是pH7.5。可任选加入一种碱(例如氢氧化钠或钾)水溶液来保持所需的pH。反应混合物必须进行搅拌。反应混合物的温度适宜为15～35℃，优选为30～35℃。
水解反应的溶剂为水，优选含有可混溶的共溶剂，例如醇，优选甲醇或乙醇，或酰胺，优选二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，或亚砜，优选二甲亚砜，或腈，优选乙腈，或醚，优选四氢呋喃或1，4-二噁烷、或酮，优选丙酮或2-丁酮。另外，还可使用不可混溶的共溶剂，例如芳烃，优选甲苯、二甲苯或苯，醚，优选叔丁基甲基醚、或乙醚，或酮，优选2-戊酮、3-戊酮、2-己酮或3-己酮。在另一种可选择的方式中，也可以使用可与水混溶的和不可与水混溶的溶剂的混合物，优选甲苯和甲醇、二甲苯和乙醇、叔丁基甲基醚和甲醇、2-戊酮和丙酮。尤其优选的溶剂混合物是水、甲醇和甲苯。可混溶的共溶剂的量应少得足以保持活性酶和两相混合物，但应大到足以溶解反应物酯。
酯基转移反应的溶剂适宜为四氢呋喃、叔丁醇或短链酮类(例如甲基异丙基酮、甲基乙基酮(2-丁酮)、甲基丙基酮(2-戊酮)、甲基异丁基酮)、或甲苯或乙烯基酰化产物(例如乙酸乙烯酯)。
用于酯基转移反应的溶剂优选为无水的、即溶剂含有0.5％或更少的水，优选0.1％或更少的水，尤其是0.05％或更少的水(％重量)。
在溶剂中有0.5％或更少的水的场合下，本领域已知的是应通过加入一种水合的或无水的盐或其混合物以缓冲该溶剂至一特定的水活性，该活性比0.5％水的活性要低。其作用是在溶剂中保持较低的水活性。
最好是向酯基转移反应系统(步骤b)中通入氮气，这可导致反应速率增加3倍，这意味着反应时间缩短，或者可以使用较少的酶，例如已证明，可以少使用25％的酶。这显示出显著的经济效益。因此，在本发明的一个优选方面中，提供了如上述的一种方法，其中式(III)的二醇用水解酶在含有氮气的气流存在下处理。
尽管酯基转移反应可以在相对低的温度(例如30℃)下进行，但已发现将温度升高至50～80℃有利，优选60～75℃，尤其是65～70℃。因此酯基转移反应可以在30～80℃的温度下进行。
当酯基转移反应已完全时(即(R)-二醇具有高旋光纯度)，则(R)-二醇可以方便地进行如下分离滤出酶，或者浓缩有机溶液并加入(R)-二醇晶种以选择性地从混合物中结晶出(R)-二醇，或者除去有机溶剂，并用不同的有机溶剂(优选二氯甲烷)研制所得油状物，由此从混合物中结晶出(R)-二醇。(R)-二醇的旋光纯度可以在此过程中得到提高。
用于萃取酶催化水解反应路线(1-3)的产物的溶剂包括任何与水不混溶的溶剂，例如，烷烃(例如己烷或辛烷)，醚或酮溶剂(例如叔丁基甲基醚、2-己酮、乙醚、戊酮或甲基异丁基酮)、芳烃溶剂(例如甲苯、二甲苯或苯)。特别优选的溶剂是甲苯和甲基异丁基酮。
此外，将产物从有机溶剂(例如乙酸乙酯、醚、己烷、二氯甲烷)或其溶剂混合物中重结晶将得到旋光纯物质。尤其优选的是二氯甲烷，因为该溶剂特别会提高来自酯基转移反应的产物的旋光纯度，即用此溶剂可能得到99.9％对映体过量。
三唑环氧化物的外消旋形式可以按EP44605中所述方法制备，该方法包括采用文献中所述方法使相应的酮与碘化三甲氧代硫鎓(Corey和Chaykovsky，JACS，1965，87，1353-1364)或碘化三甲基锍(Corey和Chaykovsky，JACS，84，3782)反应。所述酮可以按专利文献中所述方法制备，更具体地讲，用British PatentSpecifications Nos.1533705和1533706中所述方法制备。
式(I)的外消旋环氧化物可以用稀酸(例如硫酸)水解，产生式(III)的外消旋二醇。式(III)的外消旋二醇用酰氯处理产生伯醇的酯化作用，生成相应的式(II)的外消旋酯。
本发明的三唑取代的酯的外消旋和对映体形式是新的，因此，本发明另一方面提供了下式化合物及其对映体形式 其中R2为烷基或芳基，二者任选被取代；X为卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、羟基、磺酰基或苯基；和n为0至5。
优选R2为C1-5烷基，尤其是甲基、乙基、丙基和丁基(其正、异、仲和叔形式)。
若X为卤素，则其优选为氯、氟、溴。
若X为C1-6烷基，则尤其为甲基、乙基、丙基或丁基(其正、异、仲和叔形式)；或C1-6烷氧基，尤其为甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基；或C1-6卤代烷基，卤素优选为氯或氟，尤其是三氟甲基或五氟乙基或C1-5卤代烷氧基，卤素优选为氯或氟，尤其是三氟甲氧基，n优选为0-3。
