专利名称：由微生物制造5-酮葡糖酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及权利要求1-7所述的用微生物生产5-酮葡糖酸的方法、权利要求8-10所述的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶基因、权利要求11所述的一种结构基因、权利要求12所述载体以及权利要求13-15所述的转化细胞。
已知细菌例如葡糖杆菌属能将葡萄糖氧化转化为葡糖酸盐并将葡糖酸盐继续转化为5-酮葡糖酸，紧接着可从培养基中获得最后得到的5-酮葡糖酸。
用微生物制造并获得5-酮葡糖酸对于抗坏血酸以及尤其是对于L-(+)-酒石酸制备有切身利益。现在可以从酒石制备L-(+)-酒石酸，酒石是一种制酒时获得的副产品。由此该酒石酸的生产要取决于是否有这种原料可供应。通常该酒石原料还掺杂有有机物质，以至于要获得酒石酸需要进行昂贵的处理。
基于上述不利之处，人们试图研制可替代的酒石酸制造方法。一种可选择的方法特别包括将微生物获得的5-酮葡糖酸转化为L-(+)-酒石酸(也可参见DE专利申请No.P4440191.4-44)。出于经济上的投资考虑，这种方法用微生物达到的5-酮葡糖酸的产率仍然是很低的所以举例来说氧化葡糖杆菌在葡萄糖上生长时不断地将其氧化为2和5-酮葡糖酸，其中按种类不同得到不同的产率对于2-酮葡糖酸生成其产率范围为4％-97％，对于5-酮葡糖酸生成其产率范围为4％-35％-均以被转变的葡萄糖为基准(Weenk，G.，Olijve，W.和Harder，W.，1984，由葡糖杆菌属种形成酮基葡糖酸，Appl.microbiol.Biotechnol.20，400-405)。借助于不同的培养条件，总可以优先形成两种酮基葡糖酸中的一种当pH值＝4，培养温度为25℃并且用CaCO3进行滴定时，可以导致大量生成5-酮葡糖酸(Stadler-Szoke，A.，Nyeste，L.和Hollo，J.，1980，关于影响醋酸杆菌形成葡糖酸和5-酮葡萄糖的因素的研究情况，Acta Aliment.9，155-172)。更高的pH值和更高的温度会促使2-酮葡糖酸形成(Ameyama，M.和Kond.，K.，1958，醋酸杆菌属种的碳水化合物代谢。Bull.Agric.Chem.Soc.Japan 22，373-379)。
本发明的任务是提供一种用微生物制造5-酮葡糖酸的方法，采用这种方法可以使5-酮葡糖酸生成的比例提高。本发明的另一项任务是制备在所述的方法中可使用的原料。
按照本发明可解决这些任务，具体地说通过提高基因拷贝数从而使能形成5-酮葡糖酸的微生物的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶基因表达提高。结果导致生成的5-酮葡糖酸所占比例提高。
为了提高基因拷贝数，可将所述葡糖酸盐-氧化还原酶基因装入一种基因构件或载体中，尤其是含有属于该葡糖酸盐-氧化还原酶基因的调节基因序列的载体，特别是可以加强基因表达的载体。接着，用含有该葡糖酸-氧化还原酶基因的基因构件转化能形成5-酮葡糖酸的微生物，特别是葡糖杆菌属或者是氧化葡糖杆菌。同时这样的生物体自然也可以作为宿主细胞。该宿主细胞没有自身的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶基因。
基因分离，克隆和转化过程按分子生物学领域内熟知的方法进行。举例来说，若从葡糖杆菌，尤其是从氧化葡糖杆菌分离基因，则基于对相应蛋白质的氨基酸序列的认识进行分离。为了将该基因克隆，使用特定的基因探针。将该基因与适用于宿主细胞的载体和表达系统连接以后，应用惯用的转化方法，导入到宿主细胞中并且在宿主中进行表达。
当应用例如葡糖杆菌属，尤其是氧化葡糖杆菌作为宿主细胞时，特别适用的转化方法是双和三亲本接合转移法。
在分离和测序之后，可以得到葡糖酸盐-氧化还原酶基因的核苷酸序列，在表1中列出了该核苷酸序列编码的氨基酸序列或者其等位变体。等位变体特别包括功能衍生物，该衍生物是从相应的序列中通过核苷酸的缺失，插入或者替代而得到的。但该衍生物仍保留了葡糖酸盐-氧化还原酶活性。相应的序列描述于表1中。
