专利名称：一种筛查苯丙酮尿症药盒及其制造方法
技术领域：
本发明属于一种体外诊断用药盒，涉及细菌培养和血液生化分析—一种筛查苯丙酮尿症药盒及其制造方法。
苯丙酮尿症(phenylketonuria，缩写为PKU)是一种常见的遗传代谢性疾病。典型PKU是由于苯丙氨酸羟化酶先天缺陷而引起的。患儿如不及对治疗必然导致智能发育落后，直到呆傻，给家庭和社会造成严重后果。通过筛查及早发现该病，则完全可以作到早期诊断，早期治疗，是预防患儿智力低下的有效途径，这对优生优育提高人口素质有重要意义。自1961年盖塞尔建立细菌抑制法早期筛查新生儿PKU以来，世界上许多国家先后开展了此项筛查工作。该法是利用枯草杆菌的变异菌株生长时需要苯丙氨酸，当在培养基中加入拮抗剂可抑制枯草干菌生长。如血中苯丙胺酸的含量增高时，细菌生长菌环变大，反之，则小。根据菌环生长大小与已知标准血片苯丙氨酸菌环进行对比，即可得出血样中苯丙氨酸含量。目前我国虽在北京、上海等大城市开展了部分新生儿PKU筛查工作，但所用试剂均由各医院自行配制，有些试剂需要进口。枯草杆菌的浓度也不确定，并以液体形式保存，致使保存期短，运输不方便。如北京友谊医院、中国医学科学院基础医学研究所和北京儿童疾病筛查中心分别采用自行建立的非标准方法，检查出的结果只能用于定性，在其本医院内应用，没有普遍临床参考价值和流行病学意义。
本发明的任务在于克服现有技术的不足，开发研制出一种标准的、半定量的、具有普遍临床意义的苯丙酮尿症筛查药盒，为新生儿的苯丙酮尿症的筛查提供一种简便、快捷、准确、稳定的检测手段，保证新生儿健康发育。
本发明的任务是通过以下方式完成一种苯丙酮尿症筛查药盒由培养基、标准菌种、菌种抑制液、样品采集纸、细菌培养盘和标准血片组成，其特征在于培养基为氨基酸盐溶液和含糖琼脂，标准菌种为冻干枯草杆菌，浓度为3×105-3×106个/ml，菌种抑制液为浓度0.0008±0.0002M的β-2-噻嗯丙氨酸，样品采集纸厚度为0.6±0.2mm、扩散直径6mm/7μl的棉浆纸，细菌培养盘为底部划有小方格的方盘，将80-100ml培养基倒入后，培养基厚度为3.0±0.5mm，标准血片苯丙氨酸浓度分别为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml。上述药盒的制造方法是一、培养基1、氨基酸盐溶液(1)盐溶液将MgSO4·7H2O 10.0±1.0g、MnCl2·4H2O1.0±0.2g和FeCl3·6H2O 1.0±0.2g，先用蒸馏水溶解，再加蒸馏水至1000ml。
(2)氨基酸溶液将KH2PO430.0±5.0 g、K2HPO410.0±2.0g、NH4Cl 5.0±1.0g、NH4NO31.0±0.2g、Na2SO31.0±0.2g、L-谷氨酸1.0±0.2g、L-丙氨酸1.0±0.2g和天冬素1.0±0.2g加蒸馏水溶解，稀释到890ml。
将890ml氨基酸溶液和10ml盐溶液混匀，即为氨基酸盐溶液。
2、培养基溶液将1.2g琼脂加水4ml，加氨基酸盐溶液39ml，加20％蔗糖溶液2ml混匀，即为培养基。二、冻干枯草杆菌以脱脂鲜奶或鲜血浆为支持物，在-30℃、4帕下，冻干4-6小时，其浓度为3×105-3×106个/ml。三、枯草杆菌抑制液配制0.0008±0.0002M的β-2-噻丙氨酸。四、细菌培养盘及盘盖用有机玻璃制成底部划有小方格的方形盘。将80-100ml培养基倒入后，厚度达3.0±0.5mm，并设有相应的盘盖。五、标准血片将苯丙氨酸浓度为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml分别滴在棉浆纸上，自然干燥。使用本发明药盒的具体操作步骤1、将培养基瓶盖拧松，放入水浴中，逐渐加热至沸，使琼脂融化，再冷却至60-65℃。
2、将枯草菌抑制液加入冻干枯草杆菌中，放入60-65℃水浴中，加热10-15分钟后，倒入上述培养基中，并趁热注入培养盘中，该盘水平放置，培养基厚度为3.0±0.5mm。
3、标本收集及处理出生后吃过六次奶的新生儿，从其足跟取血，用采血纸蘸取一滴，使之渗透纸的反面后，自然干燥。用打孔钳取3mm直径该血片一枚，放入纸袋中以15磅压力、3分钟加热处理，同时用打孔钳取不同浓度标准血片，分别放入纸袋中一并加热处理。
4、培养培养基冷却后，用镊子将血片按规格顺次排列。血片贴完后先在室温下放置片刻，再置入36-37℃培养箱16-17小时。
5、结果判定取出培养盘观察菌环大小，并与标准血片的菌环大小进行比较，确定含量。正常值苯丙氨酸浓度应小于4mg/100ml，大于4mg/100ml者视为阳性，应作进一步分析，可进行追访重新取血复查，如仍呈阳性，应用荧光法或氨基酸分析仪作苯丙氨酸定量，以便确诊。