本发明的对映的环氧化物中间体特别在农业化学品和药物的制备中是有用的中间体。
例如，其中R为2，4-二氟苯基且R1为-CH2-1，2，4-三唑的式(III)的(R)-(-)二醇可以按EPA-472392中方法6中的方法转化为相应的式(I)的(R)-(+)环氧化物。
按照EPA-472392中所公开的方法7的方法，可以将R为2，4-二氟苯基且R1为-CH2-1，2，4-三唑的式(I)的(R)-(+)环氧化物用于制备(+)-2-(2，4-二氟苯基)-1-[3-[(E)-4-(2，2，3，3-四氟-丙氧基)苯乙烯基]-1H-1，2，4-三唑-1-基]-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇。
因此，本发明另一方面提供了式V化合物的制备方法 其中R5是前面对R所定义的基团中的任一个，Y为一任选的取代基X为卤素，n为0-3，该方法包含下列步骤(i)制备式(IV)化合物 (a)用水解酶处理下式化合物 或(b)用水解酶在酰基给体的存在下处理下式化合物 (c)将(a)和(b)的旋光产物转化成旋光的式(IV)环氧化物；(ii)在有机溶剂(例如四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙醇)中、在碱(例如碳酸钾、碳酸氢钾或氢化钠)的存在下，将式(IV)的旋光环氧化物转化成式(V)的旋光化合物。
R5优选为上面对R和R1所定义的烷基、芳基、的杂环或烷基-杂环，X优选为氯或氟，且Y为一任选的取代基。特别有意义的是这样的化合物，其中X为2，4-二氟、2，4-二氯、4-氯和4-氟，R5为C1-4烷基、苯基或卤代苯基(特别是2，4-二氟、2，4-二氯、4-氯和4-氟苯基)、1，2，4-三唑或-CH2-1，2，4-三唑，它们各自任选被上面所定义的取代基所取代，且Y为-任选的取代基，它可以与上面对R所定义的基团相同，或者可以为更复杂的取代基，例如上述的(2，2，3，3-四氟丙氧基)苯乙烯基取代基。
本发明可参照下列实施例作进一步的说明，这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1通过在含水反应介质中相应的外消旋酯的水解拆分制备(R)-(-)-2-羟基-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基丁酸酯将Tris-盐酸盐缓冲液(10mM，pH7.2，8.334升)置于一玻璃反应器中，并在搅拌下加热至35℃。向其中加入猪胰腺脂酶(5g，Biocatalysts Treforest，UK)，并将pH用氢氧化钠(2M)调至pH7.2。
将相应的式(I)的外消旋酯(其中R2＝C3H7)(140g)溶于甲醇(1.666升)中。通过向含水的酶溶液中加入甲醇溶液引发反应。以67ml/分钟的速率泵压加入底物。监测反应的pH，并通过用氢氧化钠(2M)滴定自动调节到pH7.2。
3小时后，反应停止。观察不到再有滴定进行。反应混合物用2.5升甲苯萃取两次。甲苯用无水硫酸钠干燥，并经真空蒸馏除去。残余的水相用2.5升乙酸乙酯萃取两次，用无水硫酸钠干燥，溶剂经真空蒸馏除去。
反应用手性固定相HPLC在下列条件下进行监测
柱 Chiralcel O.D.(250mm×4.6mm)洗脱剂 己烷∶2-丙醇(87.5∶12.5)流速 0.6ml/分钟检测器 UV吸光度(205nm)保留时间 (S)-(+)-酯-20分钟(R)-(-)-酯-24分钟(R)-(-)-二醇-28分钟(S)-(+)-二醇-36分钟合并的甲苯萃取物产生58.7g具有下列组成的油状物(R)-(-)酯-58.01g(S)-(+)酯-检测不到(S)-(+)二醇-0.69g(R)-(-)二醇-检测不到实施例2在水/有机两相反应混合物中制备(R)-(-)-2-羟基-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基丁酸酯通过加热至60℃，将相应的式(I)的外消旋酯(其中R2＝C2H7)(44kg)溶于甲醇(25升)和甲苯(125升)的混合物中。然后将溶液冷却至35℃。
向反应器中加入磷酸钾缓冲水溶液(50mM，pH7.5，260升)，并加热至35+/-1℃。向其中加入猪胰腺脂酶(1.5kg，事先溶于10升磷酸盐缓冲液中，pH7.5)，并搅拌反应器。然后向反应器中加入甲苯(50升)，通过以3.3升/分钟的速率向含水的酶溶液中泵压甲苯/甲醇混合物来引发反应。通过加入1M氢氧化钠使反应混合物保持在pH7.5+/-0.2。反应用手性固定相HPLC在实施例1所述条件下监测。