葡糖酸盐-氧化还原酶基因优选的是特别能提高基因活性的调节基因序列。因此，通过将调节基因序列进行突变，可以影响调节蛋白与待调节葡糖酸盐-氧化还原酶基因的DNA结合的效率，通过这种方式加强转录，因而提高基因表达。进一步说可将称为″加强子″的调节序列归入调节葡糖酸盐氧化还原酶基因，该调节序列通过改进RNA聚合酶和DNA之间的相互作用而同样导致基因表达提高。
通过对葡糖酸盐-氧化还原酶基因进行克隆，可以得到含有该基因的质粒或者载体，并且，如上所述，该质粒或者载体适合于转化到能形成5-酮葡糖酸的微生物中。通过转化后得到的细胞含有可复制形式的所述基因，也就是说，该基因作为染色体附加拷贝形式，和/或者作为一种质粒或者载体上的附加拷贝形式。所述转化细胞优选是葡糖杆菌，特别是氧化葡糖杆菌的转化细胞，上面所述染色体上附加拷贝形式是指通过同源重组，该基因拷贝整合到基因组上任何合适位置上。
实施例酶活性的测定在葡糖酸盐酶催化氧化为5-酮葡糖酸时，NADP+还原为NADPH并且可用光度计测量证实(Okamoto，k.1963.Enzymatic Studieson the Formationof 5-Ketogluconic Acid by AcetobacterSuboxydans，J.Biochem.53，448-452)。
产品测定采用HPLC对葡糖酸盐和5-酮葡糖酸进行定量分析(R.Klasen等人，1992，氧化葡糖杆菌没有能力产生酒石酸，Biotechnol.Bioeng.40183-186)。
葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶的提纯阴离子交换器将氧化葡糖杆菌的不含细胞提取物上样到并固定到一个阴离子交换器(DEAE-Tentakel，Merck Darmstadt；5 15cm)上。用逐渐增加的NaCl梯度(0-500mM)在350mMNaCl处将该酶洗脱，将活性组分合并并用超滤装置(Amicon；截止分子量10KDa)进行渗透。
染色亲和层析将渗透过的酶溶液上样并固定到一个染色亲和柱上(蓝琼脂糖CL-6BTM，2，6 20cm(T.Atkinson等人，1981，Triazine-dye affinitychromatography，Bio-chem.Soc.Trans.910-13)。用逐渐增高的NaCl梯度(0-500mM)在300mM NaCl处将该酶洗脱。将活性组分合并用一个超滤装置(Amincon；截止分子量10KDa)在25mM组氨酸/HCl缓冲液pH5.6中渗透。
色谱调焦(Chromatofokussierung)I.将渗透过的酶溶液上样到用25mM组氨酸/HCl缓冲液pH5.6平衡过的Mono-PTM-层析柱(Pharmacia，Freiburg；0.5×20cm)。应用50ml Polypuffer PB74(Pharmacia，Freiburg)pH4.0到柱上来调节pH梯度并用此从柱上洗脱蛋白质。
凝胶过滤将合并的活性组分施加到一个凝胶过滤柱(Sephaeryl-S100HR，Pharmacia，Freiburg；2.6×100cm)上。以同样方式进行洗脱。将活性组分进行合并并用一个起滤装置(Amicon；截止分子量10KDa)在2.5mM乙酸盐/NaOH缓冲液pH4.8中渗透。
色谱调焦(Chromatofokussierung)II蛋白质溶液加样到一个用25mM乙酸盐/NaOH缓冲液pH4.8平衡过的Mono-PTM-层析柱(Pharmacia，Freiburg；0.5×20cm)。应用50ml的PolypufferPB74(Pharmacia，Freiburg)pH 4.0到柱上，调节pH梯度，并洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE电泳检测纯度之后，将纯化的蛋白质等分成样品，在液氮中冷冻并置于-70℃贮存。
对氨基末端进行测序为了测定氨基末端的氨基酸序列，将100ug纯化的蛋白质转移到PVDF膜上并用一个气相测序仪(Appl.Biosystems，model 470A)进行检测(P.Edman等人，1967.一种蛋白质测序仪，Eur.J.Biochem.180-91)。采用HPLC方法可以显示被分裂出的氨基酸衍生物(苯海硫因)。
