专利名称：一种制备、分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法
技术领域：
本发明涉及酶蛋白的制备，分离与纯化，特别涉及的是乙酰乳酸合成酶的制备，分离与纯化。
为建立一种新的，分子水平的离体农药筛选方法，选用乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，以下简称ALS酶)为催化剂。ALS酶是一种黄素蛋白，在国际分类法中属4，它以高度的专一性和极高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，并放出二氧化碳。存在于细菌或植物组织中的ALS酶，丰度低，不稳定，保存期短，国内外均无标准物销售。本发明是从植物组织中提取ALS酶。经初步检索，美国专利US 5,084,086公开了除草剂对抗性作物的效果,US 5,206,135公开了氧敏感电极测ALS酶活性，两份专利涉及的是ALS酶的一般性论述及除草抗性和变异方面的问题。与本发明相近似的文献有[1]Shaner D.L.，Plant.Physiol.，植物生理学76，545-546(1984)[2]Giuseppe Forlanl，Weed Science杂草科学39，553-557(1991)[3]Oda Y.，J.Gen.Microobiol.，普通微生物学杂志128，1211-1216(1982)文献[1]，[2]中与ALS酶制备，分离，纯化有关的流程和组成参数归纳如下。1)原料与均匀化溶液之比为1克∶5毫升；均匀化溶液中，假底物选用的是乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，浓度为1,000-5,000μM；磷酸氢二钾缓冲液的浓度是50mM；辅酶用的是颉氨酸，亮氨酸；盐析富集只进行一步；所用硫酸盐的饱和度为20—50％；酶团溶解液中的底物丙酮酸浓度20mM；离心分离一步，27,000转/分。从上述各参数关系反映原料与均匀化溶液比值不合理，造成匀浆中含的ALS酶少。均匀化溶液和酶团溶解液中的底物含量又过大，致使分离纯化过程中酶促反应速率加快，降低了ALS酶的质量。另外工艺流程也不尽合理，匀浆过滤后，在滤渣中还有很多酶未被提取就直接进行离心分离。一步离心分离，速度又很快，有很多粗酶含在滤渣中而被弃去。盐析富集也仅一步，又不是在最佳盐析点下工作，工艺流程不够精细。由于以上原因，造成获得的酶质量不高，正如文献[3]和其它文献零星记载的，用一般方法获得ALS酶比活值为1—2μM/mg·hr，并指出在4℃下储存24小时，与原来相比活性降低46％，还有的记载保存期仅12小时—几天，这些参数都较低，不能满足分子水平的离体农药筛选方法中生物催化剂的实用规格要求。
本发明的目的是应用现代分子酶学理论进行系列科学实验，从禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中培养的乙酰乳酸合成酶在制备，分离与纯化时，优化出最适宜均匀化溶液的比例，组成，浓度及制定最佳的技术流程，获得最高比活值，最佳半衰期，最长保存期及稳定性好的ALS酶。该酶能满足新的，分子水平的离体农药筛选方法中作为生物催化剂的实用规格要求。
本发明的目的是这样实现的1.提供一种制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，缩写ALS)的方法，主要包括以下顺序步骤(1)提供禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种含乙酰乳酸合成酶的芽和胚组织为原料，与用ALS酶的底物，辅酶，稳定剂和缓冲液配制成的均匀化溶液，在常温常压下混合搅切制成组织匀浆，其中底物用丙酮酸钠，其浓度为10—30μM，原料与均匀化溶液之比为1克∶0.2—2.0毫升；(2)将组织匀浆过滤，滤渣用均匀化溶液反复浸取多次，合并滤液获得粗酶；(3)粗酶滤液分两步离心分离，离心速度第二步高于第一步，获得离心酶；(4)将离心酶分两步盐析富集，每步都在低温下加入硫酸盐，饱和度为30-70％，沉淀离心30分钟，离心速度16,000—20,000转/分，获得离心酶沉淀；(5)用ALS酶的底物，辅酶，缓冲液制成酶团溶解液溶解离心酶沉淀，获得的沉淀酶溶解液可用层析法，也可用透析反透析法纯化，由此得到高纯度的纯化酶，酶团溶解液中的底物用丙酮酸钠，其浓度为1—5mM。