4.5小时后，反应完全(由残余的(S)-(+)-酯的存在量少于1％来指示)。向反应混合物中搅入硅藻土(5kg)，并使反应混合物通过一滤布，以除去蛋白质和有助于相分离。分离水层和有机层。有机层用1000升热(35℃)水洗涤三次，除去任何二醇。最终有机溶液仅含有(R)-(-)-酯，产量为15kg，对映体过量为98％。
水相用乙酸乙酯(65升)萃取三次，合并的乙酸乙酯萃取液含有15kg(S)-(+)-二醇，对映体过量80％。
用猪胰腺脂酶或lipolase(由Novo Industri获得)作为酶重复上述实施例。将酯(100mg)溶于7.5ml叔丁基甲基醚中，并按上述方法在30ml含水缓冲液中与酶反应，结果列于表I中。
表I
实施例3通过在各种有机溶剂中的水解酶催化的酯基转移作用制备(R)-(-)-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-1，2-二醇反应混合物由相应的式(III)的外消旋二醇，25mg；酶，5mg；和溶剂2ml组成。反应物在溶剂中形成浆状物，这是由于酶的不溶性和二醇底物的部分溶解性造成的。将反应混合物在37℃振摇下保温16小时。用膜过滤器(0.2微米直径的孔)滤除酶。当底物或产物不完全溶于反应溶剂中时，在过滤前向反应混合物中加入甲醇(0.25ml)。这可产生澄清溶液，由此通过过滤可除去悬浮的酶。滤液用HPLC按实施例1中所述方法进行分析。
表II说明用脂酶采用丁酸乙烯酯作为溶剂和酰基给体的酯基转移反应的结果。
表II
用各种溶剂和酶粘稠色素杆菌脂酶重复实施例3的方法，反应混合物含有溶剂2ml，丁酸乙烯酯0.1ml，二醇25mg，酶5mg。反应混合物经在37℃振摇保温16小时，结果列于表III中
表III
对于下列实施例的分析方法如下GLC是采用带有0.25mm毛细管和25mm CP.Sil-5CB(Chrompack)柱的Hewlett Packard HP5890和积分仪进行；温度/时间曲线为140℃ 2分钟，然后以每分钟10℃速率升至200℃，之后在此温度保持5分钟。二醇在约3.8分钟洗脱下来，酯在约5分钟洗脱下来。反相HPLC是采用带有ODS 25cm×4.6mmID分析柱的Hewlett Packard和积分仪和流速为1m/分钟的由47.5％乙腈与52.5％水组成的洗脱剂进行的。用紫外线在260nm检测。
手性HPLC是用带有Chiralcel OD 25cm×4.6mm ID分析柱的Hewlett Packard和积分仪以及流速为1ml/分钟的由10％无水乙醇和90％正己烷组成的洗脱剂进行的。洗脱时间大致如下(S)-酯14.4；(R)-酯15.8(R)-二醇，20.7(S)-二醇23.4分钟。
实施例4在60～65℃下将1重量当量的外消旋二醇，2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-1，2-二醇溶于20体积当量的甲基异丁基酮(MIBK)中，并搅拌混合物。加入4体积当量乙酸乙烯酯，然后用一个烧结玻璃喷枪将氮气流通过溶液。一次性加入0.5重量当量猪胰腺脂酶(由Biocatalysts获得)。反应用GLC按上面所给出的方法监测，在反应结束时用手性HPLC按上述所给出的方法监测。将反应物搅拌13小时直到剩余不到5％的(S)-二醇。将酶从热溶液中用烧结玻璃滤器过滤出，并用少量冷的MIBK洗涤。减压下于旋转蒸发仪上蒸发溶剂，所得油状物用2体积当量二氯甲烷研制。冷却至5℃并放置30分钟后，滤出已形成的R-二醇白色晶体，用2体积当量冷二氯甲烷洗涤并晒干。该方法得到0.44重量当量(R)-(-)-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-1，2-二醇，经手性HPLC纯化得到大于99.5％的(R)-对映体。这说明转化率为42％。滤液含有0.8重量当量含有75％(S)-酯、7.5％(R)-酯、7.4％(R)-二醇和8.1％(S)-二醇的混合物。
