专利名称：哺乳动物细胞系和获得糖蛋白的方法
Epstein—Barr病毒是引起人类传染性的单核细胞增多症的病原体，这种病是年轻人中最常见的传染病之一。
90％以上的成人已受Epstein—Barr病毒感染。那些EBV阳性的人们以后可能发病如鼻炎癌、B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，某些何杰金(Hodgkin)淋巴瘤，并且可能发生其它的恶性疾病。已经报道，在原发感染或后继阶段发生慢性形式，稀有病例中，发生急性致死形式。
既然儿童中的Epstein—Barr病毒感染在临床上是难以察觉的，而且用表达Epstein—Barr病毒膜抗原gp250/350(BLLF—1阅读框，Baer等，1984)的重组疫苗病毒接种可以赋予对感染和/或疾病的抗性，必然假定，抵抗与Epstein—Barr病毒有关的疾病的疫苗是有可能的。
由于活疫苗的可能的副作用，开发纯蛋白疫苗是一个重要目标。既然Epstein—Barr病毒膜蛋白gp 250/350(BLLF—1)是高度糖基化的，并且这种翻译后修饰是正确免疫原性的重要因素(Emini等，1988)，那么，在可生产糖蛋白的真核生物细胞中以gp 250/350(Epstein—Barr病毒的阅读框BLLF—1)为基础开发疫苗是很有前景的。
本发明涉及哺乳动物细胞系，特别是稳定表达作为Epstein—Barr病毒抗原的糖蛋白(gp 250(220))，糖蛋白(gp 350)和/或杂交糖蛋白(gp 250(220)/(gp 350)的仓鼠细胞系(尤其是在无蛋白培养基中)，由此可避免通过补充培养基而受病毒或细菌污染的危险。本发明还涉及生产上述糖蛋白的方法。
稳定表达作为EBV抗原的gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350的仓鼠细胞系是公知的；参见，例如，Motz等，在Gene，44(1986)，353—359和Vaccines，87(1987)，374—379，以及Gu Shyan等，在100 Jahre Blutserum—Therapie 1890—1990，Halle(Saale)，(1991)，93—100。然而，尚不知道可用来稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系。根据Motz等，在Vaccines 87(1987)，374—379，376中的报道，病毒外源糖蛋白在CHO细胞膜中的整合超过某一点时，会是毒性的。
根据本发明的一个实施方案，通过下面的遗传学方法提出一种仓鼠细胞系，该细胞系稳定地表达和分泌上述糖蛋白，通过下述方法得到—用表达上述糖蛋白而不是膜锚蛋白(Membrananker)的载体转感细胞系(Motz等，1987)，—其中，载体含有一种细胞系所没有的选择标记，—培养细胞系，利用选择标记选择出一旦选择因子(抑制剂)被消除就能稳定地表达和分泌糖蛋白的细胞。
另外的实施例提出在无蛋白培养基中生产稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系的方法的应用，它是通过下述步骤得到的(A)从没有选择标记的仓鼠细胞系(宿主细胞系)开始，该选择标记后来被按照(A)(d)染色体整合的载体表达，或被按照(B)染色体整合的载体表达(重组细胞系)，(a)在含血清培养基中培养细胞，并使它们附着在底物上或相互附着，(b)重复更换部分被消耗的培养基，同时逐步降低培养基的血清含量，最后对其进行无血清培养在此—不主动地消除细胞的附着，—可选地，使细胞球形体形成和分开，分离分开的细胞球形体，在悬浮液中培养同时摇动，选择出在小团粒中生长的或单个生长的细胞(c)最后，使选择出的细胞经过权利要求1的步骤，或者(B)使如权利要求1所述的仓鼠细胞系经步骤(A)(a)至(A)(b)。
由于初始细胞系既不能在无血清培养基中转染也不能在无血清培养基中培养，所以使初始细胞系或宿主细胞系在含血清培养基中，例如在MEMα-或α-＋5％FCS中生长。这种培养基的例子是DIF1000，RPMI 1640，ASF 103和HDB。
为实现在无蛋白培养基中的生长，存在三个相互关联的问题。
1.例如，在使用培养瓶时，利用培养基血清消耗过程中的附着。这种方法的结果是正生长刺激。另外，消耗的旧培养基和死细胞以及溶胞作用的产物能被简便而温和地分离(不用离心)。
2.为确保血清消耗过程中培养基良好的自我调节能力，只重复更换部分培养基。
3.使细胞进行缓慢搅拌下的长期培养，例如在有球形体形成的悬浮培养物的旋转瓶中。对降低的附着趋势的特定选择使在小团粒中生长的或单个生长的细胞得以分离。首先，分离出大的球形体。然后，在低g值下使上清液分级离心，分离出的小球形体和单个细胞用于进一步转接。