以下结合本发明的一个实施例作进一步详述一种苯丙酮尿症筛查药盒由培养基、标准菌种、菌种抑制液、样品采集纸、细菌培养盘、标准血片组成，其特征在于培养基为氨基酸盐溶液和含糖琼脂，标准菌种为冻干枯草杆菌，浓度为3×106个/ml，菌种抑制液为浓度0.0008M的β-2-噻嗯丙氨酸。样品采集纸厚度为0.5mm，扩散直径6mm/7ml的棉浆纸，细菌培养盘为底部划有小方格的方盘，将100ml培养基倒入后，培养基厚度为3.5mm，标准血片含苯丙氨酸浓度分别为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml。
上述药盒的制造方法一、培养基1、氨基酸溶液(1)盐溶液将MgSO4·7H2O 10g、MnCl2·4H2O 1g和FeCl3·6H2O 1g，用蒸馏水溶解后，加蒸馏水至1000ml。
(2)氨基酸溶液将KH2PO430g、K2HPO410g、NH4Cl 5g、NH4NO31g、Na2SO31g、L-谷氨酸1g、L-丙氨酸1g和天冬素1g加蒸馏水溶解，稀890ml。
将10ml盐溶液加入890ml氨基酸溶液，混匀，即为氨基酸盐溶液。
2、培养基溶液将1.2g琼脂加水4ml，加氨基酸溶液39ml，加20％蔗糖溶液2ml混匀，即为培养基，按此配比关系制备100ml培养基。二、冻干枯草杆菌以脱脂鲜奶为支持物，在-30℃、4帕下冻于4.5小时，其浓度为3×106个/ml。三、枯草杆菌抑制液配制浓度为0.0008M的β-2-噻嗯丙氨酸。四、细菌培养盘及盘盖用有机玻璃制成，方形扁盘，底部划有小方格，100ml培养基倒入后，厚度达3mm，并设有相应的盘盖。五、标准血片将浓度分别为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml的苯丙氨酸滴在棉浆纸上，自然干燥。
利用本发明药盒于1992年共筛查新生儿2816例，发现苯丙酮尿症5人，高苯丙氨酸血症5人。对初筛阳性者经重新取血复查，同时用荧光法作苯丙氨酸定量分析，符合率为100％。
本发明与现有技术比较有以下优点该药盒试剂分配合理，使用方便，价格便宜，易于保存运输，有效期长，结果特异性强，灵敏度高。全部试剂皆为国产。
经实验，冻干菌种与原菌悬液比较，不同浓度标准血片在培养基上生长良好，菌环直径大小变化明显，菌环边缘同样清楚。
权利要求
1.一种筛查苯丙酮尿症药盒及其制造方法，它是由培养基、标准菌种、菌种抑制液、样品采集纸、细菌培养盘和标准血片组成，其特征在于培养基为氨基酸盐溶液和含糖琼脂，标准菌种为冻干枯草杆菌，浓度为3×105-3×106个/ml，菌种抑制液为浓度0.0008±0.0002M的β-2噻嗯丙氨酸，样品采集纸厚度为0.6±0.2mm，扩散直径6mm/7μl的棉浆纸，细菌培养盘为底部划有小方格的方盘，将80-100ml培养基倒入后，培养基厚度为3±0.5mm，标准血片苯丙氨酸浓度分别为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml。
2.根据权利要求1所述的苯丙酮尿症筛查药盒的制造方法，其特征在于(1)、培养基(一)氨基酸盐溶液①盐溶液将MgSO4·7H2O 10.0±1.0g、MnCl2·4H2O1.0±0.2g和FeCl3·6H2O 1.0±0.2g，先用蒸馏水溶解，再加蒸馏水至1000ml。②氨基酸溶液将KH2PO430.0±5.0g 、K2HPO410.0±2.0g、NH4Cl 5.0±1.0g、NH4NO31.0±0.2g、Na2SO31.0±0.2g、L-谷氨酸1.0±0.2g、L-丙氨酸1.0±0.2g和天冬素1.0±0.2g加蒸馏水溶解，稀释到890ml。将上述890ml氨基酸溶液加10ml上述的盐溶液混匀，即为氨基酸盐溶液。(二)培养基溶液将1.2g琼脂加水4ml，加氨基酸溶液39ml，加20％蔗糖溶液2ml混匀，即为培养基。(2)、冻于枯草杆菌以脱脂鲜奶或鲜血浆为支持物，在-30℃、4帕下冻干4-6小时，其浓度为3×105-3×106个/ml。(3)、枯草杆菌抑制液配制浓度为0.0008±0.0002M的β-2-噻嗯丙氨酸。(4)、细菌培养盘及盘盖用有机玻璃制成，方形扁盘，底部划有小方格，80-100ml培养基倒入后，厚度达3±0.5mm，并设有相应的盘盖。(5)、标准血片将浓度分别为2、4、6、8、10、16、20mg/100ml的苯丙氨酸滴在棉浆纸上，自然干燥。
全文摘要
本发明涉及一种筛查苯丙酮尿症药盒及其制造方法，由培养基、标准菌种、菌种抑制液、样品采集纸、细菌培养盘和标准血片组成。其标准菌种为冻干枯草干菌，浓度为3×10
文档编号C12Q1/04GK1133343SQ9510367
公开日1996年10月16日 申请日期1995年4月10日 优先权日1995年4月10日
发明者王斌, 杨德厚 申请人:王斌, 杨德厚