实施例5在70℃将1重量当量外消旋二醇(式III)溶于5体积当量MIBK中。将氯气通过溶液，并加入2.5体积当量乙酸乙烯酯、接着加入0.25重量当量猪胰腺脂酶(由Biocatalysts获得)。将该混合物于70℃搅拌6-7小时直到用手性HPLC分析残余的(S)-二醇＜5％为止。趁热过滤溶液，并用2体积当量温热的MIBK洗涤。将溶液浓缩至1/3体积，加入二氯甲烷，加入(R)-二醇晶种。滤出晶体，并晒干。该方法得到0.44重量当量的物质，即大于99.5％的(R)-二醇，其浓度大于85-90％(二氯甲烷大约占晶体物料的10-15％)。
实施例6采用20体积当量甲苯(外消旋二醇仅部分溶于其中)和1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。将反应物搅拌4.5小时，期间47％的外消旋二醇转化成(S)-酯。
实施例7采用20体积当量叔丁醇和1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。将反应混合物搅拌1.5小时，期间有32％外消旋二醇被转化成(S)-酯。
实施例8采用4体积当量丁酸乙烯酯进行实施例4的方法。13小时后，有52％外消旋二醇被转化成(S)-丁酯。
实施例9采用1当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。2.5小时后，有50.6％的外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例10进行实施例9的方法，所不同的是不用氮气流。4小时后，有41.5％的外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例11采用10体积当量甲基异丁基酮和4体积当量的乙酸乙烯酯进行实施例4的方法。23小时后，有47％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例12采用80℃的温度来进行实施例11的方法。4.5小时后，有51％的外消旋二醇已被转化成(S)-酯。按实施例4的方法以40％产率分离出(R)-二醇，对映体过量＞97％。
实施例13采用13体积当量甲基异丁基酮、2.6体积当量乙酸乙烯酯和0.25重量当量无水硫酸钠进行实施例4的方法。3.75小时后，有37％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例14采用通过将试剂级的MIBK与氯化钙搅拌而制得的无水甲基异丁基酮(H2O测不出，即少于0.05％)和1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。2小时后，有52.5％的外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例15采用试剂级甲基异丁基酮(少于0.5％H2O)和1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。2.5小时后，有52％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例16将0.1％(重量)水加到无水甲基异丁基酮中来进行实施例4的方法。3小时后，有52％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例17将0.5％(重量)水加到无水甲基异丁基酮中进行实施例4的方法。5小时后，有47.7％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例18将2％(重量)水加到无水甲基异丁基酮中来进行实施例4的方法。3.5小时后，有11.4％外消旋二醇转化成(S)-酯。
实施例19采用载于15重量当量的惰性载体(参见表IV)上的1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。所载的脂酶的制备是通过将1重量当量酶溶于20重量当量50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，并加入15重量当量惰性载体来进行的。将悬浮液于-78℃冷冻，并于环境温度和0.5mmHg压力下冷冻干燥2天。将所得干燥的固体研磨均匀，并直接用于反应中。
表IV
实施例20采用载于0.05重量当量Eupergit(TM)上的1重量当量猪胰腺脂酶进行实施例4的方法。所载的脂酶的制备是通过将1重量当量酶溶于2.5体积当量50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，并加入0.05重量当量Eupergit、在环境温度下搅拌72小时来进行的。然后滤出固体，按实施例19中所述方法进行冷冻干燥。所得干燥的固体直接用于反应中。2.5小时后，有28％外消旋二醇已被转化成(S)-酯。