2.原料的制备是将禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种的种子在冷水中浸泡后，均匀地放在铺有潮湿细沙或锯末上放尼龙网的培养盘中，盖上纱布，在室温下发芽，刚出芽时，加盖黑布避光培养。
3.均匀化溶液中的辅酶是选用氯化镁，硫胺素焦磷酸(TPP)，和黄素腺嘌吟双核苷酸(FAD)，这三种辅酶的浓度分别控制在0.3—1.0mM，0.3—1.0mM，和10—50μM范围；缓冲溶液是选用磷酸氢二钾，其浓度控制在50—150mM范围；再加入10—30％的丙三醇做稳定剂。
4.第一步离心分离速度是6,000—8,000转/分，第二步离心分离速度是14,000—20,000转/分，每次离心时间为20分钟。
5.盐析富集时的硫酸盐是硫酸铵，最佳饱和度是50％，所述的低温是0—4℃，沉淀离心，离心速度16,000—20,000转/分。
6.酶团溶解液中的辅酶选用氯化镁，浓度为0.3—1.0mM；缓冲溶液选用磷酸氢二钾，浓度为30—100mM；丙酮酸钠浓度为1—5mM。
7.配制的酶团溶解液可用做层析法中的淋洗液和透析法中的透析液。
根据上述步骤所确定的最佳技术流程如
图1所示。
做为生物催化剂的酶，要具有高的比活值才能提高催化反应的灵敏度，要有最佳半衰期，最长的保存期，才有使用价值，并且在使用中才能保持较平稳的灵敏度，避免提取的酶几天内就失效而造成损失。
根据现代分子酶学理论，酶与底物似“诱导适合”关系，即，为表现出酶的活性必需有底物和辅酶的存在，底物浓度的选择，既影响酶的活性，又涉及酶的保存。酶促反应在非适宜的条件下，也在缓慢发生而永不停止，直到酶活性完全丧失为止，所以底物浓度不宜太大。底物浓度大，酶促反应速率快，酶的活性丧失快，保存期也就短。因此适宜的底物浓度是获得最高比活值，最佳半衰期，和最长保存期的一个重要因素。再者，酶促反应是在辅酶的协同作用下进行的。辅酶是小的非蛋白分子和金属离子。本发明选用硫胺素焦磷酸(TPP)，黄素腺嘌呤双核苷酸(FAD)，镁离子为辅酶。若选用ZnSO4，MnSO4，虽能制备酶，但效果不好。TPP能使丙酮酸脱羧，并活化缩合反应所必须的中间产物。FAD能防止羟乙基—TPP中间产物质子化，镁离子能使酶全部活化，使ALS酶与TPP徐徐形成可逆络和物。下面实验了从三种不同组成的均匀化溶液中提取ALS酶对比活的影响，见表1。
表1.从三种不同组成的均匀化溶液中提取ALS酶对比活的影响
由表1说明，辅酶和少量底物或假底物的存在对保持酶活性是极其重要的。由此，通过大量实验确定了本发明在分离和纯化时溶液最适宜的组成及浓度。
本发明选用硫酸铵固体加入方式进行两步盐析富集。根据酶在低盐浓度下的溶解度随盐溶液浓度升高而增加，此后，当盐浓度再缓慢上升酶溶解度开始下降，继而沉淀析出的特点，确定了酶的最佳盐析点是硫酸盐饱和度为50％。
本发明所用原料及试剂在市场上均可购到。
本发明与现有技术相比具有的优点及显著效果
1.本发明方法的优点①在植物良种培养时采取的各项措施能有效地控制植物发芽，不发霉，不腐烂，并可获得最高含量的ALS酶。
②优选出最适宜的提取溶液组成和浓度。主要表现在ALS酶底物选取适宜的浓度，辅酶的配制，稳定剂的加入，原料与均匀化溶液的合理比例，和酶团溶解液的配制及浓度。这些都是提高酶的活性及保存期的有力措施。
③精细工艺流程的制定，如滤渣的反复浸取，两步离心，第一步离心速度低于第二步，两步盐析富集，这些都是防止酶夹杂在渣中而损失。以及使酶充份地沉淀析出，获得高活性，高浓度酶的有力措施。
2.本发明方法带来的显著效果①由于在制备，分离与纯化阶段采取了以上各种措施，因此使用本发明方法可获得优质酶，表现为A.ALS酶比活值高。离心酶比活测定值为10—12μM/mg·hr，纯化后可达223.44μM/mg·hr。酶的比活是其质量规格的一个指标。比活高，意味酶具有的催化效率也高。
B.ALS酶的保存期长，可保存30天。ALS酶离体后，由于其固有的不均匀性，不稳定性，很难贮藏。以至于在12小时到几天内完全失活，无法提供用于分子水平的离体农药筛选。本发明在提取分离过程中创造出一个与ALS酶在活体中相类似的环境。保存期间有适宜的底物浓度，既能稳定酶的活性中心，又能最大限度地降低酶促反应速率，所以保存期长。