基因探针的制备如果没有特别提到，则根据T.Maniatis等人(1989，MolecularCloningALaboratory manual第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold SpringHarbor，N.Y)完成所有分子生物学工作。通过Edman测序分析，检测出了葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶的2-18个氨基酸(
图1A)。在将蛋白质序列转译为相应的核苷酸序列之后，考虑到遗传密码的向并性，得到了高度简并的DNA序列。为了构建一个gno-基因探针，合成符合所要探测肽序列末端的PCR引物(图IB)。对该引物的5′末端用EcoRI和SacI酶进行限制性切割，以便后面进行克隆时有较高的选择性。在将引物分离之后，利用该引物，以氧化葡糖杆菌的纯化染色体DNA(Y.Takeda等人，1991.CloningandSeguencing of the Gene Encoding Cytochrome C-553(CO)fromGluconobactor oxydans.J.Ferment.Bioeng.721-6)作为模板进行RCR反应(S.J.Gould等人，1989。Use of the polymerasechain reaction forhomology probingIsolation of partialCDNA or genomic clones encodingthe iron-sulfur proteinof succinate dehydrogenase from severalspecies.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861934-1938)。在制备性4％的琼脂糖凝胶电泳之后分离出一个66bp片段并用限制性核酸内切酶EcoRI和SacI切割。将此制备好的片段与相应酶切割的质粒puc19连接之后克隆到大肠杆菌中。对该66bp PCR片段进行测序，以便探查出没有简并的编码该蛋白质的氨基末端区域的DNA序列。该DNA序列可以翻译出其含有的肽序列(图1C)。从该定序了的PCR片段上探查出一个区域，该区域长度为45bp，符合氧化葡糖杆菌的GC含量(60-65％，J.de ley等人，1970.The Status of thegeneric name Gluconobacter.Int.J.Syst.Bact.2083-95)。该序列可用作为合成gno-基因探针的模板(图1D)。
gno基因限制性图谱的建立基于现有的PCR实验经验，构建一个gno-基因探针并且在用异羟基毛地黄毒苷元标记之后(G.G.Schmitz等人，1991，用末端转移酶处理尾部后用半抗原异羟基毛地黄毒苷对寡核苷酸进行体外非放射性标记，Anal.Biochem.192222-231)用于进行Southern印迹试验(E.M.Southern，1975.对凝胶电泳分离的DNA片段中检测特异性片段，J.Mol.Biol.8503-517)。同时将氧化葡糖杆菌的染色体DNA用限制性内切核酸酶的不同组合进行切割并且在通过琼脂糖凝胶电泳将限制性切割后各组分分离之后转移到尼龙膜上。在用基因探针杂交之后，当时的每个组分显示清晰信号。计算杂交片段的大小之后测定了限制性图谱(图1E)。
gno-基因的克隆在制造出了氧化葡糖杆菌的基因库的一部分之后，借助于菌落杂交将一个3.4Kb BamHI片段进行克隆，该片段携带整个gno基因(M.Grunstein等人，1975.菌落杂交分离含有特定基因的克隆DNA的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965)。
对gno基因测序对染色体区域上有关gno-基因进行序列测定(F.Sanger等人，1977.用链终止抑制剂进行DNA序列测定.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)产生一个1510bp的核苷酸序列，其中包含一个771bp的开放阅读框架，该开放阅读框架编码一个分子量为27,300的具有257个氨基酸的多肽(表1)。该核苷酸序列在起始密码子前面有10bp的一个核糖体结合位点(J.Shine等人，1974，大肠杆菌16s核糖体RNA的3′-末端序列与无意义模板和核糖体结合位点互补。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711342-1346)以及在终止密码子之后有160bp的终止子型回文结构(M.Rosenberg等人，1979，与RNA转录的启动和终止相关的调节序列。Annu.Rev.Genet.13319-353)。基于推导出的氨基酸序列，产生了由蛋白质测序方法获得的肽序列。