实施例21将(S)-酯循环合成外消旋(+/-)-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-1，2-二醇在80℃将1重量当量(S)-2-羟基-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基乙酸酯溶于9体积当量甲苯中。滴加入4体积当量100TW苛性碱，并将混合物剧烈搅拌1小时，直到从有机相取样经GLC监测到所有酯都已完全水解成二醇为止。将混合物冷却至25℃，加入在4体积当量甲苯中的0.7重量当量对甲苯磺酰氯、和0.2重量当量溴化四丁基铵，将混合物在环境温度下剧烈搅拌直到通过GLC监测有机相表明所有二醇均被转化成环氧化物为止。分离出水相，并将甲苯溶液温热至60℃，滴加入0.9体积当量45％硫酸，并搅拌30分钟。将反应混合物冷却至25℃，分离有机层，加入50体积当量1M苛性碱将水层碱化至pH9。向该溶液中加入9体积当量MIBK。将溶液温热至65℃，搅拌，之后水层中加入氯化钠，搅拌并分离。将MIBK溶液冷却，结晶出外消旋二醇。滤出晶体，用冷MIBK洗涤，并晒干。该方法得到0.68重量当量二醇，将其经手性HPLC分析发现(R)-二醇的对映体过量为5-10％。
实施例22将S-(+)-二醇循环形成外消旋二醇将S-(+)-二醇(1当量)和对甲苯磺酰氯(1当量)在4体积当量甲苯中一起成浆，并搅拌。在30分钟时间内于环境温度下滴加4M氢氧化钠(2.5体积当量)。将反应混合物温热至40℃，并在此温度下保持30分钟。分离出甲苯层，而剩下的水层用另一份1体积当置的甲苯重新洗涤。合并甲苯萃取液，并在65℃在10分钟内缓慢加入到45％(v∶v)硫酸(0.3体积当量)溶液中。在此温度下再保持10分钟，然后冷却至25℃并用100TW氢氧化钠碱化至pH9。加入3体积当量水，并用4体积当量乙酸乙酯洗涤3次而从水溶液中萃取出二醇。合并萃取液，在50℃减压除去溶剂。该产物产生0.75当量二醇，53％(R)-对映体和47％(S)-对映体。
实施例23将S(+)-二醇循环形成富集的(R)-二醇在环境温度下于4体积当量的甲苯中，将S(+)-二醇(1当量)、对甲苯磺酰氯(1.1当量)和溴化四丁基铵(0.031当量)一起成浆。将混合物剧烈搅拌，在30分钟内加入4M氢氧化钠溶液(2.5体积当量)。将溶液再搅拌45分钟，直到所有S(+)-二醇都发生了反应。过滤全部反应混合物，滤饼用甲苯(0.5体积当量)洗涤。将滤液中下层的水相分离出，用水(4体积当量)稀释。然后用已经用于洗涤滤饼的1.5体积当量甲苯重新洗涤。然后用硅藻土重新过滤该溶液，以便进行相分离。分出甲苯层，合并所有甲苯级份，然后用水重新洗涤。分离甲苯层，体积减少至3.5体积当量。向该甲苯溶液中于1小时内在25℃下加入25℃的硫酸(1.5M，2.25体积当量)，并搅拌24小时。然后将反应混合物加热至65℃，在此温度下保持2小时，然后冷却至室温。分离水层，抛弃有机层。水层用100Tw氢氧化钠碱化，将溶液冷却至10℃，从该溶液中结晶出二醇，滤出并晒干。回收到0.79当量二醇。这相应于73.5％R-二醇和26.5％S-二醇。
权利要求
1.制备旋光的式(I)化合物的方法 其中R和R1独立地为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-C4烷基杂环，所述每个基团任选被取代，条件是R和R1不相同，并且*是一旋光手性中心；该方法包含(a)用水解酶处理外消旋的式(II)化合物 其中R和R1如前所定义，且R2为烷基、芳基或芳烷基，它们各自任选被取代；或(b)用水解酶在酰基给体的存在下处理外消旋的式(III)化合物 其中R和R1如前所定义；并且将(a)和/或(b)的旋光产物转化成旋光的式(I)化合物。
2.制备旋光的式(II)或(III)化合物的方法 其中R和R1独立地为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-C4烷基杂环，所述每个基团任选被取代，条件是R和R1不相同，并且*是一旋光手性中心；该方法包含在酰基给体的存在下，用水解酶处理式(II)化合物，或用水解酶处理式(III)化合物，并任选分离所需的旋光酯或二醇。
3.按照权利要求1或2的方法，其中水解酶是脂酶、酯酶、磷酸酯酶、酰胺酶、肽酶、硫酸酯酶、腈水解酶或糖苷酶。