当采用权利要求2中所述方法时，在下面的无蛋白培养基中的生长是可能的。下文中，培养基用来指代SMIF(Scharfenberg′s改良Iscove′s培养基，F12培养基)。它是一种特别加富培养基，由约11 Iscove′s改良Dulbecco′s培养基和Ham′s F12营养物(IF)的混合物组成，可以向其中加入例如腐胺(如1.2微摩尔升-1)和L—羟脯氨酸(如153微摩尔升-1)(SMIF1)。另外，对悬浮液中的生长，为螯合二价离子、改善代替无血清培养基(SMIF2)中常采用的蛋白成分运铁蛋白的无机铁的有效性，应优选加入螯合剂，例如，金红三羧酸(ATA，如3微摩尔升-1)(Bertheussen，1993)，EDTA(如4.3微摩尔升-1)和柠檬酸(如40微摩尔升-1)。
根据本发明的特定实施方案，从中国仓鼠细胞系(CHO)，如CHO K1＝ATCC CCL61，或从小仓鼠肾脏细胞系(BHK)，如BHK21C13＝ATCC CCL10开始，可以得到仓鼠细胞系。
如果根据本发明，能产生世代时间为例如15至40小时，特别是20至30小时、稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系，这种成就必被视为有创造性的，因为，至今没有人不使用选择性遗传操作而成功地在无蛋白培养基中培养仓鼠细胞系。至今，一般认为，要表达所需基因产物，必须借助遗传工程使哺乳动物细胞系在无蛋白培养基中生长(NSO Cell line，Hassel等，1992)。
至于选择标记和抑制剂的选择，熟练人员可根据已有的相关技术。合适的选择标记的一个例子是二氢叶酸还原酶基团(DHFR基因)，合适的抑制剂的一个例子是氨甲蝶呤(MTX)(Motz等，1987)。
本发明的一个特定实施方案是仓鼠细胞系CHO pPMDIIIGP-TR－PFC6＝DSM ACC 2121。
根据本发明，经下述步骤得到gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350，(a)培养本发明的细胞系，使表达所需糖蛋白，(b)从培养基中分离细胞，特别是借助微量过滤，(c)再借助超滤，特别是交叉流超滤，浓缩和纯化清澈的粗上清液，(d)再用阴离子交换柱纯化，(e)超滤以及(f)凝胶过滤，得到最后的纯糖蛋白(gp)级分。
根据本发明的方法，可以得到天然形式和糖基化形式的糖蛋白。它们因此具有天然的抗原性潜力。由此方法得到的疫苗因而显示与活性EB病毒的各种蛋白质相一致的抗原性特征。得到的疫苗是一种具有高抗原性保护潜力而没有致病潜力的安全疫苗。因为没有产生病毒逆转的可能，也没有灭活病毒的最小危险和毒性，所以就安全性而言，重组疫苗优于灭活疫苗或减活疫苗。
实施例1CHO pMDIIIGPTR—PFC6的获得按照Motz等，在Gene，44(1986)，353—359，Motz等，在Gene，58(1987)，149—154和Vaccines，87(1987)374—379中所述方法，用质粒pMDIIIGP转染源于缺少二氢叶酸还原酶基因(dhfr—1)的细胞系CHO K1＝ATCC CCL61的克隆。培养细胞，用氨甲蝶呤(MTX)选择出即使不用抑制剂能稳定地表达gp 250/350的克隆。稳定表达gp 250/350的克隆被称为CHO C6。实施例2在无蛋白培养基中培养CHO C6在标准的细胞培养条件下进行培养。在1至2个培养瓶(185cm2，体积约40至50ml；Falcon)中的IF培养基中培养CHOC6，直至细胞完全铺满。在一些情况下已形成多层。随后，通过每次用新鲜、预热过的SMIF1更换含有活和死游离细胞以及溶胞产物的旧培养基的4/5，以1，0.2，0.04和0.008％的FCS含量，逐步进行FCS的稀释。如果在低FCS含量下培养基中形成游离的球形体，它们在移出培养基之前可以沉降。更换的时间取决于活力和培养条件，分别决定，最后，培养物上清液营养物含量太低。用于更换的优选标准值是葡萄糖含量约为0.7至1g/l。为补充未分解的营养物，至少在一周后更换少量培养基。
当培养物消耗到FCS含量为0.008％时，用新鲜、无蛋白、预热过的SMIF1更换全部培养基，进一步在培养瓶中培养。如果在这些条件下，已经有足够量的球形体形成或分开，就将这些球形体转入一个小旋转培养瓶(最小体积40ml)中，约40rpm下在40mlSMIF1(1/4旧条件培养基的＋3/4新鲜培养基)中培养。如果细胞不分开，只能用酶法将细胞层从底物中分离，就象通常用来转接附着细胞所做的那样。用SMIF1培养基洗涤两次以使细胞分开后，从蛋白酶中提取出那些在此条件容易聚集的细胞，在此之前，细胞也可转移至小旋转瓶中。
在旋转瓶中培养细胞，直至得到低于40小时的世代时间，培养物在小球形体中生长。在培养基中残留葡萄糖标准值为0.5至1g/l时，进行转接。选择性地转接小球形体和单个细胞。为此目的，在一短时间内不搅拌培养悬浮液，以使大球形体分开。然后，通过离心移出上清液(100g)。菌丝球中的细胞转入下代。通过加入20—30％(体积)已经由过滤或离心从死细胞或细胞碎片中清洗出的前代培养基来调节培养基。