gno基因在氧化葡糖杆菌中的表达选择RSF1010质粒的衍生物作为适用于氧化葡糖杆菌的载体DNA，因为该质粒的复制子可以保证在广谱革兰氏阴性细菌中进行DNA复制(U.B.Priefer等人，1985，通过引入RSF1010复制和移动功能扩大了大肠杆菌的宿主范围，J.Bacteriol.163324-330)。应用PRS201PR质粒为基础，继续研究在氧化葡糖杆菌中的基因转移(R.Schroder等人，1991，利用具广谱宿主范围的载体在Acetobacter methanolicus中表达乙肝病毒(HBV)的核心抗原，Appl.Microbiol.Biotechnol.35631-637)。采用接合方式实现质粒转移(C.Condon等人，1991，在氧化葡糖杆菌种，弱氧化葡糖杆菌中接合以及异源基因的表达。FEMS Microbiol.Lett.80173-178)。该PRS201PR质粒除启动子外还含有编码CI-抑制子的温度敏感型衍生物(CI857)的基因，该衍生物调节该启动子。为了使启动子不受调节，将PRS201PR质粒的CI857抑制子的一部分消除(PRS201P)。将编码该葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶的一个1.25Kb Bam HI/Sal I片段与经过相同限制性切割的PRS201PR和PRS201P相连接。通过接合将质粒PRS201PR-gno和PRS201P-gno转移到氧化葡糖杆菌中。活性检测结果显示在重组氧化葡糖杆菌菌株中葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶活性提高了6.5至8.5倍(表2)。
重组菌株生产5-酮葡糖酸的能力为了测定重组氧化葡糖杆菌的5-酮葡糖酸生产能力，检测出在发酵培养基中积累的5-酮葡糖酸(U.Kotera等人，1972，5-酮葡糖酸新氧化产物的分离和化学结构，以及通过该新化合物从葡萄糖至酒石酸的假设途径，Agric.Biol.Chem.361315-1325)。为了测定分析代谢产物每天取出样品并且采用HPLC检测法进行定量检测。与具有野生型的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶活性的菌株(氧化葡糖杆菌野生型，氧化葡糖杆菌PRS201P)相比，由于gno基因的超过量表达(氧化葡糖杆菌PRS201P-gno)，5-酮葡糖酸的形成提高了11％(表3)。
表1编码氧化葡糖杆菌的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶的基因的核苷酸序列。底下划线部分为可能的核糖体结合位点，箭头所指部分标明潜在的终止子。核苷酸序列下面对应的为蛋白质的氨基酸序列。已经被定序的氨基末端肽序列底下也划了线。重要的限制性切割位点用粗体印刷。
10 30 50TCACACCCAGATCTCAAAAATCACAGACGGGACACGAGAAAAGACATACCCGAAGTCCACCTAACGTTT70 90 110 130GTTCGCAATGAAATATCACATTTCAACAACACAAACTCTCGTTATCGATGTTACATATAACCTTCATGC150 170 190TGTCCAGAAGCGGGCGGGAAGTTTTTCTGACAAAACTTGATTGCCCGTCTGAGAGCACGCGATGCGCAC210 230 250 270GCGGACTTGTGGATCCCTGGCGGGTTTAGGCTGCTAGGAAGAACAGAACCGTGATTTTGAAGGCTGACABamHI290 310 330GATATGTCCCATCCCGATCTTTTTTCTCTCTCCGGTGCGCGCGCCCTTGTGACCGGGGCGTCACGGGGAM S H P D L F S L S G A R A L V T G A S R G350 370 