4.按照权利要求1、2或3的方法，其中水解酶为脂酶或酯酶
5.按照权利要求1至4中任何一项的方法，其中酰基给体为烷基酯或链烯基酯或式RCO2H的酸，其中R为烷基。
6.按照权利要求5的方法，其中酰基给体为链烯基酯。
7.按照权利要求1至6中任何一项的方法，其中外消旋的式(III)的二醇是用水解酶在含有0.5％(重量)或更少量的水的溶剂的存在下进行处理的。
8.按照权利要求7的方法，其中向溶剂中加入水合的或无水盐或其混合物。
9.按照权利要求1至8中任何一项的方法，其中外消旋的式(III)的二醇是用水解酶在含有氮气的气流的存在下进行处理的。
10.按照权利要求1至9中任何一项的方法，其中用水解酶处理式(III)的二醇是在30～80℃温度下进行的。
11.按照权利要求1至10中任何一项的方法，其中旋光的式(III)的二醇被分离出来，并且或者(a)浓缩有机溶液，并加入旋光的式(III)的二醇作晶种，以便选择性地从混合物中结晶出旋光的式(III)的二醇，或者(b)除去有机溶剂，所得的油状物用不同的有机溶剂研制，由此可从混合物中结晶出所需的旋光的式(III)的二醇。
12.按照权利要求11的方法，其中不同的有机溶剂为二氯甲烷。
13.按照权利要求1至12中任何一项的方法，其中在水解酶处理后，还有一个附加的步骤，即将不需要的旋光的酯或二醇循环制成相应的外消旋的式(III)的二醇。
14.按照权利要求13的方法，其中将不需要的旋光的式(II)的酯循环以形成相应的外消旋的式(III)的二醇是如下进行的通过加入碱的水溶液来水解旋光的式(II)的酯，或者分离相应的式(III)的二醇、或者在碱的水溶液中用任选取代的芳基或烷基磺酰卤任选在相转移催化剂的存在下处理相应的二醇，形成相应的旋光的式(I)的环氧化物，并且用酸的水溶液水解旋光的环氧化物，得到外消旋的式(III)的二醇。
15.按照权利要求13的方法，其中将不需要的旋光的式(III)的二醇循环形成外消旋的式(III)的二醇是如下进行的使旋光的式(III)的二醇与芳基或烷基磺酰卤于溶剂中并任选在相转移催化剂的存在下发生反应，形成相应的旋光的式(I)的环氧化物，并用酸的水溶液水解旋光的环氧化物，得到外消旋的式(III)的二醇。
16.按照权利要求1至15中任何一项的方法，其中R和R1独立地为苯基、苄基、C3-7环烷基、C1-10烷基、C1-10链烯基、C1-10炔基、C1-10烷氧基、C1-10烷氧基烷基、1，2，4-三唑、-CH2-1，2，4-三唑、1，3，4-三唑、咪唑、嘧啶、吡嗪、噁唑或吡唑，它们各自任选被取代。
17.制备式V化合物的方法 其中R5为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-4烷基杂环，Y为一任选的取代基，X为卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、羟基、磺酰基、或苯基，且n为0-5，该方法包含下列步骤(i)制备式(IV)化合物 其中X和n如前所定义，(a)用水解酶处理下式化合物 其中X和n如前所定义，或(b)用水解酶在酰基给体的存在下处理下式化合物 其中X和n如前所定义；(c)将(a)和(b)的旋光产物转化成旋光的式(IV)的环氧化物(ii)在有机溶剂中在碱的存在下，将旋光的式(IV)的环氧化物转化成旋光的式(V)化合物。
18.水解酶在制备旋光的式(II)的酯或旋光的式(III)的二醇方面的应用 其中R和R1独立地为烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或C1-C4烷基杂环，所述每个基团任选被取代，条件是R和R1不相同，并且*是一旋光手性中心。
19.按照权利要求1至16和18中任一项的方法或应用，其中R为苯基或卤代苯基，且R1为C1-4烷基-1，2，4-三唑。
20.下式化合物及其对映体形式 其中R2为烷基，X为卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、羟基、磺酰基或苯基；且n为0-5。
全文摘要
由相应的外消旋的酯或二醇通过用水解酶处理而制备旋光的式(I)化合物的方法，其中R和R
文档编号C12P17/10GK1124982SQ9419230
公开日1996年6月19日 申请日期1994年4月15日 优先权日1993年4月16日
发明者A·J·布拉克, R·A·霍尔特, A·G·布卢斯特, R·J·科普兰 申请人:曾尼卡有限公司, 持田制药株式会社