C.ALS酶半衰期长由于ALS酶的比活值高，保存期长，所以半衰期长达7—8天。因而提高了实际利用价值，同时由ALS酶所创建的抑制剂筛选方法附加值高。
②在创制新农药中，新除草剂的开发是一个重要方面。对此，本发明提供的ALS酶是一种重要的实用型酶。由于采用本方法制备的ALS酶达到了筛选方法中做为生物催化剂的实用规格要求，即有高的比活值才能提高基于催化反应速率的测定方法的灵敏度；半衰期长和保存期长才能提供实际使用。因此为ALS酶抑制剂的筛选提供了有利保证。实践也证明了，用本法制备的ALS酶做靶标，在筛选各类化合物过程中，已发现了两种与氯磺隆具有同等抑制活性的新先导化合物。(此点在乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法申请案中有详述。)③提供了富集纯化酶的流程和最佳条件，使获得的纯化酶比活高达223μM/mg·hr，这为进一步对ALS酶做深入研究创造了条件。
以下通过实施例和附图对本发明作进一步介绍图1.本发明技术流程图；图2.Sephadex G-25凝胶层析柱的洗脱谱图；图3.酶的保存期及半衰期。
实施例1依据本发明确定的最佳技术流程进行介绍，如图1所示(1)ALS酶的培养以豌豆做豆科植物的代表。将良种豌豆在冷水中浸泡24小时，均匀放在铺有1厘米厚的潮湿细砂或锯末上放尼龙网的培养盘中，种子上盖纱布，在室温下发芽，刚出芽时，加盖黑布避光培养，取1-3厘米高的含乙酰乳酸合成酶的芽和胚组织作为提取ALS酶的原料。
(2)ALS酶的制备首先用水配制均匀化溶液，其中含K2HPO4100mM；底物丙酮酸钠10μM，辅酶氯化镁0.5mM，硫胺素焦磷酸(TPP)0.5mM，黄素腺嘌呤双核苷酸10μM；稳定剂丙三醇15％。按芽(克)∶溶液(毫升)＝1∶0.5的关系，称取200克原料与100ml的均匀化溶液，常温常压下混合。在加工机中搅切5分钟后制成组织匀浆。
(3)ALS酶的分离与纯化将组织匀浆经10层纱布，2层尼龙布过滤。过滤后的滤渣用均匀化溶液反复浸取3次，与上述滤液合并，获得粗酶溶液，滤渣弃去。
粗酶滤液分两步离心分离后获得离心酶。第一步离心速度为7,000转/分，第二步离心速度为15,000转/分，每次离心20分钟，离心后的滤渣弃去。
将离心酶分两步盐析富集，获得离心酶沉淀。操作在0—4℃下进行，硫酸铵固体加入，饱和度为50％。ALS酶蛋白不断沉淀析出，静置2小时后，再以20,000转/分的速度离心分离30分钟，溶液弃去。此时初步实现富集分离纯化的目的。
(4)ALS酶的进一步纯化首先用水配制酶团溶解液，其中含ALS酶的底物丙酮酸钠1mM，辅酶氯化镁0.5mM，缓冲液磷酸氢二钾50mM。
用酶团溶解液溶解离心酶沉淀，再溶解的酶需要脱盐去除硫酸根离子，脱盐技术可用层析法，也可用透析反透析法实现，由此得到高纯度的酶。
(ⅰ)凝胶层析法用直径为1厘米，高为100厘米的带水套的玻璃柱做层析柱，以SephadexG-25交联葡聚糖凝胶做柱填料。
称20克Sephadex G-25交联葡聚糖凝胶在200毫升蒸馏水中浸泡3小时，除去水及表面悬浮小颗粒，用200毫升0.5M NaOH和0.5M NaCl溶液在室温下浸半小时，抽滤洗碱至中性，用抽气方式去除气泡。
再用排水方式装柱。用100毫升的酶团溶解液做淋洗液平衡洗柱。柱顶进样3毫升的沉淀酶溶解液，以25滴/分钟的流速淋洗，使ALS酶缓慢通过凝胶层析柱分离。从柱下端出口收集酶活最高时的洗脱液，就是本发明要制备的纯化酶，见图2。图中○○○所示为蛋白曲线；●●●所示为酶活曲线；▲▲▲所示为硫酸根离子曲线。蛋白用Folin法测定；硫酸根离子用离子色谱法测定。
用100毫升水洗脱柱子，硫酸根可全部洗出，柱子待下次使用。
(ⅱ)透析反透析法选择透析值12,000—14,000，扁宽1.0英寸的透析袋，截取35厘米长，水中浸泡24小时，装入沉淀酶溶解溶液50毫升，二头扎紧封口。放入1000毫升透析液中。透析液选用的是酶团溶解液。在0-4℃下透析四次，每次5小时。取出放在聚乙二醇(PEG)6000中进行反透析，见透析袋缩小时为止。袋中的酶就是本发明要制备的纯化酶。
依据本发明的方法进行制备，分离与纯化，得到各种酶的比活测定结果见表2，其最高比活值为223.44μM/mg·hr。
表2.各种酶的比活
ALS酶的保存期从提取离心酶之日起进行监测，得到最长保存期为30天，最佳半衰期为7天，其结果见图3，图中A％为残活％。