390 410ATTGGCCTGACGCTGGCAAAGGGGCTTGCGCGCTACGGGGCTGAGGTTGTCCTGAATGGCCGGAATGCTI G L T L A K G L A R Y G A E V V L N G R N A430 450 470GAAAGTCTGGACTCTGCGCAGTCCGGGTTCGAGGCGGAAGGATTGAAAGCCAGTACGGCGGTTTTCGATE S L D S A Q S G F E A E G L K A S T A V F D490 510 530 550GTGACGGATCAGGATGCGGTGATTGATGGCGTCGCGGCGATTGAGCGGGACATGGGACCGATCGATATCV T D Q D A V I D G V A A I E R D M G P I D I570 590 610CTGATCAATAATGCCGGGATACAGCGCCGAGCGCCTCTGGAGGAGTTTTCGCGCAAGGACTGGGATGATL I N N A G I Q R R A P L E E F S R K D W D D630 650 670 690CTGATGTCAACCAATGTCAACGCGGTTTTCTTCGTCGGGCAGGCGGTGGCGCGGCACATGATTCCCCGCL M S T N V N A V F F V G Q A V A R H M I P R710 730 750GGACGGGGCAAGATCGTCAATATCTGTTCCGTCCAGAGTGAACTCGCCCGTCCGGGAATTGCGCCCTATG R G K I V N I C S V Q S E L A R P G I A P Y770 790 810 -ACGGCGACCAAGGGAGCGGTCAAAAACCTGACAAAAGGTATGGCGACGGACTGGGGCAGGCACGGACTTT A T K G A V K N L T K G M A T D W G R H G L830850 870 890CAGATCAACGGGCTGGCACCGGGGTATTTTGCGACGGAAATGACAGAAAGGCTCGTGGCGGACGAAGAAQ I N G L A P G Y F A T E M T E R L V A D E E910 930 950TTCACGGACTGGCTGTGCAAACGGACGCCGGCAGGACGGTGGGGGCAGGTTGAGGAACTGGTCGGAGCAF T D W L C K R T P A G R W G Q V E E L V G A
970 39010101030GCAGTATTTCTGTCTTCCCGGGCTTCAAGCTTCGTCAACGGGCAGGTGCTGATGGTTGATGGCGGGATAA V F L S S R A S S F V N G Q V L M V D G G I105010701090ACCGTATCGCTGTAGCCTTTCTGCAGGTGACTCTGTTTCAATTTATCAGAACTGTGTTAGGGGGCATTGT V S L ·1110113011501170TCTGTCGGGTTTGTGATGGAATGGTTTTCGATAAGATGGCTTCTTATGTCGGGATGCCACAGGAAAGTT119012101230GACATTTGATGAGCTCCATCTTTGCCATCTCGCTTGCGACCGCGGCCATTGCGGCGGTTGTCATTCTTA←————————→1250127012901310TCGCCCGGTTCCGGATCAACCCGTTCATCGTCCTTTTTTCCGTCTCGATCCTGCTGGCCCTCGTTGCGG133013501370GTATGCCGGCTGACAAGGTCGTGGGGTCGTTCGAGGCGGGGGCAGGGCATGTGCTGGGGCATGTCGGAA139014101430CTGTCATCGCGCTTGGCACAATGCTTGGGAAAATGCTGGCGGAGTCCGGTGGCGCCGATCGTATCGTCC1450 147014901510TGACGATCTGCACCCTGTCGGGTCGTCGGATATGTCGACGTACGGACTCGAATTCGTAATCATSalI表2在PRS201PR-gno和PRS201P-gno质粒中的λ启动子控制之下gno基因在氧化葡糖杆菌DSM3503中的表达以及得到的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶活性。在30℃培养20小时之后检测酶活性。菌株 酶活性[U/mg]氧化葡糖杆菌 0.08氧化葡糖杆菌PRS201PR0.08氧化葡糖杆菌PRS201P0.08氧化葡糖杆菌PRS201PR-gno 0.52氧化葡糖杆菌PRS201P-gno 6.80