两个适应实验的全过程，每个都需两个月。实施例3从培养物上清液中处理和纯化重组蛋白质I.交叉流超滤，再进行循环缓冲为此目的，使用经微量过滤的无蛋白SMIF1或SMIF2中的发酵产物，即得自直至1l规模的连续环流培养物，或从10l气升式发酵器中的分批培养物。为过滤，使用具有100kD公称截留分子量的滤罩(Millipore或Filtron)。交叉流超滤过程中，使用下述标准值(相对随机地选择)—跨膜压力不超过约1巴；—管路中存在的要过滤的粗上清液的约1/3从体积流动中以滤液形式移出；这相当于每一滤罩大约2—3升滤液，吸取能力为如8升/分钟。—在缓冲交换过程中，使用更低的泵唧本领。
概括地提出下列步骤。前两个步骤可以省去，但它们能提高产率。
1.测定产物总体积，为控制膜，即通过给膜加载和使其极化来调节恒定有效的过滤截留分子量，产生约15％(体积)滤液(以正常过滤条件下的体积流动计)。
2.上述滤液返回到残留物(Retentat)。
3.实际的交叉流超滤进行到残留物降至初始体积的1/50.为止。然而，可以进一步浓缩残留物，尤其是通过使用无蛋白培养基。
4.达到终体积时，缓冲—交换并洗涤初级残留物。为此，用磷酸缓冲液(20mM；pH7)充满残留物至双倍体积(包括泵和超滤系统的死体积)，每次重新将残留物浓缩至最小体积，如此进行3至4次，为进一步处理提供残留物。这一步骤用于除去低分子外源蛋白质，降低后继纯化步骤的离子强度。II.用阴离子交换柱纯化使用下述设备。
柱材料Q—Sepharose High Performance(Pharmacia的一种生物处理材料缓冲体系缓冲液A20mM磷酸缓冲液(pH5.1)缓冲液B含1M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH5.1)规模例如，装有FPLC和1ml柱体积的HR5/5柱的小规模(Pharmacia)；可能放大。
流速恒定的5.1cm/min，相当于HR5/5柱中的1ml/min。
用MiliQ处理水将超滤残留物稀释至电导为3ms，用HCl调节pH至5.1(例如，为分离大量外源蛋白质，先调至pH4.2再调至5.1)。通过离心除去浑浊。然后，通过FPLC泵给柱加入清澈的上清液，同时加入5％份缓冲液B来洗脱第一种外源蛋白质。最大负荷约为8mg总蛋白/ml凝胶。之后，通过达0.4M NaCl的梯度(梯度高于22倍柱体积)洗脱蛋白质。
在0.15和0.35M NaCl之间，洗脱掉所需gp 250/350蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后精确地选择出准备进一步纯化的级分。不加入缓冲液B以及在不同的pH(例如pH7)下也能完成蛋白质负载和分离。对色谱法中的gp蛋白质，进样过程中较低的pH和加入缓冲液B可提高容量。
如果使用磷酸缓冲液，后继处理步骤之前的循环缓冲步骤可以省略。然而，其它缓冲体系如柠檬酸缓冲液也是有用的。III.超滤在凝胶过滤柱上通过超滤将步骤II中选择和收集的蛋白质级分浓缩到约1/10至1/20。蛋白质最终浓度在例如1至2mg/ml的范围内。Minicon CS15室(Amico)用于超滤。(在更大的溶剂体积下，可考虑采用相应具有更高容量的更大装置。例如，搅拌细胞或交叉流超滤元件)。IV.用凝胶过滤法纯化柱材料用Superose6(Pharmacia)预填充的HR10/30柱；用于放大，采用XK 26/100柱中的Sephacryl S—300 High Resolution和Sephacryl S—400 High Resolution。
缓冲体系20mM磷酸缓冲液(pH7)中的同溶剂100或200mMNaCl。
流速例如，2—2.5mm/min。
例如，柱平衡后，用10g蛋白(先被浓缩(CS15)，通过离心从中除去浑浊物)每ml凝胶。以大约2.5mm/min的流速洗脱并分离。收集那些含有gp 250和/或gp 350、经PAGE和银染色后没有可见污染的洗脱级分。
可在约-20℃下、在凝胶过滤法收集的gp级分中以冷冻形态稳定贮藏纯gp 250/350。纯化步骤仅有约25—40％粗产品的总产率。对比实施例1重复进行实施例2，不同的是，血清消耗阶段不允许细胞铺满，当消除细胞附着之后进行FCS的消耗。用这种方法，不能实现细胞在无蛋白培养基中的生长。
文献Baer，R.et al.DNA sequence and expression of the B95-8Epstein-Barr virus genome.Nature，310(1984)207-211.Bertheussen，K.Growth of cells in a new defined protein-free medium.Cytotechnology，11(1993)，219-231.Emini，E.A.et al.Antigenic Analysis of the Epstein-Barrvirus major membrane antigen(gp 350/220)expressed in yeastand mammalian cells；implications for the development