实施例2选用大麦为禾本科植物代表。
实施例3选用玉米为禾本科植物代表。
实施例4选用苋草为苋，藜，蓼，旋花，十字花，茜草，菊，莎草，唇形，锦葵，和泽泻各科植物(农田杂草)的代表。
上述2，3，4三例的制备，分离与纯化的方法及依据的技术流程均和实施例1相同，所用化合物的组成也相同，各组成的浓度及有关参数不同，见表3。
表3.实施例1—4中使用的各项参数(采用原料100—500克)
表3. 续
权利要求
1.一种制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Syn-thase，缩写ALS)的方法，其特征在于主要包括以下顺序步骤(1)提供禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种含乙酰乳酸合成酶的的芽和胚组织为原料，与用ALS酶的底物，辅酶，稳定剂和缓冲液配制成的均匀化溶液，在常温常压下混合搅切制成组织匀浆，其中底物用丙酮酸钠，其浓度为10—30μM，原料与均匀化溶液之比为1克∶0.2—2.0ml；(2)将组织匀浆过滤，滤渣用均匀化溶液反复浸取多次，合并滤液获得粗酶；(3)粗酶滤液分两步离心分离，离心速度第二步高于第一步，获得离心酶；(4)将离心酶分两步盐析富集，每步都在低温下加入硫酸盐，饱和度为30—70％，沉淀离心30分钟，离心速度16,000—20,000转/分，获得离心酶沉淀；(5)用ALS酶的底物，辅酶，缓冲液制成酶团溶解液溶解离心酶沉淀，获得的沉淀酶溶解液可用层析法，也可用透析反透析法纯化，由此得到高纯度的纯化酶，酶团溶解液中的底物用丙酮酸钠，其浓度为1—5mM。
2.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于原料的制备是将禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种的种子在冷水中浸泡后，均匀地放在铺有潮湿细沙或锯末上放尼龙网的培养盘中，盖上纱布，在室温下发芽，刚出芽时，加盖黑布避光培养。
3.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于均匀化溶液中的辅酶是选用氯化镁，硫胺素焦磷酸(TPP)，和黄素腺嘌呤双核苷酸(FAD)，这三种辅酶的浓度分别控制在0.3—1.0mM，0.3—1.0mM，和10—50μM范围；缓冲溶液是选用磷酸氢二钾，其浓度控制在50—150mM范围；再加入10—30％的丙三醇做稳定剂。
4.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于第一步离心分离速度是6,000—8,000转/分，第二步离心分离速度是14,000—20,000转/分，每次离心时间为20分钟。
5.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于盐析富集时的硫酸盐是硫酸铵，最佳饱和度是50％，所述的低温是0—4℃，沉淀离心，离心速度16,000—20,000转/分。
6.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于酶团溶解液中的辅酶选用氯化镁，浓度为0.3—1.0mM；缓冲溶液选用磷酸氢二钾，浓度为30—100mM；丙酮酸钠浓度为1—5mM。
7.根据权利要求1所述的制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于配制的酶团溶解液可用做层析法中的淋洗液和透析法中的透析液。
全文摘要
本发明涉及乙酰乳酸合成酶(ALS)的制备，分离与纯化。从禾本，豆、苋、藜，蓼，旋花，十字花，茜草，菊，莎草，唇形，锦葵，泽泻各科植物中培养ALS酶。经实验，优化出最佳原料与均匀化溶液的比值，组成和浓度，制定了匀浆过滤，浸取，两步离心，两步盐析，层析或透析脱盐的精细技术流程。获得了最高比活值为223μm/mg·hr的ALS酶，半衰期7-8天，保存期30天，满足分子水平的离体农药筛选方法中做为生物催化剂的实用规格要求。
文档编号C12N9/00GK1119212SQ9510982
公开日1996年3月27日 申请日期1995年8月29日 优先权日1995年8月29日
发明者曹殿芳, 周家驹, 骆元章 申请人:中国科学院化工冶金研究所