表3采用重组氧化葡糖杆菌菌株将葡萄糖转变为5-酮葡糖酸。培养是在含有10％(W/V)葡萄糖的基本培养基中完成的。菌株 时间[d]5-酮葡糖酸[mM]氧化葡糖杆菌野生型1 152 563 71氧化葡糖杆菌PRS201P1 122 583 69氧化葡糖杆菌PRS201P-gno 1 192 663 79图1来自氧化葡糖杆菌的葡糖酸盐NADP+5-氧化还原酶的氨基末端序列，PCR引物以及gno基因探针。A蛋白质氨基末端的氨基酸序列。BPCR引物的序列。CPCR产物的核苷酸序列。D所使用的基因探针的序列。E染色体区上有关gno基因的限制性图谱。
权利要求
1.用微生物制造5-酮葡糖酸的方法，其中包括提高一种形成5-酮葡糖酸的微生物中的葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶基因表达。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，通过提高葡糖酸盐-氧化还原酶基因拷贝数来提高葡糖酸盐-氧化还原酶基因表达。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，为了提高基因拷贝数，将葡糖酸盐-氧化还原酶基因装入一个基因构件中。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，将葡糖酸盐-氧化还原酶基因装入一个基因构件中，该基因构件含有归属于葡糖酸盐氧化还原酶基因的调节基因序列。
5.根据权利要求3或4的所述方法，其特征在于，用含有葡糖酸盐-氧化还原酶基因的基因构件转化能形成5-酮葡糖酸的微生物。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，用含有葡糖酸盐氧化还原酶基因的基因构件转化葡糖杆菌，尤其是氧化葡糖杆菌。
7.根据前面权利要求任一项所述方法，其特征在于，葡糖酸盐-氧化还原酶基因是从葡糖杆菌，尤其是氧化葡糖杆菌中分离的。
8.一种葡糖酸盐NADP+-5-氧化还原酶基因，它具有编码表1所示氨基酸序列以及其等位变异体的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述葡糖酸盐-氧化还原酶基因，具有表1所述核苷酸序列或者实质上有相同功能的DNA序列。
10.根据权利要求8或9所述葡糖酸盐-氧化还原酶基因，它具有属于此类的调节基因序列。
11.结构基因，含有权利要求8-10之一所述葡糖酸盐氧化还原酶基因。
12.载体，含有权利要求8-10之一所述的葡糖酸盐氧化还原酶基因或者权利要求11所述的结构基因。
13.转化细胞，含有可复制形式的权利要求8-10之一所述的葡糖酸盐-氧化还原酶基因或者权利要求11所述的结构基因。
14.根据权利要求13所述转化细胞，包含有权利要求12所述载体。
15.根据权利要求13或者14所述转化细胞，其特征在于，它是葡糖杆菌，优选是氧化葡糖杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种由微生物制造5-酮葡糖酸的方法。5-酮葡糖酸对于抗坏血酸和L-(+)-酒石酸的生产具有特殊意义。传统方法是由酒石制造L-(+)-酒石酸，结果由于酒石被有机物质污染而需要价格昂贵的纯化方法。因而本发明提供了5-酮葡糖酸的细菌制造方法，采用该方法将提高能形成5-酮葡糖酸的微生物的葡糖酸盐NADP
文档编号C12P7/40GK1138631SQ96105580
公开日1996年12月25日 申请日期1996年2月7日 优先权日1995年2月7日
发明者R·克拉森, S·布林格-迈耶, H·萨姆, C·P·霍伦伯格 申请人:莱因新生物技术工艺和产品公司