of asubunit vaccine.Virology，166(1988)387-93.Gu，S.et al.On the first EBV vaccine trial in humans usingrecombinant vaccina virus expressing the major membraneantigen.Proceedings of the Vth International Symposium on″Epstein-Barr virus and associated Diseases″，Annecy，1992(1993).Hassel，T.et al.Stability of recombinant antibodies fromglutamine synthetase amplified CHO and NSO cell lines.InAnimal Cell TechnologyDevelopments，Processes and Products(Spier，R.E.，Griffiths，J.B.，MacDonald，C.，eds.)Butterworths-Heinemann，Oxford，(1992)42-47.Motz M.et al.Truncated versions of the two major Epstein-Barr viral glycoproteins(gp 250/350)are secreted byrecombinant Chinese hamster ovary cells.Gene，58(1987)149-154.
权利要求
1.在无蛋白培养基中稳定地表达作为Epstein—Barr病素抗原的糖蛋白(gp)250(220)、糖蛋白(gp)350和/或杂交糖蛋白(gp)250(220)/(gp)350的哺乳动物细胞系，它是通过下述步骤得到的(A)从没有选择标记的仓鼠细胞系开始，该选择标记后来被按照(A)(c)所述方法进行染色体整合的载体表达，或被按照(B)所述方法进行染色体整合的载体表达，(a)在含血清培养基中培养细胞，并使它们附着在底物上或相互附着，(b)重复更换部分被消耗的培养基，同时缓慢降低培养基的血清含量，最后对其进行无血清培养—不主动地消除细胞的附着，—可选地，使细胞球形体形成或分开，分离分开的细胞球形体，在悬浮液中培养同时摇动，选择出在小团粒中生长的或单个生长的细胞(c)最后，使选择出的细胞经过如下处理步骤，(ca)用表达上述糖蛋白(gp)的载体转染细胞系，其中，载体含有一种细胞系所没有的选择标记，(cb)培养细胞系，利用选择标记选择出一旦不再使用选择因予(抑制剂)就能稳定地表达糖蛋白的细胞，或者(B)使哺乳动物细胞系首先经过处理步骤(A)(ca)和(A)(cb)，再经过处理步骤(A)(a)至(A)(b)。
2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞系，其特征在于，将一种仓鼠细胞系，特别是中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)如CHO K1＝ATCC CCL61或小仓鼠肾脏细胞系(BHK)如BHK 21 C13＝ATCC CCL10作为该哺乳动物细胞系。
3.如前述任何权利要求所述的仓鼠细胞系，其特征在于，将二氢叶酸还原酶基因(DHFR基因)用作选择标记，将氨甲蝶呤(MTX)用作抑制剂。
4.仓鼠细胞系CHO K1 pMDIHGPTR—PFC6＝DSM ACC2121。
5.生产糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或杂交蛋白质(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按权利要求1至4任何权项所述方法培养细胞系，使其表达所需糖蛋白并将糖蛋白分泌到培养基中，(b)从培养基中分离出糖蛋白。
6.生产糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或杂交蛋白质(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按权利要求1至4任何权项所述方法培养细胞系，使其表达所需糖蛋白并将糖蛋白分泌到培养基中。(b)从培养基中分离出细胞，特别是利用微量过滤，(c)用交叉流超滤法进行浓缩和纯化，(d)然后，借助阴离子交换柱纯化，(e)超滤和
全文摘要
本发明涉及哺乳动物细胞系，特别是能以稳定形式表达作为Epstein-Barr病毒抗原的糖蛋白gp250(220)，350和250(220)/350的仓鼠细胞系，还涉及从无蛋白培养基中培养的细胞中获得糖蛋白的方法。
文档编号C12N5/10GK1124502SQ94192251
公开日1996年6月12日 申请日期1994年4月26日 优先权日1993年4月26日
发明者H·沃尔夫, K·查尔芬伯格, R·瓦格纳 申请人:H·沃尔夫